Glutamatdecarboxilaza  este o enzima ce catalizeaza decarboxilarea glutamatului in acid gama-amino butiric (GABA) si dioxid de carbon (CO₂)_. GAD exista in doua izoforme codificate de gene diferite: GAD 1 si GAD 2..

Initial s-a constatat ca serul unor pacienti tineri, recent diagnosticati cu diabet zaharat, a precipitat o proteina cu greutatea moleculara de 64 kDa din celulele insulelor Langerhans umane. Apoi proteina  a fost identificata ca fiind glutamatdecarboxilaza, cu cele doua forme⁶. Aceste izoforme sunt GAD 67 si GAD 65, cu greutatea moleculara de 67, respectiv 65 kilodaltoni. GAD 1 si GAD 2 sunt exprimate in creier unde GABA are rol de neurotransmitator; GAD 2 este exprimata si in pancreas.

GAD 65 si GAD 67 constituie tinte antigenice pentru autoanticorpii persoanelor care vor dezvolta diabet zaharat de tip 1 sau LADA (Latent Autoimmune Diabetes in Adults). Procesele autoimune in diabetul de tip 1 sunt indreptate in mod specific  asupra celulelor beta producatoare de insulina pe care le distrug progresiv. Rezultatul este deficitul absolut de insulina. Anticorpii pot fi detectati inaintea aparitiei intolerantei la glucoza, cand testele metabolice prezinta inca valori normale. Studiile au aratat ca indivizii GAD 65 pozitivi au un raspuns insulinic scazut la testul oral de toleranta la glucoza  si prezinta alele HLA asociate cu dezvoltarea diabetului, comparativ cu indivizii GAD negativi⁷.

 Recomandari pentru determinarea anticorpilor GAD

-evaluarea susceptibilitatii de a dezvolta un diabet zaharat tip1 (marker predictiv);

-diferentierea diabetului de tip 1 si de tip 2.^1;4;5.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) – minim 7 ore⁴.

Specimen recoltat - sange venos⁴.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator⁴.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare; se lucreaza serul proaspat; daca acest lucru nu este posibil, serul se pastreaza la 2-8°C sau la -20°C⁴.

Volum proba – minim 0.5 mL ser⁴.

Cauze de respingere a probei - specimen intens hemolizat⁴.

Stabilitate proba - serul separat este stabil 7 zile la 2-8°C; 3 luni la -20°C; nu decongelati/recongelati⁴.

Metoda – imunoenzimatica (EIA)⁴.

Valori de referinta - <10 IE/mL⁴.

Interpretarea rezultatelor

Prevalenta anticorpilor GAD in diabetul de tip 1 este 80%, atat la copii cat si la adulti. La mai putin de 5% dintre pacientii cu diabet zaharat tip 2 pot fi gasiti anticorpi in titruri mici.

Valoarea predictiva a anticorpilor creste cu titrul si cu prezenta simultana a altor autoanticorpi; determinarea lor este utilizata pentru predictia, diagnosticul si managementul pacientilor diabetici⁵. Astfel, rudele de gradul I ale unui diabetic tip 1 care prezinta cel putin trei din cei patru anticorpi, au o probabilitate de 80-100% de a dezvolta la randul lor un diabet zaharat de tip 1.

Limite si interferente

Titruri ridicate de anticorpi GAD pot fi gasite si in alte boli autoimune (tiroidiene, neurologice)^2;5.

Bibliografie

1. Richard A. McPherson, Matthew R. Pincus. Henry’s clinical diagnosis and management by laboratory methods, Ed., 2007, 185-189.

2. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Glutamic Acid Decarboxylase (GAD65) Antibody Assay Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.

3. Lothar Thomas. Insulin, C-peptide, proinsulin. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998, 153-154.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

5. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Glutamic Acid Decarboxylase (GAD) Autoantibody. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

6. Savola Kaisa. Role of IA2 antibodies in clinical and preclinical type 1 diabetes. Acta Univ.Oul. D 597,2000.

Diabetul zaharat de tip 1 este caracterizat printr-o distrugere mediata imunologic a celulelor beta pancreatice producatoare de insulina. In timp ce in patogeneza au rol hotarator limfocitele T autoreactive, pentru diagnostic prezinta importanta autoanticorpii specifici. Riscul de imbolnavire este influentat de predispozitia genetica (tiparul HLA), factorii de mediu si o disfunctie a sistemului imun. Procesul autoimun fata de celulele beta evolueaza asimptomatic timp de luni sau ani, pana cand numarul celulelor devine insuficient pentru a mentine valoarea glicemiei in limite normale. 

Autoanticorpii fata de citoplasma  celulelor pancreatice  au fost descrisi initial in 1970. Sunt detectati prin imunofluorescenta indirecta folosind ca substrat celule pancreatice umane de grup sanguin O. ICA sunt anticorpi policlonali care reactioneaza cu toate celulele insulare (de exemplu alfa, beta, gamma, delta si PP). Autoantigenele lipidice si proteice recunoscute de ICA includ sialoglicoconjugatul, GAD si IA_2. La fel ca alti autoanticorpi insulari, nici ICA nu par sa joace un rol etiologic in distrugerea celulelor beta, dar sunt markeri importanti de autoimunitate.

La debutul diabetului de tip 1, se considera ca 70-90% dintre pacienti sunt ICA-pozitivi^1,6.  Frecventa acestora scade pe parcursul evolutiei bolii, astfel ca doar 5-10% din diabetici raman pozitivi dupa 10 ani de la debut⁶.

Recomandari pentru determinarea anticorpilor anti-celule insulare pancreatice

– diferentierea pacientilor cu diabet de tip 1 de cei de tip 2;

– evaluarea riscului de a dezvolta un diabet zaharat la rudele de gradul I ale unui diabetic;

– evaluarea riscului la pacientele cu diabet gestational^2;4;5.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) – minim 7 ore⁴.

Specimen recoltat - sange venos⁴.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator⁴.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare; se lucreaza serul proaspat; daca acest lucru nu este posibil, serul se pastreaza la 2-8°C sau la -20°C⁴.

Volum proba – minim 0.5 mL ser⁴.

Cauze de respingere a probei - specimen intens hemolizat⁴.

Stabilitate proba - serul separat este stabil 7 zile la 2-8°C; 3 luni la -20°C; nu decongelati/recongelati⁴.

Metoda – imunofluorescenta indirecta⁴.

Valori de referinta - titru <1/10⁴.

Interpretarea rezultatelor

Frecventa anticorpilor anti-celule insulare pancreatice in populatia generala este scazuta (0.59% conform unor studii⁶) si de asemenea la pacientii cu diabet tip 2. Prezenta lor confirma autoimunitatea in cazurile de diabet la debut si pot diferentia diabetul de tip 1 de cel de tip 2: pacientii cu anticorpi anti-celule insulare pancreatice sunt incadrati ca avand diabet tip 1.Totusi,absenta lor nu exclude diabetul de tip 1.Un titru mai mare ar fi asociat cu un risc mai mare de imbolnavire⁶. De asemenea numarul anticorpilor pozitivi ar fi mai important decat combinatia lor⁶.

Limite si interferente

Anticorpii anti-celule insulare pancreatice pot fi gasiti si in alte boli autoimune (artrita reumatoida, boli tiroidiene autoimune). Desi in trecut determinarea anticorpilor anti-celule insulare pancreatice reprezenta „standardul de aur”, tehnica este dificil de standardizat datorita variabilitatii tesuturilor pancreatice  de la donatori diferiti⁷.

Bibliografie

1. J.Seissler,W. A.Scherbaum DGKL.e.V. Arbeitgruppe: Autoimmundiagnostik-Diabetesmellitus www.dgkl.de/autoimmundiagnostik/diabetes

2. Richard A. McPherson, Matthew R. Pincus. Henry’s clinical diagnosis and management by laboratory methods, Ed., 2007, 185-189.

3. W. A. Scherbaum -Fruherkennung des Typ 1 Diabetes www.diabetes-deutschland.de

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

5. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Antipancreatic Islet Cells . www.labcorp.com 2009. Ref Type: Internet Communication.

6. William E. Winter, Neil Harris, Desmond Schat – Immunological Markers in the Diagnosis and Prediction of Autoimmune Type 1 a Diabetes in Clinical Diabetes, 20/2002, 183-191.

7. B.Reinsch, S.Zimmy, H.Schatz, M.Pfohl. Antikoerper gegen Glutamatdecarboxylase und Tyrosinphosphatase-aenliches Protein IA2 in der Klassifikation von unselektionierten diabetespatienten Medizinische Klinik 2003;98:67-71 (Nr.2)

Patogeneza diabetului zaharat insulino-dependent este caracterizata printr-o lunga perioada subclinica in care autoanticorpii circulanti fata de antigenele tisulare sunt asociati cu evolutia bolii in celulele pancreatice. In istoria naturala a diabetului zaharat, distrugerea celulelor beta poate fi vazuta ca trecand prin 5 faze:

1. predispozitie genetica;

2. pozitivarea autoanticorpilor;

3. raspuns anormal al insulinei la testul de toleranta la glucoza i.v.;

4. test patologic de toleranta la glucoza administrata oral;

5. diabet clinic manifest.

Majoritatea cazurilor de diabet tip 1 apare sporadic, in absenta unui istoric familial pozitiv. Concordanta pentru diabetul de tip 1 la gemenii identici este intre 30% si 50%. De aceea se considera ca factorii de mediu joaca rol important in dezvoltarea diabetului, avand o actiune de declansare a procesului autoimun⁶.

Dezvoltarea diabetului zaharat de tip 1 autoimun este insotita de aparitia anticorpilor fata de o varietate de antigene ale celulelor insulare pancreatice, inclusiv insulina¹. La copiii diabetici acestia se gasesc in proportie de 50-70%, pe cand la pacientii adulti doar intr-un procent de 20-30%³. Odata ce diabetul devine clinic manifest, nivelul anticorpilor anti-insulina scade la titruri joase pana la nedetectabil.

Pe de alta parte, tratamentul diabetului zaharat presupune aproape in mod invariabil (tipul 1) sau frecvent (tipul 2) administrarea insulinei. Anticorpi IgG pot aparea si fata de insulina administrata, desi folosirea aproape exclusiva a insulinei umane recombinate face ca acest lucru sa se intample mai rar decat in trecut cand era folosita insulina de origine animala. La acesti pacienti, o parte din insulina injectata este legata de anticorpi si devine biologic neutilizata. In consecinta este nevoie de doze mari de insulina datorita acestei rezistente induse de anticorpi².

Recomandari pentru determinarea anticorpilor anti- insulina

- evaluarea riscului dezvoltarii unui diabet zaharat tip 1 la pacientii predispusi genetic;

- diagnosticul diferential intre diabetul de tip 1 si de tip 2;

- evaluarea diabeticilor cu rezistenta la insulina.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) – minim 7 ore⁴.

Specimen recoltat - sange venos⁴.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator⁴.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare; se lucreaza serul proaspat; daca acest lucru nu este posibil, serul se pastreaza la 2-8°C sau la -20°C⁴.

Volum proba – minim 0.5 mL ser⁴.

Cauze de respingere a probei - specimen intens hemolizat⁴.

Stabilitate proba - serul separat este stabil 7 zile la 2-8°C; 3 luni la -20°C; nu decongelati/recongelati⁴.

Metoda – radioimunologica (RIA )⁴.

Valori de referinta  -  <1 U/mL⁴.

Interpretarea rezultatelor

Un rezultat pozitiv indica dezvoltarea autoimuna primara de anticorpi anti-insulina sau secundara datorata administrarii indelungate a insulinei. La pacientii predispusi genetic la diabet zaharat (istoric familial de diabet zaharat sau HLA predispozant) detectia diferitilor autoanticorpi, inclusiv anticorpi anti-insulina, constituie un indicator de dezvoltare in viitor a unui diabet tip 1². 

Limite si interferente

Testul nu este recomandat pacientilor care au primit recent radioizotopi in scop terapeutic sau diagnostic,datorita interferentelor posibile. O recomandare privind perioada de timp necesara inaintea recoltarii nu se poate face, aceasta depinzand de izotop, de doza si de pacient².

Bibliografie

1. J.Seissler,W. A.ScherbaumDGKL.e.V.Arbeitgruppe:Autoimmundiagnostik-Diabetesmellitus www.dgkl.de/autoimmundiagnostik/diabetes

2. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides C-peptide www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication

3. W.A.Scherbaum-Fruherkennung des Typ 1 Diabetes www.diabetes-deutschland.de.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

5. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Insulin Autoantibodies (IAA). www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

6. William E. Winter,Neil Harris,Desmond Schatz-Immunological Markers in the Diagnosis and Prediction of Autoimmune Type 1 a Diabetes in Clinical Diabetes, 20/2002, 183-191.

Diabetul zaharat tip 1 apare in urma distrugerii celulelor beta ale pancreasului, ceea ce conduce la un deficit absolut de insulina. Simptomele clinice ale diabetului nu apar pana cand nu au fost distruse 80% pana la 90% din aceste celule⁵. Inaintea manifestarii clinice, diabetul de tip 1 se caracterizeaza prin aparitia autoanticorpilor circulanti fata de o varietate de antigene insulare, ce sunt reprezentate de decarboxilaza acidului glutamic (GAD), tirozin fosfataza si insulina¹. Distrugerea autoimuna  a celulelor beta pancreatice producatoare de insulina este considerata a fi cauza primara a diabetului^2,3.

Prezenta acestor autoanticorpi demonstreaza o activitate autoimuna precoce si determinarea lor poate ajuta clinicianul in predictia, diagnosticul si managementul pacientilor diabetici⁵.

IA₂ face parte din familia proteinei tirozinfosfataza, parte componenta a membranei celulare. Proteinele tirozinfosfataze (PTPs) sunt o mare familie de enzime cu rol in semnalizarea intra-si intercelulara, antagoniste ale tirozinkinazelor (PTKs). In timp ce PTK fosforileaza tirozina, PTP indeparteaza fosfatul de pe substrat. Deoarece statusul de fosforilare a unei proteine ii poate modula functia, PTK si PTP conlucreaza pentru a regla functionarea proteinelor in ceea ce priveste raspunsul fata de o varietate de semnale, inclusiv hormoni, mitogeni si oncogene⁸. Ca si GAD, IA₂ se gaseste in tesutul nervos si alte tesuturi endocrine. Anticorpii fata de IA₂ se gasesc la 50-75% dintre copiii diabetici de tip 1 si 30-50% din adulti inaintea aparitiei bolii. Deoarce riscul de diabet creste cu prezenta fiecarui anticorp, valoarea predictiva a anticorpilor IA₂ creste cand este insotita de prezenta anticorpilor fata de insulina sau fata de GAD^1,3.7.

 Prevalenta anticorpilor in diabetul zaharat tip 1 (%)

Recomandari pentru determinarea anticorpilor antitirozinfosfataza

– diferentierea pacientilor cu diabet de tip 1 sau de tip 2;

– evaluarea riscului de a dezvolta un diabet zaharat la rudele de gradul I ale unui diabetic;

– suspiciune de LADA (latent autoimmune diabetes in adults) si pentru evaluarea nevoii de insulina;

– evaluarea riscului la pacientele cu diabet gestational^3;4.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) – minim 7 ore⁴.

Specimen recoltat - sange venos⁴.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator⁴.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare; se lucreaza serul proaspat; daca acest lucru nu este posibil, serul se pastreaza la 2-8°C sau la -20°C⁴.

Volum proba – minim 0.5 mL ser⁴.

Cauze de respingere a probei - specimen intens hemolizat⁴.

Stabilitate proba - serul separat este stabil 7 zile la 2-8°C; 3 luni la -20°C; nu decongelati/recongelati⁴.

Metoda - ELISA⁴.

Valori de referinta -  <10 IE/mL⁴.

 Interpretarea rezultatelor

Evidentierea anticorpilor indica evolutia unui proces autoimun. Studii efectuate pe termen lung arata ca o testare combinata a diferitilor anticorpi (GADA+IA ₂  sau GADA+IAA) se coreleaza in peste 85% din cazuri cu risc sau debut de diabet de tip1³. Specificitatea anticorpilor atinge 98%¹. Un rezultat negativ la copii face improbabil diagnosticul de diabet de tip 1.

O problema speciala o reprezinta diabetul LADA. Acesta are in comun cu diabetul de tip 1 caracteristicile fiziologice privind disfunctia metabolica, genetica si autoimunitatea. Pacientii dezvolta un diabet dupa 30 ani ca urmare a evolutiei lente a unui proces autoimun.  Acesti pacienti sunt diagnosticati frecvent ca avand diabet de tip 2 si tratati cu antidiabetice orale^1,7. Totusi, dupa luni sau ani se ajunge la nevoia de insulina. Se estimeaza ca 20% dintre pacientii diagnosticati ca avand diabet tip 2 (mai ales intre 25-44 ani) ar avea de fapt LADA¹. Testarea anticorpilor specifici ar trebui facuta la toti adultii care nu sunt obezi si aparent prezinta diabet zaharat tip 2.

Limite si interferente

Deoarece anticorpii specifici nu pot fi determinati intotdeauna,un rezultat negativ nu exclude diagosticul de diabet de tip 1 (diabet zaharat tip 1 idiopatic). Mai ales in cazul adultilor,cca. 20-30% nu prezinta anticorpi, desi exista un deficit absolut de insulina. In acest caz diagnosticul poate fi stabilit prin determinarea secretiei pancreatice reziduale si prin teste genetice¹. 

Bibliografie

1. J.Seissler,W>A.ScherbaumDGKL.e.V.Arbeitgruppe:Autoimmundiagnostik Diabetesmellitus.www>dgkl.de/autoimmundiagnostik/diabetes

2. Richard A. McPherson,Matthew R. Pincus. Henry”s clinical diagnosis and management by laboratory methods,Ed., 2007, 185-189.

3. W.A.Scherbaum-Fruherkennung des Typ 1 Diabetes www.diabetes-deutschland.de

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

5. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. IA2 Autoantibodies. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

6. Lothar Thomas. Insulin, C-peptide, proinsulin. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998, 153-154.

7. B.Reinsch,S.Zimmy,H.Schatz,M.Pfohl Antikoerper gegen Glutamatdecarboxylase und Tyrosinphosphatase-aenliches Protein IA2 in der Klassifikation von unselektionierten diabetespatienten Medizinische Klinik 2003;98:67-71 (Nr.2)

8. Hiroshi Aoyama,T.M.Araujo Silva,M.A.Miranda,C.V.Ferreira Proteinas tirosina fosfatases: propriedades e funcoes biologicas Quim.Nova, vol 26, No.6, 2003, 896-900.