facebook

Alergeni–testul de degranulare a bazofilelor (BDT)

Trimite pe e-mail acest articol
Printeaza acest articol

Informaţii generale

Progresul tehnologic a furnizat laboratoarelor instrumente noi de cuantificare a anticorpilor IgE alergen-specifici atât în ser cât şi pe suprafaţa bazofilelor.

Alături de determinarea în ser de IgE alergen-specifice prin metode automate standardizate au fost  dezvoltate şi teste funcţionale care mimează in vitro contactul dintre alergeni şi celulele responsabile de apariţia simptomelor alergice şi care pun astfel în evidenţa sensibilizarea de tip imediat. Printre acestea se numără şi testul de degranulare a bazofilelor (BDT) cu măsurarea sulfidoleucotrienelor eliberate.

Până nu demult s-a considerat ca bazofilele, care reprezintă doar un procent de 0.5% din totalul leucocitelor din sângele periferic, sunt doar forme circulante ale mastocitelor cu semnificaţie minoră. Date recente indică însă faptul că bazofilele sunt clinic relevante şi deţin alături de mastocite un rol esenţial în răspunsul alergic de tip imediat. Prima orientare către studii funcţionale ale bazofilelor a fost testul de eliberare a histaminei, însă beneficiul său clinic a fost controversat datorită sensibilităţii şi specificităţii reduse.

Testul efectuat în laboratorul nostru are o sensibilitate ridicată şi, spre deosebire de măsurarea IgE specifice în ser, determină şi anticorpii IgE specifici legaţi de bazofile.

Mai mult, ca test clasic de “provocare”, BDT reprezintă singurul instrument diagnostic in vitro pentru studierea unui număr mare de reacţii adverse la aditivi alimentari şi medicamente (anestezice, antiiflamatoare nesteroidiene, antibiotice) care nu sunt IgE mediate (aşa-zisele pseudo-alergii în care se produce cel mai adesea o degranulare celulară directă).

Avantajul este ca la BDT nu intervin mediatori preformaţi ca în cazul testului de eliberare a histaminei; în cazul existenţei unei sensibilizări, leucotrienele sunt sintetizate abia după contactul cu alergenul. De asemenea testul nu este alterat printr-o eliberare toxică a mediatorilor preformaţi3;4;5.

Reacţii adverse la aditivi alimentari

Aditivii sunt substanţe adăugate alimentelor sau preparatelor farmaceutice în scopuri multiple, vizând:

  • conferirea unor calităţi gustative (edulcorante, aromatizante, excitante şi/sau secretorii);
  • conservarea pe termen lung (antioxidanţi, antibacteriene).

Numeroşi aditivi au fost incriminaţi în producerea unei palete largi de reacţii adverse, de la letargie până la astm sever şi anafilaxie. Următoarele substanţe au fost în mod extensiv analizate: coloranţi sintetici, sulfiţi, monosodium glutamat (MSG), aspartam şi benzoaţi. Astfel, un studiu recent efectuat în Germania a estimat o prevalenţă a reacţiilor adverse la aditivi alimentari de 0.18%.

Unii aditivi alimentari sau farmaceutici au fost implicaţi în producerea astmului profesional, urticariei cronice sau dermatitei atopice. Cu toate acestea, multe din aceste reacţii nu au fost confirmate prin proceduri diagnostice adecvate. Acest lucru se datorează faptului că aditivii sunt în general molecule mici care determină manifestări clinice similare alergiei de tip imediat însă prin mecanisme non-IgE, cum ar activarea sistemului complementului şi eliberarea directă a histaminei şi leucotrienelor din leucocite (vezi figura).

BDT reprezintă un instrument preţios pentru diagnosticul pseudo-alergiilor la aditivi alimentari.

Fig 17.4.1 Pseudo-alergia la aditivi alimentari

În tabelul de mai jos sunt menţionaţi coloranţii şi aditivii alimentari pentru care sunt disponibile testele BDT, sursele care le conţin, precum şi principalele manifestări clinice induse de aceştia2;6:

Denumire aditivSurse Manifestari clinice
Tartrazina (E102)Colorant galben azoic folosit la sucuri de fructe, prăjituri, bomboane, medicamenteCauza rară de urticarie cronică şi angioedem
Galben-orange (E110; Sunset yellow)Colorant galben-portocaliu azoic folosit la prăjituri, bomboane, sosuri de branză, supe la plic, gemuri de caise, jeleuri, praf de budincăFoarte rar urticarie, angioedem, bronhoconstricţie
Eritrozina (E127)Colorant roşu de sinteză al prăjiturilor şi bomboanelor; conţine iodFactor agravant în rinita persistentă
Azorubina (E122)Colorant roşu alimentar azoicImplicare ocazională în urticarie, angioedem, dermatita atopică, astm
Albastru patent (E121)Colorant albastru sintetic pentru dulciuriImplicare ocazională în urticarie, angioedem, dermatita atopică, astm
Negru briliant (E151)Colorant negru alimentar azoic (bomboane cu aromă de eucalipt)Factor agravant pentru astm
Rosu “ponceau” (E124)Colorant roşu azoic folosit la prepararea pudrelor pentru budinci cu gust de căpşuniImplicare ocazională în urticarie, angioedem, dermatita atopică, astm
Amarant (E123)Colorant roşu purpuriu azoic folosit la prepararea vinurilor şi băuturilor răcoritoare, cremelor de fructe şi icrelor artificiale.Implicare ocazională în urticarie, angioedem, dermatita atopică, astm
Galben chinolin (E104)Colorant galben sintetic non-azoic folosit la prepararea jeleurilor, medicamentelorImplicare ocazională în urticarie, angioedem, dermatita atopică, astm
Indigocarmin (E132)Colorant albastru folosit la prepararea medicamentelor (capsule cu eliberare prelungită)Implicare ocazională în urticarie, angioedem, dermatita atopică, astm
Metabisulfit de potasiu (E224)Conservant artificial pentru vinuri, fructe, legume, creveţi; agent de albire; aditiv pentru medicamenteRol stabilit în producerea bronhospasmului acut şi astmului sever; implicare limitată în urticarie, angioedem, reacţii anafilactoide
Acid benzoic (benzoat de sodiu) E211Conservant, bacteriostatic şi fungistatic în condiţii de aciditate, folosit la murături, sucuri de legume şi fructe; mai poate fi utilizat în siropuri de tuseUrticarie cronică, angioedem, rinită persistentă, reacţii anafilactoide
p-Hidroxibenzoat de propil (E216)Esterul etil sintetic al acidului benzoic folosit drept conservantUrticarie cronică, angioedem, rinită persistentă, reacţii anafilactoide
Nitrit de sodiu (E250)Conservant şi antibacterian al produselor din carne (culoare roz), branzeturilor, heringilorPosibila implicare în urticaria cronică şi reacţii anafilactoide
Salicilat de sodiuConservant alimentarBronhoconstricţie
Oxid roşu, galben şi negru de fier (E172)Colorant de suprafaţă (în capsulele cu medicamente)
Glutamat (E621)Potenţiator de aromăSindromul „restaurantului chinezesc”: palpitaţii, cefalee, greaţă, dureri toracice, parestezii şi senzaţie de slăbiciune, ameţeli; poate induce bronhospasm la astmatici; poate fi implicat în rinita persistentă

 În cazul suspiciunii de intoleranţă la aditivi alimentari (conservanţi, antioxidanţi, coloranţi) se recomandă screening-ul pe 4 grupe de teste:

Amestec coloranţi alimentari I: amarant, azorubin, galben chinolin, roşu „ponceau”, galben-orange.
Amestec coloranţi alimentari II: eritrozina, albastru patent, indigocarmin, negru brilliant.
Amestec aditivi alimentari I: tartrazina, benzoat de sodiu, nitrit de sodiu, metabisulfit-K, salicilat de sodiu.
Amestec aditivi alimentari II: oxid de fier, acid benzoic, glutamat, hidroxibenzoat de propel.
Dacă se obţine un rezultat pozitiv pentru unul dintre amestecuri, este posibilă testarea individuală a a substanţelor, dar după o nouă recoltare3.

Reacţii pseudo-alergice la medicamente

Sindroamele induse de medicamente care sunt sugestive pentru o reacţie alergică de tip imediat, dar la care nu poate fi demonstrat un mecanism imunologic sunt denumite reacţii de hipersensibilizare non-alergică sau pseudo-alergii medicamentoase. Acestea constituie un subset de reacţii idiosincratice care trebuie diferenţiate clinic de reacţiile imunologice (alergice) – vezi tabelul 17.4.2

Reacţii imunologice (alergice)Reacţii idiosincratice (pseudo-alergice)
Anafilaxie după antibiotice beta-lactamiceSoc după substanţe radiologice de contrast
Hepatita indusă de halotanAstmul indus de aspirină
Hipotensiunea după protaminăUrticaria asociată cu opiacee
Dermatita indusă de sulfonamideHipertensiunea pulmonară indusă de protamină
Boala serului produsă de fenitoin sau cefaclorUrticaria asociată cu antiinflamatoare nesteroidiene
Hipotensiunea după succinil-colinaAnemia hemolitică datorată colinei
Trombocitopenia indusă de chininăSincopa după anestezice locale
Erupţie medicamentoasă fixă indusă de fenolftaleinaEritemul din cursul infuziei cu vancomicină
Urticaria asociată cu cisplatinReacţiile acute induse de ciprofloxacină

 Tabel 17.4.2 Exemple obişnuite de hipersensibilitate la medicamente

Majoritatea reacţiilor pseudo-alergice implică aceeaşi cale finală comună ca şi reacţiile de tip I; în aceste cazuri (reacţiile după substanţe radiologice de contrast, astmul indus de aspirină, urticaria asociată cu opiacee) bazofilele şi mastocitele sunt activate prin mecanisme non-imunologice cu eliberarea de mediatori vasoactivi.

Multe dintre reacţiile adverse atribuite substanţelor de contrast se datorează hipertonicităţii acestora care facilitează eliberarea de histamină din mastocite şi bazofile. Substanţele mai noi, care nu conţin iod, au un potenţial mai redus de pseudo-alergii, dar pot asocia şi acestea reacţii severe, uneori mediate IgE.

Aspirina şi celelalte AINS înrudite pot fi implicate în două sindroame de hipersensibilitate non-alergică:

  • astmul indus de aspirină: rinosinuzita eozinofilică cronică cu polipoză nazală şi astm persistent;
  • urticarie/angioedem declanşate de aspirină.

Aceste reacţii acute non-alergice sunt iniţiate ca urmare a inhibiţiei ciclooxigenazei-1 de către AINS. Ambele sindroame se caracterizează la nivel biochimic prin alterări profunde ale biosintezei eicosanoizilor, predominant prin producţia excesivă de cisteinil-leucotriene şi trebuie să fie net diferenţiate de alte reacţii adverse la AINS prin mecanism alergic. Reacţiile alergice se produc de obicei la un singur medicament antiinflamator sau la cateva medicamente cu structură chimică similară.

Reacţiile pseudo-alergice la anestezice locale sunt întâlnite mai ales în practica stomatologică. Cele mai alarmante sunt episoadele de sincopă vaso-vagala care pot mima anafilaxia. Paresteziile şi ameţelile pot fi explicate pe baza toxicităţii farmacologice a preparatelor, iar simptomele sunt mai frecvente la pacienţii cu intoleranţă la medicamente1.

Având în vedere mecanismele menţionate, testul BDT poate avea un rol important în depistarea reacţiilor pseudo-alergice la medicamente. In laborator este disponibilă o paletă de alergeni standard care poate fi pusă în contact cu bazofilele pacientului:

Antibiotice

Amoxicilina

Ampicilina

Cefazolim

Cefuroxim

 Ciprofloxacin

Claritromicina

Penicilina G

Penicilina V

Rifampicina

Sulmetoxazol

Trimetropim

Tetraciclina

Analgezice

Aspirina/Acid acetilsalicilic

Diclofenac

Ibuprofen

Acid mefenamic

Metamizol

Paracetamol

Fenilbutazona

Propifenazon

Anestezice

Lidocaina

Mepivacaina

Articaina

Prilocaina

Ubistezina

Blocanţi musculari

Atracurium

Mivacurium

Pancuronium

Propofol

Rocuromium

Suxametoniu

Vecuronium

La acestea se adaugă posibilitatea de a trimite o tabletă sau o fiolă dint-un medicament pentru a fi testat3.

Recomandări pentru efectuarea testului BDT

1. Evidenţierea unei sensibilizări de tip I în următoarele situaţii clinice:

  • imposibilitatea efectuării unui test cutanat datorită pericolului unei reacţii anafilactice;
  • în cazul suspiciunii clinice de alergie de tip imediat, deşi Ig E specifice şi testul cutanat sunt negative.

BDT este în special util pentru următorii alergeni:

   – venin de albină şi viespe;
   – praf de casă;
   – păr/epitelii de câine şi pisică;
   – latex, formaldehida şi alte chimicale;
   – alfa-amilaza (care induce astmul brutarilor!);
   – acrilaţi utilizaţi în stomatologie.

Mai jos sunt menţionaţi toţi alergenii pentru care poate fi efectuat BDT în laboratorul nostru (cu excepţia medicamentelor şi a aditivilor alimentari):

 Praf şi acarieni

Dermatophagoides pteronyssinus d1
Dermatophagoides farinae d2
Acarus siro d70
Amestec de acarieni (Dermatophagoides pteronyssinus d1, Dermatophagoides farinae d2)
Amestec de acarieni (Acarus siro d70, Glycophagus domesticus d73, Lepidoglyphus destructor d71, Tyrophagus putreus d72)

Fungi

Alternaria alternata
Aspergillus fumigatus
Cladosporum herbarum
Penicillium notatum
Rhizopus nigricans
Trichophyton mentagrophytes
Stachybotris spp.
Candida albicans
Botrytis cinerea
Fungi amestec (Penicillium notatum m1, Cladosporium herbarum m2, Aspergillus fumigatus m3, Candida albicans m5, Alternaria alternata m6)

Insecte şi paraziţi

Venin albina i1
Venin viespe i3
Polistes spp. (viespe de hartie) i4
Vespa crabro (viespe europeana) i75
Anisakis

Materiale dentare                                                                          Alergeni profesionali

Metil metacrilat (MMA)                                                                        Alfa-amilaza (astmul brutarilor)
2-Hidroxietil metacrilat (HEMA)                                                        Diclofluanid
TEG-DMA                                                                                                 Formaldehida
Bisfenol A                                                                                                  Latex
Metacrilat de 1,4 butandiol (BDMA)                                                   Lindan
N,N-dimetil-4-toluidina                                                                         Permetrin
BIS-GMA                                                                                                   Anhidrida acidului ftalic
Dimetilacrilat cu rasina diuretanica                                                    Pentaclorfenol (PCP)
Etilenglicol dimetilacrilat                                                                      Tris-2-cloretil fosfat (TCEP)
Endometazona                                                                                         Tris-2-butoxiletil fosfat (TBEP)
Gutaperca                                                                                                  BTX (benzen, toluen, xileni, etilbenzen)
Camforchinona                                                                                         Clorpirifos
                                                                                                                     PCB (Bifenili policlorurati)
                                                                                                                     Amestec – PAK

Alimente

Alac                                                                            Carne de porc                                           Crab
Asbus de ou                                                              Carne de pui                                             Crap
Alfa-lactalbumina                                                   Carne de rata                                            Creveti
Alune                                                                         Carne de vita                                             Drojdie
Ananas                                                                      Cartof                                                          Fistic
Arahide                                                                     Cazeina                                                       Galbenus de ou
Ardei                                                                         Capsuni                                                       Gluten
Avocado                                                                   Ceai negru                                                   Grapefruit
Beta-lactoglobulina                                               Ceapa                                                           Grau
Caracatita                                                                Ciocolata                                                     Halibut (cambula)
Carne de curcan                                                     Cod                                                               Hamei
Carne de gasca                                                        Conopida                                                    Homar
Carne de oaie                                                          Coriandru                                                   Kiwi
Lapte de vaca                                                          Orez                                                             Secara
Langusta                                                                  Orz                                                               Soia
Lamaie                                                                     Ovaz                                                             Somon
Limba de mare                                                       Pastrav                                                        Spanac
Mandarina                                                              Para                                                              Sparanghel
Mazare                                                                     Pelinita                                                        Stridii
Mar                                                                           Piersica                                                        Struguri
Migdale                                                                    Piper negru                                                 Susan
Morcov                                                                     Portocala                                                     Telini
Nuca                                                                         Porumb                                                        Tipar
Nuca de Brazilia                                                     Rosie                                                            Usturoi
Nuci cashew                                                            Scortisoara                                                  Vanilie

Polen graminee

Cynodon dactylon g2 (pir gros)
Dactylis glomerata g3 (golomat)
Lolium perenne g5 (iarba de gazon)
Polen Phleum pratense g6 (timoftica)
Secale cereale g12 (secara)
Polen graminee amestec (Dactylis glomerata g3, Lolium perenne g5, Polen Phleum pratense g6, Festuca elatior g4, Poa pratensis g8, Holcus lanatus g13)

Polen ierburi

Polen Artemisia vulgaris w6 (pelin)
Ambrosia elatior w1
Plantago lanceolata w9 (patlagina ingusta)
Parietaria officinalis w19 (parachernita)
Amestec ambrozie (Ambrosia elatior w1, Ambrosia psilostachya w2,  Ambrosia trifida w3)

Polen arbori

Alnus incana t2 (arin alb)
Polen Betulla verrucosa t3 (mesteacan)
Corylus avellana t4 (alun)
Quercus alba t7 (stejar alb)
Olea europaea (maslin)

2. Evidenţierea pseudo-alergiilor la aditivi şi coloranţi alimentari

– se testeaza 18 E-uri în 4 grupe sau, la cerere, în mod individual

3. Evidenţierea reacţiilor pseudo-alergice la medicamente

– pe lângă alergenii standard pot fi testate şi preparate native (tablete sau fiole trimise de medici/pacienţi)3

Avantajele testului BDT

  • test de provocare in vitro cu relevanţă clinică mare;
  • detecteaza IgE alergen-specifice legate de celule, precum şi degranularea directă prin mecanisme non-IgE;
  • nu este influenţat de eventuala prezenţă a anticorpilor IgG alergen-specifici, care interferă cu determinarea de IgE specifice faţă de anumite medicamente şi alergeni alimentari;
  • pot fi folosiţi şi alergeni nativi.

Menţiune: performanţa testului este similară cu cea a testului de activare a bazofilelor cu determinarea prin citrometrie în flux a markerului de degranulare CD633.

Pregătire pacient – se va evita administrarea de inhibitori ai degranulării mastocitare cât şi corticoterapia cu 2-3 săptămâni înaintea recoltării probei3.

Specimen recoltat – sânge venos3. 

Recipient de recoltare – vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant3.

Volum probă – cate 2 mL sânge pentru fiecare alergen3.

Stabilitate probă – sângele trebuie să ajunga în maxim 24 ore la laboratorul la care se efectuează testul şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată refrigerarea probei3.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depăşit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate3.

Metodă
Testul nostru constituie o dezvoltare a testului folosit anterior – CAST (Cellular Antigen Stimulation Test); îmbunătăţirea constă în concentrarea granulocitelor bazofile din proba înaintea adăugării alergenului.

Analiza presupune următoarele etape (vezi figura 17.4.2):

1. izolarea granulocitelor bazofile din sânge recoltat pe EDTA;
2. stimularea cu extractele alergenice respective;
3. măsurarea, în cazul sensibilizării, a mediatorilor asociaţi histaminei (leucotriene).

După separarea prin centrifugare in gradient de densitate Ficoll, se adaugă interleukina-3 (IL-3) care creşte exprimarea de receptori pe suprafaţa bazofilelor şi facilitează astfel eliberarea crescută de mediatori.

Pentru stimularea bazofilelor se pot folosi extracte de alergeni, alergeni recombinaţi sau alergeni nativi din preparatele furnizate de pacienţi care nu prezintă toxicitate celulară. In plus faţă de alergeni, bazofilele pacientului sunt incubate cu 2 controale:

  • anticorpi monoclonali anti-IgE umane (controlul pozitiv) care leagă anticorpii IgE de pe suprafaţa bazofilelor şi activează eliberarea de mediatori;
  • o soluţie tampon (controlul negativ) pentru estimarea eliberării bazale spontane de mediatori.

După incubare celulele sunt centrifugate, iar leucotrienele eliberate în urma stimulării bazofilelor se cuantifică printr-o tehnică ELISA în supernatantul rezultat. Nivelul net de mediatori eliberaţi este calculat apoi prin scăderea cantităţii de leucotriene eliberate spontan din nivelul de mediatori indus de alergeni sau de controlul pozitiv. Rezultatul se exprimă în pg/mL3;5.

Interpretarea rezultatelor

1. Rezultat negativ

< 200 pg/mL leucotriene după stimulare cu alergeni = nu există sensibilizare de tip imediat faţă de preparatele testate.

2. Rezultat pozitiv

>200 pg/mL leucotriene după stimulare cu alergeni = sensibilizare de tip I sau pseudo-alergie.

3. Rezultat neconcludent

Apare în situaţia în care nu s-au obţinut criteriile de validare fie a controlului pozitiv (răspuns inadecvat <200 pg/mL leucotriene după stimulare cu anti-IgE), fie ale controlului negativ (nivel bazal crescut al eliberării de mediatori). In condiţiile în care recoltarea şi transportul probei s-au efectuat în condiţii adecvate, lipsa de validare a testului se poate datora:

       – tratamentului cu stabilizatori ai membranelor mastocitelor şi bazofilelor;
       – unui nivel crescut al eliberării spontane de mediatori ca urmare a unui proces alergic activ;
       – pacientul este un “non-releaser” (bazofilele nu răspund la stimulare – 10-15% dintre subiecţi)3;5.

Fig. 17.4.2 Etapele testului BDT

Bibliografie

1. Gϋlfem Elif Çelik, Werner J Pichler, N Franklin Adkinson. Drug Allergy. In Middleton’s Allergy, Seventh Edition., Mosby Elsevier, 2009, 1215-1216.
2. Ioan Bradu Iamandescu. Alergia alimentară şi digestivă. In Alergologie – Fiziopatologie, diagnostic, tratament, Editura All, 1998, 519-525.
3. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
4. Radhia Boumiza, Anne-Lise Debard, Guillaume Monneret. The basophil activation test by flow cytometry: recent developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. In Clinical and Molecular Allergy, 2005, 3:9.
5. Robert G. Hamilton, N. Franklin Adkinson. In vitro assays for the diagnosis of IgE-mediated disorders. In Current Reviews of Allergy and Clinical Immunology, 2004.
6. Robert K Bush, Steve L Taylor. Adverse Reactions to Food and Drug Additives. In Middleton’s Allergy, Seventh Edition., Mosby Elsevier, 2009, 1175-1185.
Abonează-te la Newsletter