facebook

Alergeni–testul de transformare limfoblastică (LTT)

Trimite pe e-mail acest articol
Printeaza acest articol

Istoricul şi principiul LTT

LTT este în acest moment singura metodă de laborator de determinare a sensibilizării celulare specifice (hipersensibilitate de tip IV).

Dezvoltarea testului în 1962 s-a bazat pe observaţia că incubarea limfocitelor cu fitohemaglutinina, un mitogen, conduce la activarea şi proliferarea celulară1. De atunci LTT a cunoscut o îmbunătăţire semnificativă datorită noilor tehnici de culturi celulare şi metode analitice, devenind un test înalt sensibil şi reproductibil atât pentru cercetarea medicală cât şi pentru diagnosticul de rutină2.

Principiul LTT se bazează pe faptul că limfocitele care au fost sensibilizate anterior faţă de un anumit antigen proliferează şi se transformă în blaşti atunci când sunt expuse din nou la acelaşi antigen. Există câteva metode fizice şi chimice de cuantificare a procesului de transformare limfoblastică în concordanţă cu mecanismele biologice variate care se produc la nivel celular. Acestea includ măsurarea unor procese metabolice cum ar fi biosinteza proteică, sinteza acidului ribonucleic (ARN) sau a acidului dezoxiribonucleic (ADN). Testul care măsoară replicarea ADN-ului este cel mai larg folosit, fiind recomandat de Uniunea Internaţională a Societăţilor Imunologice (IUIS)5; mai exact, se determină încorporarea unui deoxiribonucleotid marcat în celulele-fiică ale limfocitelor activate; citirea rezultatelor se efectuează după 8-12 h, interval de timp suficient pentru ca toate celulele să treacă printr-un ciclu de diviziune cu sinteza ADN-ului în faza S; se consideră că replicarea ADN-ului domină încorporarea. Pentru încorporare este utilizat cel mai frecvent un nucleozid marcat cu izotop radioactiv (timidina marcată cu 3H).

O reacţie pozitivă la LTT demonstrează existenţa limfocitelor antigen-specifice (celule cu memorie) în sângele pacientului6.

Performanţa actuală a LTT

Nu cu mult timp în urmă LTT prezenta o sensibilitate mică şi nu avea nici măcar valoarea testului epicutan (patch test). Specificitatea sa era de asemenea scăzută, ceea ce se reflectă în numeroasele reacţii pozitive cu relevanţă clinică incertă şi dificil de interpretat. In ultimii ani acest lucru s-a schimbat fundamental. Tehnologiile LTT folosite astăzi în laboratoarele de imunologie se remarcă prin sensibilitate, specificitate şi acurateţe diagnostică mare. La aceasta au contribuit dezvoltarea tehnicilor de culturi celulare şi de medii, calitatea alergenilor folosiţi pentru stimulare celulară şi nu în ultimul rând metodele de măsurare perfecţionate.

Astfel, variantele noi de LTT au o sensibilitate şi specificitate crescute datorită adăugării în culturile celulare a interferonului alfa obţinut prin tehnici genetice. In plăcile de microcultură este posibil să se efectueze mai multe teste cu fiecare alergen.

Pe de altă parte, aparatele de scintilaţie în lichid folosite pentru determinarea activităţii 3H-timidinei au fost înlocuite de cele mai moderne contoare beta în fază solidă, care fac inutilă manipularea ulterioară a celulelor stimulate alergenic.

În cazul indicaţiei corecte, a efectuării şi interpretării testului într-un centru specializat, sensibilitatea şi specificitatea LTT ajung la 78- 85%.
În concluzie, LTT-ul actual, datorită tehnicilor moderne, este o metodă de laborator care şi-a găsit locul în diagnosticul celor mai diferite tablouri de boală2.

Indicaţiile LTT

Paleta de indicaţii a LTT cuprinde domenii importante ale imunopatologiei:

– sensibilizarea de tip celular (alergie de tip IV) la medicamente, metale, materiale dentare, alimente;
– defecte sau tulburări funcţionale ale sistemului imun celular;
– reactivitatea limfocitară faţă de agenţi infecţioşi (Borrelia, Chlamydia, Yersinia, virus herpes simplex).

LTT este o analiză de laborator care, pe lângă o dotare tehnică modernă şi costisitoare, necesită multă experienţă şi calificare din partea personalului de laborator. Din acest motiv este o analiză pe care o pot face doar laboratoare sau institute specializate2.

Metoda LTT propriu-zisă

Cuprinde următoarele etape:

1. izolarea limfocitelor din sângele periferic heparinat prin centrifugare în gradient de densitate Ficoll; este obligatoriu ca sângele să fie transportat la laborator în condiţii ambientale, iar centrifugarea să se efectueze în decurs de 24 ore de la recoltarea probei;

2. după resuspendarea celulelor în mediul de cultură se vor transfera 1,2×106 celule pe o placă de cultură sterilă (replicate în triplu);

3. adăugarea alergenelor/antigenelor si menţinerea culturilor celulare la 37˚C în atmosfera de 5% CO2; sunt necesare anumite concentraţii pentru obţinerea unui raport optim între limfocite şi antigen care să permită proliferarea maximă; în prealabil se efectuează şi teste de citotoxicitate, pentru a se asigura că acele concentraţii de antigen folosite nu exercită un efect toxic asupra limfocitelor, care ar putea altera astfel testul;

4. creşterea specificităţii testului prin adăugarea de α-interferon, ser autolog şi glutamină;

5. în ziua 6 se va adăuga în culturile de celule, pentru un interval de 12 ore, timidina marcată cu 3H care se va încorpora în celulele-fiică ale limfocitelor activate; după aceea celulele sunt colectate în filtre din fibre de sticlă şi se trece la etapa de măsurare;

6. cuantificarea sintezei noi de ADN induse de antigen prin măsurarea într-un contor beta a ratei  încorporării 3H-timidinei.

Aceste etape sunt ilustrate în figurile de mai jos:

Pentru determinarea funcţiei limfocitare nespecifice se adaugă în culturile celulare şi un mitogen, cum ar fi PWM (poke weed mitogen), care stimulează policlonal limfocitele B şi T (controlul pozitiv al testului). Nu în ultimul rând, participă la etapele testului şi mediul de cultură cu limfocitele pacientului fără antigene adăugate, ca un control al proliferării spontane (controlul negativ al testului).

Rata încorporării 3H-timidinei in ADN este direct proporţională cu proliferarea limfocitară. Din rata de încorporare a timidinei  (cpm= counts per minute; numărul de ionizări pe minut) este calculat un index de stimulare (SI):

SI = radioactivitatea încorporată în culturile cu antigen/ radioactivitatea încorporată în culturile fără antigen
SI este evaluat pentru fiecare antigen în parte.

Adăugarea α-interferonului şi a serului autolog proaspăt în placa de cultură creşte SI prin intensificarea proliferării specifice induse de antigen şi reducerea proliferării spontane nespecifice a limfocitelor, mai ales în zilele 4-6. Acest lucru este în special util la pacienţii imunodeprimaţi şi în cazurile în care limfocitele T specifice sunt în număr redus. Efectul pozitiv al folosirii α-interferonului a fost confirmat prin studii care au inclus pacienţi cu alergie de contact la nichel şi aur2;7.

Interpretarea rezultatelor

1. Rezultat negativ

SI < 2 = nu există sensibilizare de tip IV faţă de preparatele testate.

2. Rezultat pozitiv

SI cuprins intre 2 şi 3: rezultat înalt sugestiv pentru o reacţie pozitivă;
SI>3: rezultat net pozitiv.

3. Rezultat neconcludent

Apare în situaţia în care nu s-au obţinut criteriile de validare fie a controlului pozitiv (lipsa de activare policlonală a limfocitelor), fie a controlului negativ (proliferare spontană crescută). În condiţiile în care recoltarea şi transportul probei s-au efectuat în condiţii adecvate, lipsa de validare a testului se poate datora:

       – tratamentului prelungit cu imunosupresoare;
       – proliferării spontane crescute ca urmare a unei hiperactivităţi a sistemului imun2.

Limite şi interferenţe 

LTT evidenţiază numai sensibilizarea limfocitelor şi predispoziţia către reacţiile alergice, fără ca aceasta să conducă în mod necesar la manifestări clinice.

Intensitatea răspunsului limfocitar este influenţată de factori cum ar fi: reacţia alergică propriu-zisă, durata sensibilizării şi intervalul de timp de la apariţia simptomelor clinice şi până la efectuarea testului. În mod obişnuit, proliferarea limfocitară se reduce în decurs de 4-8 săptămâni de la întreruperea expunerii la alergenele sau antigenele responsabile de manifestările alergice, ca urmare probabil a migrării limfocitelor sensibilizate în ganglionii limfatici; totuşi în unele cazuri poate fi detectată câţiva ani.

Se estimează că intervalul optim de efectuare LTT este de 10 zile până la 6 săptămâni de la episodul alergic; dacă se recomandă LTT mai târziu este posibil să se obţină rezultate fals negative. De asemenea, se mai pot obţine rezultate fals negative dacă limfocitele pacientului nu sunt sensibilizate la preparatul nativ testat ci la diverse haptene sau metaboliţi3;4.

  

Bibliografie

1. C. Schütt. Lymphozytentransformationstest. In Immunologische Arbeitsmethoden, H. Friemel (Ed.), pp. 585–594, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1988).
2. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
3. N. Brattig, G. J. Diao, P. A. Berg. The specificity of the lymphocyte transformation test in a patient with hypersensitivity reactions to pyrazolone compounds. A 10-week follow-up study before and after rechallenge In Eur. J. Clin. Pharmacol. 35, 39–45 (1988).
4. P. A. Berg and E. W. Becker. The lymphocyte transformation test – a debated method for the evaluation of drug allergic hepatic injury. In J. Hepatol. 22, 115–118 (1995).
5. Report of the Committee on Clinical Immunology of the IUIS. Eur. J. Immunol. 6, 231–234 (1976).
6. Sieben S, Hertl M, Al Masaoudi T, Merk HF and Blomeke B (2001a) Characterization of T cell responses to fragrances. In Toxicol Appl Pharmacol 172:172-8 (2001).
7. V. von Baehr, W. Mayer, C. Liebenthal, R. Von Baehr, W. Bieger, HD Volk. Improving the in vitro antigen specific T cell proliferation assay: the use of interferon-alpha to elicit antigen-specific stimulation and decrease bystander proliferation. In Journal of immunological method, 251(1-2):63-71, 2001.
Abonează-te la Newsletter