Aproximativ 90% din matricea organica a osului este formata din colagen de tip I sintetizat de catre osteoblaste. Functia biologica a colagenului fibrilar este de a furniza rezistenta la intindere a osului. Aceasta rezistenta este conferita de o serie de legaturi covalente incrucisate („collagen crosslinks”) care se dezvolta intre moleculele individuale de colagen dintr-o fibra.

Molecula de colagen de tip I cu structura triplu helicoidala prezinta doua situsuri de atasare a legaturilor incrucisate (denumite telopeptide), unul in regiunea amino (N) – terminala si celalalt in regiunea carboxi (C) – terminala. Legaturile se realizeaza efectiv prin intermediul unor polimeri incrucisati formati fie din trei reziduuri de hidroxilizina (piridinolina PYD), fie din doua reziduuri de hidroxilizina si unul de lizina (deoxipiridinolina DPYD). DPYD este prezent aproape in intregime la nivelul osului (vezi figura 14.4.1).

Infrastructura de colagen a osului sufera un proces continuu de remodelare care implica atat un proces de resorbtie osoasa mediata de osteoclaste cat si un proces de formare osoasa de care sunt responsabile osteoblastele.

In cursul procesului de resorbtie osoasa doar 40% dintre legaturile incrucisate sunt eliberate sub forma de compusi de piridinium (PYD si DPYD), restul de 60% fiind atasate de telopeptidele N- si C-terminale. Din circulatie telopeptidele NTx si CTx sunt excretate in urina^1;4;5.

Secventele de aminoacizi si orientarea α 2N-telopeptidului fac ca acest produs de degradare al colagenului uman de tip I sa constituie un marker specific pentru resorbtia osoasa. Astfel nivelurile urinare de NTx se coreleaza cu rata resorbtiei osoase.

Fig. 14.4.1 Legaturile incrucisate DPYD in colagenul osului (Adaptare dupa emedicine.medscape.com)⁵

In mod fiziologic, valori ridicate ale markerilor de resorbtie apar in copilarie, in perioda de crestere osoasa, precum si in faza de vindecare a fracturilor. In aceste situatii insa cresterile markerilor de resorbtie si cele ale markerilor de formare osoasa sunt echilibrate si nu au valoare diagnostica. In schimb, multe afectiuni cum ar fi hipertiroidia, toate cazurile de hiperparatiroidism, majoritatea formelor de osteomalacie si rahitism (chiar daca nu sunt asociate de hiperparatiroidism), hipercalcemia indusa de afectiuni maligne, boala Paget, mielomul multiplu, metastazele osoase, precum si diverse boli congenitale ale tesutului osos pot determina un turn-over osos accelerat si dezechilibrat. Dezechilibrul turn-over-ului osos, de obicei fara o accelerare a acestuia, se intalneste de asemenea in osteopenia si osteoporoza postmenopauza.

Anomaliile turn-over-ului osos ar trebui sa se normalizeze, ca raspuns la tratamentul eficient si acest lucru poate fi monitorizat prin masurarea in ser si urina a markerilor de resorbtie osoasa³.

Astfel, testul de determinare a NTx in urina are valoare predictiva in ceea priveste raspunsul osos  la tratamentul antiresorbtiv hormonal al femeilor in perioada postmenopauza. Testul poate fi de asemenea utilizat in monitorizarea eficacitatii terapiei antiresorbtive in osteoporoza si boala Paget. Pe de alta parte, prezinta utilitate in monitorizarea efectului terapiei antiestrogenice asupra ratei de resorbtie osoasa².

Recomandari pentru determinarea N-telopeptidului urinar

• instrument auxiliar in diagnosticul  conditiilor associate cu turn-over osos crescut;
• diagnosticul diferential intre osteomalacie si osteoporoza;
• identificarea pacientilor cu osteoporoza si turn-over osos accelerat care au un risc mare de progresie rapida a bolii;
• valoare predictiva in ceea ce priveste raspunsul densitatii minerale osoase la tratamentul antiresorbtiv din osteoporoza;
• monitorizarea si evaluarea eficacitatii terapiei la pacientii cu osteopenie, osteoporoza, boala Paget, sau alte afectiuni care beneficiaza de tratament antiresorbtiv;
• instrument auxiliar in monitorizarea raspunsului la alte interventii terapeutice aplicate in afectiuni cu turn-over osos crescut (rahitism, osteomalacie, hipertiroidie)³.

Specimen recoltat­ - urina de 24 ore: la ora 7 dimineata pacientul urineaza si nu retine aceasta urina; apoi colecteaza intr-un vas curat de 2-3 litri toate emisiunile de urina pana la ora 7 dimineata in ziua urmatoare, inclusiv; omogenizeaza (prin agitare) urina recoltata; masoara intreaga cantitate; retine aprox. 10 mL in pahar de plastic de unica folosinta pentru urina. Proba se tine la 2-8°C in timpul colectarii¹.

Recipient de recoltare - vas de 2-3 litri si pahar de plastic de unica folosinta pentru urina, pe care se noteaza cantitatea totala de urina din 24 ore¹.

Cantitate recoltata - 10 mL urina¹.

Cauze de respingere a probei - proba decongelata; utilizarea de substante conservante acide¹.

Prelucrare necesara dupa recoltare - este de preferat sa se lucreze imediat; daca acest lucru nu este posibil, proba se poate stoca la -20°C¹.

Stabilitate proba - cel putin 1 luna la -20°C¹.

Metoda - imunoenzimatica (EIA)¹.

Valori de referinta

Femei: 14-74 nmol/mmol creatinina

Barbati: 13-78  nmol/mmol creatinina¹.

Interpretarea rezultatelor

Prezenta unor valori urinare crescute ale N-telopeptidului este un indicator de resorbtie osoasa accelerata. Majoritatea pacientilor cu osteopenie sau osteoporoza au un turn-over osos redus, dar dezechilibrat, cu predominanta resorbtiei osoase. Acest fapt poate sa conduca la cresteri usoare ale NTX urinar; cresterile mari nu sunt caracteristice acestor conditii, de aceea daca se obtin valori >1.5-2 ori decat limita superioara a valorilor de referinta trebuie sa fie suspectata o osteomalacie asociata sau un diagnostic alternativ. Daca sunt excluse alte conditii insotite de turn-over osos crescut la un pacient cu osteopenie/osteoporoza se va considera ca acesta are un risc crescut de progresie accelerata a bolii.

Femeile cu menopauza precoce si niveluri ale NTx > 67 nmol/mmol creatinina beneficiaza cel mai mult la terapia hormonala de substitutie.

O reducere cu ≥ 50% a nivelului NTx urinar fata de nivelul bazal la 3-6 luni de la initierea terapiei antiresorbtive indica cu probabilitate mare un raspuns adecvat.

Pacientii cu afectiuni tratabile, cum ar fi hipertiroidia, vor prezenta o normalizare a valorilor Ntx urinar in decurs de 3-6 luni de la vindecarea completa³.

Limite si interferente.

Deoarece exista fluctuatii diurne ale valorilor NTX se recomandata efectuarea testului din urina recoltata in 24 ore. Cu toate acestea probele recoltate aleator pot fi acceptate, dar in acest caz se recomandata ca testarea sa se repete cel putin o data pentru a permite o estimare cat mai corecta a turnover-ului osos.

Probele  foarte diluate nu pot permite masurarea nivelului creatininei si, prin urmare, raportarea valorilor NTX la creatinina devine imposibila.

Colectarea  urinei in recipiente care contin conservanti acizi determina aparitia unor rezultate eronate si prin urmare aceste probe sunt neacceptate³.

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

2. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. NTX-Telopeptide Cross-links (NTx) Urine. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

3. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. NTx-Telopeptide, Urine. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.

4. Richard A. Mc.Pherson, Mattew R. Pincus. Biochemical markers of bone metabolism. In Henry´S.Clinical Diagnosis and Management By Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 181.

5. Sonia A. Talvar, John F Aloia. Utility of Bone Markers in Osteoporosis, 2009. emedicine.medscape.com. Reference Type: Internet Communication.

Vitaminele D sau calciferolii sunt sintetizate din provitamine prin clivajul inelului B din molecula sterolica in timpul expunerii la lumina solara. Cele mai importante vitamine D sunt vitamina D2 (ergocalciferol) si vitamina D3 (colecalciferol)³.

Vitamina D2 este forma derivata din plante (ergosterol sau provitamina D2). Vitamina D3 provine fie din alimente de origine animala (in special pestele gras sau uleiul de peste) sau suplimente nutritionale, fie este sintetizata la nivel cutanat din 7-dehidrocolesterol (provitamina D3) sub actiunea radiatiilor ultraviolete⁶.  Rata de formare a vitaminei D depinde in principal de durata si intensitatea expunerii. Folosirea cremelor de protectie solara, chiar si cu un SPF de 15, reduce productia acestei vitamine cu 99.9%. Formarea cutanata excesiva este prevenita prin conversia fotosensibila a vitaminei D in tachisterol sau lumisterol. Atat vitamina D2  cat si vitamina D3 nu au activitate biologica semnificativa, de aceea este nevoie sa fie  metabolizate in forme hormonal active².

Activarea are loc in doua etape, mai intai la nivel hepatic si apoi la nivel renal. Vitamina D avand o structura liposolubila este transportata in circulatie sub forma unui complex cu o alfa1 globulina specifica – proteina transportoare a vitaminei D (VDBP = vitamin D binding protein). La nivel hepatic vitamina D sufera prima hidroxilare  pentru a forma 25-OH vitamina D (calcidiol), un metabolit cu activitate biologica limitata.

25-OH vitamina D este legata apoi  de o proteina specifica si transportata la nivelul rinichiului unde are loc a doua hidroxilare; astfel, in tubul proximal renal sub actiunea 1-alfa hidroxilazei rezulta cel mai potent metabolit al vitaminei D: 1,25-(OH)₂ vitamina D (calcitriol). Placenta si tesutul granulomatos reprezinta inca doua situsuri extrarenale importante de productie a 1,25 -(OH)₂ vitaminei D.

Timpul de injumatatire al 1,25-(OH)₂ vitamina D in circulatie este de aproximativ 5 ore; este excretata pe cale urinara si fecala, cel mai important metabolit al ei fiind  24,25-(OH)₂ vitamina D care se formeaza sub actiunea 24-alfa hidroxilazei renale.

Hidroxilarea  renala reprezinta punctul major de control in metabolismul vitaminei D, fiind reglata de concentratia serica a calciului, fosfatului si parathormonului (PTH). Astfel, PTH si hipofosfatemia actioneaza independent pentru cresterea 1,25-(OH)₂ vitaminei D prin stimularea activitatii 1-alfa hidroxilazei renale, iar hipocalcemia  stimuleaza secretia  PTH care va creste productia de 1,25-(OH)₂ vitamina D la nivel renal.

Cei trei hormoni implicati in reglarea metabolismului mineral si osos sunt PTH, calcitonina si 1,25 -(OH)₂ vitamina D. 1,25-(OH)₂ vitamina D se comporta ca un hormon clasic, semnalul transmis fiind realizat prin receptorii pentru calcitriol localizati in principal in intestin, os, rinichi, dar si in numeroase alte organe⁶.

1,25-(OH)₂ vitamina D legata de proteina transportatoare a vitaminei D ajunge la nivel intestinal, unde forma libera este preluata de enterocit si transportata spre un receptor nuclear protein-specific (VDR). Afinitatea acestui receptor pentru 1,25-(OH)₂ vitamina D este de 1000 ori mai mare decat pentru 25-OH vitamina D, ceea ce ar putea explica de ce 1,25-(OH)₂ vitamina D este mult mai activa biologic. Complexul calcitriol-VDR se leaga de receptorul x al acidului retinoic; in urma acestei interactiuni si a cuplarii cu secvente ADN specifice se modifica transcriptia genelor implicate in transportul calciului si se exprima in enterocit canalul de calciu epitelial si o proteina transportatoare a calciului (calbindin), efectul principal al 1,25-(OH)₂ vitaminei D fiind stimularea transportului calciului si fosforului din lumenul intestinului subtire in circulatie, ceea ce duce la cresterea  concentratiei serice a calciului si fosforului.

La nivel renal efectul vitaminei consta in cresterea reabsorbtiei tubulare a calciului; in glandele paratiroide inhiba transcriptia genei PTH cu scaderea sintezei acestui hormon.

Datorita rolului sau in mentinerea homeostaziei calciului,  calcitriolul este esential pentru procesal de remodelare osoasa. Prin interactiunea cu receptori specifici induce expresia proteinelor matricei osoase (osteopontina, osteocalcina, fosfataza alcalina) si suprima sinteza colagenului de tip I. De asemenea creste resorbtia osoasa in sinergie cu actiunea parathormonului, prin stimularea precursorilor osteoclastici imaturi, care prezinta receptori pentru ambii hormoni si care se vor transforma in osteoclaste mature. Acestea indeparteaza calciul si fosforul din os, mentinand nivelurile calciului si fosforului din sange. Concentratiile adecvate de Ca²⁺ si HPO4^2- promoveaza mineralizarea osteoidului. Deficitul sever de vitamina D conduce la insuficienta mineralizarii osteoidului, avand drept consecinta dezvoltarea rahitismului la copil si a osteomalaciei la adult^5;6.

Pe langa  rolul in metabolismul osos calcitriolul exercita numeroase alte efecte:

-imunomodulare: stimuleaza productia de cathelicidin, un agent antiinfectios capabil sa distruga in special Mycobacterium tuberculosis;

-inhiba proliferarea keratinocitelor si fibroblastilor;

-inhiba productia de renina;

-creste contractilitatea miocardului;

-creste productia de insulina;

-inhiba angiogeneza;

-este un inductor al apoptozei (producerea calcitriolului in diverse organe, cum ar fi colon, prostata, glanda mamara, regleaza genele care controleaza proliferarea)^1;5.

Concentratia de 1,25-(OH)₂ vitamina D reflecta activitatea 1-alfa hidroxilazei renale. Desi calcitriolul este metabolitul cel mai potent al vitaminei D, 25-OH vitamina D reflecta mai corect rezervele organismului si de aceea este preferat ca test initial pentru evaluarea statusului vitaminei D. Dozarea in laborator a calcitriolului are importanta in evaluarea hipercalcemiei, hipercalciuriei, hipocalcemiei, precum si  a patologiei asociate³. Este utila si  testarea concomitenta a parathormonului intact².

Recomandari pentru determinarea 1,25-(OH)₂ vitaminei D

- test de linia a doua pentru evaluarea statusului vitaminei D, in special la pacientii cu afectiuni renale;

- diagnosticul diferential al hipercalcemiei;

- investigarea unor pacienti cu semne clinice de deficit de vitamina D, insa la care nivelul de 25-OH vitamina D este normal sau crescut (rahitism ereditar de tip I dependent de vitamina D (VDDR I) cauzat de deficitul de 1-alfa hidroxilaza; rahitism ereditar de tip II dependent de vitamina D, caracterizat prin rezistenta organelor tinta la actiunile 1,25-(OH)₂ vitaminei D)^2;4.

Specimen recoltat - sange venos¹.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator¹.

Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare¹.

Volum proba – minim 1 mL ser¹.

Cauze de respingere a probei

• specimen hemolizat

• specimen icteric, lipemic

• specimen contaminat bacterian¹.

Stabilitate proba - serul separat este stabil 7 zile la 2-8ºC si timp indelungat la -20ºC. Nu decongelati/recongelati¹.

Metoda - radioimunologica (RIA)¹.

Valori de referinta¹ - <12 ani: 40-100 pg/mL; 12-65 ani: 20-63 pg/mL; >65ani: 25-60 pg/mL.

Factor de conversie: pg/mL x 2..5 = pmol/L¹.

Interpretarea rezultatelor

Valori crescute de 1, 25-(OH)₂ vitamina D se intalnesc in urmatoarele conditii:

• perioada de crestere la copii si in cursul sarcinii;
• hiperparatiroidismul primar (PTH crescut, hipercalcemie, hipofosfatemie);
• sarcoidoza, tuberculoza si alte afectiuni granulomatoase (datorita cresterii activitatii hidroxilazei extrarenale);
• limfoame cu hipercalcemie;
• conditii asociate cu hipofosfatemie, prin stimularea activitatii  hidroxilazei renale (hiperparatiroidism, tratamente cu hidroxid de aluminiu);
• dupa un transplant renal functional;
• rahitismul ereditar de tip II dependent de vitamina D (VDDR II sau rahitismul rezistent la vitamina D) caracterizat prin alterarea genetica a functiei  receptorului 1,25-(OH)₂ vitaminei D si imposibilitatea legarii hormonului de receptor (nu exista raspuns fiziologic la administrarea de doze mari de calcitriol)³.

Valori scazute de 1,25-(OH)₂ vitamina D se intalnesc in urmatoarele conditii:

• rahitismul ereditar de tip I dependent de vitamina D (VDDR  I) caracterizat prin alterararea productiei de 1-alfa hidroxilaza renala (cu raspuns normal la administrarea de doze fiziologice de calcitriol);
• rahitismul hipofosfatemic X-linkat (defect functional al 1-alfa hidoxilazei renale si hipofosfatemie);
• insuficienta renala cronica;
• hipoparatiroidismul ereditar sau dobandit (diminuarea sau absenta productiei de parathormon, hiperfosfatemie, hipocalcemie);
• pseudohipoparatiroidism (caracterizat prin rezistenta la actiunile metabolice ale parathormonului).

In rahitismul cauzat de deficitul de vitamina D pot fi intalnite concentratii scazute, normale sau chiar crescute de calcitriol³.

Limite si interferente

Administrarea recenta de radioizotopi in scop diagnostic sau terapeutic poate interfera cu determinarea 1,25-(OH)₂ vitaminei D prin metoda radioimunologica, de aceea se recomanda ca aceasta sa fie evitata cu 24 ore inaintea recoltarii¹.

Concentratiile de calcitriol nu constituie un indicator util pentru intoxicatia cu vitamina D (pot fi normale sau chiar scazute); 25-OH vitamina D este testul recomandat in aceasta conditie⁴.

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

2. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Calcitriol (1,25 di-OH Vitamin D). www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

3. Lothar Thomas. Bone and Mineral Metabolism. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH- Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998; 221-225; 256-257.

4. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: 1, 25-Dihydroxyvitamin D, Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.

5. Michael F. Holick. Vitamin D Deficiency. In The New England Journal of Medicine, volume 357:266-281, July, 2007.

6. Richard A. Mc.Pherson, Mattew R. Pincus. Biochemical markers of bone metabolism. In Henry´S.Clinical Diagnosis and Management By Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 175-176.

Vitaminele D sau calciferolii sunt sintetizate din provitamine prin clivajul inelului B din molecula sterolica in timpul expunerii la lumina solara. Cele mai importante vitamine D sunt vitamina D2 (ergocalciferol) si vitamina D3 (colecalciferol)³.

Vitamina D2 este forma derivata din plante (ergosterol sau provitamina D2). Vitamina D3 provine fie din alimente de origine animala (in special pestele gras sau uleiul de peste) sau suplimente nutritionale, fie este sintetizata la nivel cutanat din 7-dehidrocolesterol (provitamina D3) sub actiunea radiatiilor ultraviolete⁶.  Rata de formare a vitaminei D depinde in principal de durata si intensitatea expunerii. Folosirea cremelor de protectie solara, chiar si cu un SPF de 15, reduce productia acestei vitamine cu 99.9%. Formarea cutanata excesiva este prevenita prin conversia fotosensibila a vitaminei D in tachisterol sau lumisterol. Atat vitamina D2 cat si vitamina D3 nu au activitate biologica semnificativa, de aceea este nevoie sa fie  metabolizate in forme hormonal active².

Activarea are loc in doua etape, mai intai la nivel hepatic si apoi la nivel renal. Vitamina D avand o structura liposolubila este transportata in circulatie sub forma unui complex cu o alfa1 globulina specifica – proteina transportoare a vitaminei D (VDBP = vitamin D binding protein). La nivel hepatic vitamina D sufera prima hidroxilare  pentru a forma 25-OH vitamina D (calcidiol), un metabolit cu activitate biologica limitata⁶.

25 hidroxivitamina D, cu un timp de injumatatire prelungit (2-3 saptamani), constituie principalul rezervor circulant si cel mai bun indicator al  statusului global al vitaminei D².

Mai mult de 95% din 25-OH vitamina D dozabila in ser este reprezentata de 25-OH vitamina D3; 25-OH vitamina D2 creste in ser la nivele masurabile doar la pacientii care iau medicatie continand vitamina D2⁶. Testul utilizat in laboratorul nostru determina 25-OH vitamina D totala¹.

Nivelul exact al 25-OH vitaminei D care reflecta o rezerva optima a organismului este necunoscut. Un deficit usor sau moderat poate fi asociat cu osteoporoza sau hiperparatiroidism secundar. Deficitul sever conduce la insuficienta mineralizarii tesutului osos nou format (osteoidului), avand drept consecinta dezvoltarea rahitismului la copil si a osteomalaciei la adult. Deoarece se dezvolta in perioada de crestere osoasa rahitismul are drept consecinta aparitia unor deformatii osoase caracteristice. Modificarile testelor de laborator in rahitism includ: hipocalcemie, hipofosfatemie, cresterea fosfatazei alcaline si a parathormonului. La adult deficitul de vitamina D este asociat cu dureri osoase si un risc crescut de fracturi.

Consecintele deficitului de vitamina D asupra altor organe decat osul nu sunt pe deplin intelese, dar ar putea include o susceptibilitate crescuta fata de infectii, disconfort muscular, rezistenta la insulina, diabet zaharat de tip I, hipertensiune arteriala, insuficienta cardiaca, depresie, schizofrenie, autism, scleroza multipla, sindrom nefrotic, risc crescut de preeclampsie si de afectiuni maligne: cancer de colon, prostata, san, ovar, limfom non-nonhodgkinian^3;4;5.

Cauzele unui nivel suboptim de 25-OH vitamina D includ:

• expunere insuficienta la soare;
• aport alimentar inadecvat;
• deficit de absorbtie a vitaminei D la nivel intestinal (ciroza biliara, sindrom de intestin scurt, insuficienta pancreatica exocrina, boala Crohn, fibroza chistica , boala celiaca);
• catabolizare crescuta a vitaminei D (tratament cu barbiturice si anticonvulsivante, hiperparatiroidism primar);
• pierderi crescute de vitamina D (sindrom nefrotic, dializa peritoneala);
• reducerea activitatii 25-hidroxilazei hepatice secundara unor boli hepatice severe³.

Deficitul de vitamina D este mult mai frecvent decat se credea pana acum, in special in randul adolescentilor, femeilor si varstnicilor. Astfel, numeroase studii au aratat ca mai mult de 50% dintre varstnicii institutionalizati si de asemenea un procent similar de femei care urmeaza tratament pentru osteoporoza prezinta nivele inadecvate de vitamina D. De asemenea persoanele care locuiesc in regiunile din latitudinea nordica, cele cu tenul de culoare inchisa datorita unui continut crescut de melanina, cele care datorita unor obiceiuri religioase isi limiteaza expunerea la soare, pacientii obezi sau cu boli cronice severe, nou-nascutii din mame cu deficit asociaza un risc crescut de a dezvolta deficit de vitamina D^2;4.

Tratamentul deficitului de vitamina D consta in administrarea urmatoarelor preparate:

-colecalciferol (vitamina D3); administrarea zilnica timp de 3 luni a 1000 UI determina o crestere cu 10 ng/mL a nivelului seric de 25-OH vitamina D;

-ergocalciferol (vitamina D2); administrat sub forma unor capsule de 50 000 UI⁵.

In comparatie cu prevalenta crescuta a deficitului de vitamina D, hipervitaminoza D este rara si este depistata numai in cazurile de expunere prelungita la doze mari de vitamina D. Aceasta conditie se caracterizeaza clinic prin anorexie, greata, varsaturi, diaree, hipotonie, nefrolitiaza, tulburari de ritm cardiac, iar ca modificari ale testelor de laborator se inregistreaza hipercalcemie si hiperfosfatemie severe, precum si valori scazute ale parathormonului^4;5.

Recomandari pentru determinarea 25-0H vitaminei D

- diagnosticul deficitului de vitamina D;

- diagnosticul diferential al cauzelor de rahitism si osteomalacie;

- monitorizarea terapiei de substitutie cu vitamina D;

- diagnosticul hipervitaminozei D⁴.

Specimen recoltat - sange venos¹.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator¹.

Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare¹.

Volum proba – minim 1 mL ser¹.

Cauze de respingere a probei

• specimen hemolizat

• specimen icteric, lipemic

• specimen contaminat bacterian¹.

Stabilitate proba - serul separat este stabil 7 zile  la 2-8ºC si timp indelungat la -20ºC. Nu decongelati/recongelati¹.

Metode

a)cromatografie de lichide sub inalta presiune (HPLC)¹.

b)imunochimica cu detectie prin chemiluminiscenta (CLIA).

Valori de referinta

a) <50 ani: 20-70 ng/mL;

>50 ani: 25-70 ng/mL

b) Carenta:                < 10 ng/mL

    Insuficienta:           10-30 ng/mL

    Suficienta:              30-100 ng/mL

    Toxicitate:               >100 ng/mL.

Factor de conversie: 1 ng/mL = 2..496 nmo/L¹.

Limita de detectie – 4 ng/mL¹.

Interpretarea rezultatelor.

Nivelul seric de 25-OH vitamina D reflecta ingestia de vitamina D din alimentatie si sinteza cutanata din provitamine sub influenta razelor ultraviolete; este influentat de varsta, sex, rasa si locatie geografica. De asemenea nivelul de 25-OH vitamina D poate avea variatii sezoniere (valorile din sezonul rece pot fi cu 40-50% mai scazute decat cele din sezonul cald datorita reducerii expunerii la radiatiile ultraviolete). Concentratiile metabolitilor vitaminei D sunt crescute in timpul sarcinii.

Cunoasterea factorilor de influenta a  condus la stabilirea unor valori “normale” in functie de sezon, pe esantioane de populatie din anumite zone geografice. Abordarea mentionata furnizeaza un “interval de referinta“ insa  acesta nu se suprapune cu intervalul optim pentru starea de sanatate daca de fapt un procent semnificativ din populatia de referinta este deficitar in vitamina D. De mai mare utilitate in practica clinica ar putea fi valoarea prag pentru un status nutritional adecvat,sub care un individ poate fi considerat ca avand deficit de vitamina D. Cativa cercetatori preocupati de aceasta problema au incercat sa stabileasca o corelatie intre concentratiile serice de 25-OH vitamina D si cele ale altor markeri biologici, cum ar fi calciul si parathormonul^2;6.

Desi nu exista un consens asupra valorilor optime de 25-OH vitamina D, majoritatea specialistilor defineste deficitul de vitamina D printr-un nivel seric <20 ng/mL (50 nmol/L). Valorile <10 ng/mL indica un deficit sever. In urma studiilor efectuate s-a constatat ca absorbtia intestinala a calciului creste cu 45-65% in cazul in care se obtine o crestere a nivelului seric de 25-OH vitamina D de la 20 la 32 ng/mL (de la 50 la 80 nmol/L). Din acest motiv valorile cuprinse intre 20 si 29 ng/mL pot fi considerate ca un indicator de insuficienta relativa a vitaminei D, in timp ce un nivel >30 ng/mL este adecvat atat pentru absorbtia intestinala optima a calciului (ce mentine echilibrul mineral osos) cat si pentru corectarea hiperparatiroidismului secundar. Pentru a se atinge valorile optime aportul zilnic de vitamina D trebuie sa fie de minimum 800 UI (mai mare decat recomandarile actuale).

Intoxicatia cu vitamina D se observa de obicei la valori serice ale 25-OH vitaminei D >150 ng/mL (374 nmol/L)⁵. Determinarea nivelului de 25-OH vitamina D este utila pentru diagnosticul diferential cu afectiunile granulomatoase, in special sarcoidoza, in care pacientii prezinta de asemenea hipercalcemie, hiperfosfatemie si un nivel redus de PTH (prin conversia ectopica a 25-OH vitaminei D in 1,25-(OH)₂ vitamina D), insa valorile 25-OH vitaminei D sunt mult mai mici decat in hipervitaminoza D⁴. 

Limite si interferente

Obtinerea unor valori >10 ng/mL de 25-OH vitamina D in prezenta unui tablou clinic sugestiv pentru deficitul de vitamina D impune determinarea 1,25-(OH)₂ vitamina D impreuna cu testarea functiei renale⁴.

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

2. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Vitamin D, 25Hydroxy. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

3. Lothar Thomas. Bone and Mineral Metabolism. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH- Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998; 221-225; 254-255.

4. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: 25-Hydroxyvitamin D2 and D3, Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.

5. Michael F. Holick. Vitamin D Deficiency. In The New England Journal of Medicine, volume 357:266-281, July, 2007.

6. Richard A. Mc.Pherson, Mattew R. Pincus. Biochemical markers of bone metabolism. In Henry´S.Clinical Diagnosis and Management By Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 175-176.

Informatii generale

Serul uman contine un amestec variabil de izoenzime ale fosfatazei alcaline (ALP) provenite  in principal din ficat, intestin, rinichi si os. In timpul sarcinii fosfataza alcalina poate fi derivata din placenta. Anumite tumori maligne pot de asemenea produce o izoenzima ALP⁵.

Fosfataza alcalina de origine osoasa, enzima isoforma a fosfatazei alcaline, este o glicoproteina tetramerica care se gaseste pe suprafata osteoblastului si este eliberata in circulatie prin actiunea enzimei fosfatidil-inozitol-glicanaza. Ostaza intervine in calcificarea matricei osoase prin  clivarea pirofosfatului – un inhibitor al mineralizarii osoase⁵. Fosfataza alcalina  osoasa este cunoscuta astfel ca un indicator sensibil si fidel al metabolismului osos.  Are un timp de injumatatire lung, nu este afectata de clearance-ul renal si nu prezinta variatii diurne.

Un nivel ridicat al izoenzimei osoase este intalnit in perioada de crestere osoasa, in cursul procesului de vindecare a fracturilor, cat si in afectiuni ale sistemului osos caracterizate prin hiperactivitate osteoblastica si remodelare osoasa cum ar fi boala Paget, rahitism, osteomalacie, acromegalie, osteosarcom, sarcom Ewing, metastaze osoase (in special asociate cu carcinom prostatic si mamar)^2;3;4.

Impreuna cu ceilalti markeri de formare sau resorbtie osoasa, ostaza poate fi utilizata in monitorizarea tratamentului antiresorbtiv la femeile cu osteoporoza aflate in perioada post-menopauza⁴.

Recomandari pentru determinarea fosfatazei alcaline de origine osoasa - utilitate in diagnosticul si evaluarea severitatii afectiunilor metabolice ale osului cum ar fi boala Paget, osteomalacie, precum si a altor conditii asociate cu turn-over crescut: acromegalie, hiperparatiroidism, tumori osoase primare sau metastatice; monitorizarea eficientei terapiei antiresorbtive in osteoporoza si boala Paget⁴; monitorizarea tratamentului cu hormon de crestere³. 

Pregatire pacient - à jeun¹.

Specimen recoltat - sange venos¹.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu /fara gel separator¹.

Cauze de respingere a probei - specimen intens hemolizat¹.

Prelucrare necesara dupa recoltare –  se separa serul prin centrifugare¹.

Volum proba – 2 mL ser¹.

Stabilitate proba - serul separat este stabil 7 zile la 2-8°C si timp indelungat la -70°C; nu decongelati/recongelati¹.

Metoda – imunochimica cu detecţie prin chemiluminiscenţa (CLIA)¹.

Valori de referinţa¹ 

 Interpretarea rezultatelor

• In mod normal nivelul seric al izoenzimei osoase este ridicat la copiii in crestere.

• Boala Paget, o afectiune ce apare la persoanele cu varsta de peste 50 ani, se caracterizeaza prin leziuni osteolitice uni- sau multifocale localizate de obicei la nivelul femurului, pelvisului si coloanei vertebrale. La acesti pacienti se observa cresteri semnificative ale fosfatazei alcaline serice, astfel ca pot fi intalnite valori de peste 10-25 de ori limita superioara a intervalul de referinta. Exista totusi bolnavi cu forme mai putin agresive de boala Paget, care au concentratii de ALP total  la limita superioara a intervalului de referinta si la care ostaza reprezinta un indicator mai sensibil al activitatii metabolice osoase³. De asemenea fosfataza alcalina de origine osoasa scade in cursul tratamentului antiresorbtiv din boala Paget avand astfel utilitate in monitorizarea eficientei terapiei⁴.
• Cresteri moderate pot fi observate in osteomalacie, in timp ce in  rahitism concentratia de ALP osoasa poate depasi de 2-4 ori valoarea normala.
• Acromegalia determina modificari ale izoenzimei osoase, prin stimularea concentratiei de IGF-1, care activeaza osteoblastele si implicit formarea de os.
• Timp de 3-4 luni dupa un transplant renal ALP de origine osoasa poate inregistra valori ridicate din cauza administrarii de substante imunosupresoare, cum ar fi corticosteroizii sau ciclosporina A³.
• Concentratiile de ostaza pot fi monitorizate in dinamica in cursul tratamentului antiresorbtiv din osteoporoza. Mai multe studii au aratat faptul ca un tratament este eficient daca se obtine o scadere a nivelului ostazei cu cel putin 25% fata de nivelul bazal, in decurs de 3-6 luni de la initierea terapiei. Prin monitorizarea tratamentului se pot identifica pacientii non-responderi la tratament; pe de alta parte demonstrarea precoce a raspunsului biochimic al osului  poate imbunatati si stimula complianta pacientului la terapie⁴.
• Tratamentul cu hormon de crestere al copiilor cu nanism implica costuri ridicate, de aceea este nevoie de un marker predictiv, usor de determinat si care sa ofere precoce informatii asupra raspunsului la tratament. Studii efectuate in acest domeniu au dus la concluzia ca ALP de origine osoasa este un indicator important in monitorizarea terapiei cu preparate de hormon de crestere. Astfel, se considera ca tratamentul este eficient daca se obtine o crestere semnificativa a ostazei fata de nivelul dinaintea tratamentului³.

• In hiperparatiroidismul primar ALP total inregistreaza valori normale sau usor crescute; exista insa o crestere mult mai marcata a ostazei care reflecta mai bine modificarile sistemului osos.

• Tratamentele prelungite cu antiepileptice (fenitoina, fenobarbital, primidona, carbamazepina) pot determina in timp osteomalacie si concentratii ridicate de fosfataza alcalina de origine osoasa, chiar daca uneori nivelul total de ALP este normal. Anticonvulsivantele inhiba secretia de calcitonina, ceea ce duce la o crestere a resorbtiei osoase si modificari ale nivelului de ALP.

• Monitorizarea pacientilor cu neoplasm de prostata prin PSA si ostaza poate imbunatati specificitatea informatiilor cu privire la extinderea bolii si dezvoltarea metastazelor osoase⁵.

Limite si interferente

Ostaza nu trebuie folosita ca test screening pentru osteoporoza⁴.

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate 2009. Ref Type: Catalog.

2. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Bone-specific Alkaline Phosphatase, Serum. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

3. Lothar Thomas. Enzymes. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998, 36-45.

4. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Bone Alkaline Phosphatase, Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.

5. Richard A. McPetersen, Matthew R. Pincus. Biochemical Markers of Bone Metabolism. Clinical Enzymology. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods – Sauders Elsevier 21-Ed 2007, 181, 255-257.

Glandele paratiroide secreta un hormon cu structura polipeptidica numit parathormon (PTH). Rolul fiziologic al paratiroidelor se exercita prin intermediul acestui hormon, care actioneaza atat asupra oaselor, cat si asupra rinichilor, mentinand in limite fiziologice raportul calciu/fosfor^1;6.

Molecula parathormonului intact este un polipeptid ce contine 84 aminoacizi, avand o masa moleculara de 9500Da. Biosinteza sa se realizeaza sub forma unui pre-pro-hormon cu 115 resturi de aminoacizi. Din clivarea acestuia la nivel ribozomal rezulta pro-hormonul cu 90 aminoacizi, care este transportat in aparatul Golgi si convertit in PTH propriu-zis. Secretia PTH si eliberarea sa in circulatia sanguina se realizeaza prin exocitoza^1;4.

Rinichiul si ficatul indeparteaza rapid din circulatie PTH-ul intact. Metabolismul PTH este complex; produsii formati prezinta reactivitati biologice si imunologice variate. Astfel, la nivel hepatic PTH sufera un proces de clivare si metabolizare ce are ca rezultat generarea fragmentelor carboxil-terminale (PTH-C), amino-terminale (PTH-N) si a celor provenite din portiunea mijlocie a moleculei (PTH-M)^8;9. Numai acele portiuni ale moleculei care contin gruparea amino-terminala (intreaga molecula si PTH-N) sunt biologic active si au un timp de injumatatire de 5 minute. Fragmentele PTH-C inactive, cu un timp de injumatatire de 24-36 ore, constituie >90% din PTH-ul circulant total si sunt metabolizate in principal la nivel renal. La pacientii cu insuficienta renala fragmentele PTH-C se pot acumula in cantitati crescute⁸.

Principalul factor ce regleaza secretia de PTH este calciul ionic din plasma. Hipocalcemia are efecte stimulatorii, iar hipercalcemia inhiba secretia hormonului, prin actiunea directa a calciului asupra celulelor principale din tesutul glandular paratiroidian, la nivelul unui receptor membranar cu rol de „senzor” pentru nivelul calciului – CASR⁹.

Ionii fosfat nu intervin direct asupra paratiroidei, ci prin intermediul modificarilor produse  in concentratia ionilor de calciu. Cresterea nivelului de fosfati din plasma, insotindu-se de scaderea calciului, determina activarea secretiei de PTH si invers, cu repercursiunile  respective asupra eliminarii urinare a acestora.

Vitamina D₃ exercita efecte inhibitorii asupra secretiei de PTH, prin reactii de feed-back negativ realizate de excesul de calciu seric. In general, reactiile de reglare a secretiei de PTH sunt cuplate cu ale calcitoninei, mai ales la copii si tineri^4;7.

Principala functie a PTH-ului este mentinerea concentratiei calciului ionic in lichidul extracelular; aceasta se realizeaza prin urmatoarele mecanisme:

● stimularea resorbtiei osoase, cu eliberarea calciului si fosforului din oase; PTH-ul nu exercita un efect direct asupra osteoclastelor mature, ci mediaza diferentierea celulelor preosteosclatice in osteoclaste active;

● stimularea reabsorbtiei calciului si inhibarea reabsorbtiei fosforului la nivelul tubilor renali;

● stimularea sintezei de 1 alfa-hidroxilaza renala cu cresterea consecutiva a productiei de 1,25-(OH) vitamina D, care la randul sau va creste absorbtia intestinala de calciu si fosfor.

Portiunea amino-terminala a PTH-ului se leaga de un receptor specific la nivelul organelor-tinta care moduleaza adelat ciclaza si fosfolipaza C. Mutatiile activatoare ale acestui receptor cauzeaza  condrodisplazia Jansen cu hipercalcemie si modificari ale metafizelor osoase⁹. In cazuri rare de sindroame mostenite asociate cu rezistenta sau lipsa de raspuns la PTH, precum si in insuficienta renala eliberarea PTH nu are ca rezultat cresterea calcemiei⁸.

Efectul net al PTH la nivel renal, osos si, indirect, intestinal este reprezentat de cresterea concentratiei de calciu seric si ionic si scaderea concentratiei de fosfor seric⁹.  

In afara actiunii cuplate asupra balantei fosfo-calcice, PTH creste reabsorbtia ionilor de magneziu si hidrogen, in timp ce o scade pe cea a sodiului, potasiului, aminoacizilor. PTH inhiba de asemenea reabsorbtia bicarbonatului in tubul proximal, intr-un mod asemanator aceleia a fosfatului⁷.

Hiperparatiroidismul determina hipercalcemie, hipofosfatemie, hipercalciurie si hiperfosfaturie. Consecintele pe termen lung sunt: deshidratare, litiaza renala, hipertensiune, tulburari gastrointestinale, osteoporoza si uneori tulburari neuropsihice. Cel mai frecvent hiperparatiroidismul este primar fiind cauzat de adenoame paratiroidiene. Hiperparatiroidismul secundar se dezvolta ca raspuns la hipocalcemie si hiperfosfatemie; cauza cea mai frecventa este insuficienta renala cronica. Un hiperparatiroidism secundar vechi se poate complica cu un hiperparatiroidism tertiar, care consta in dezvoltarea unei hipersecretii paratiroidiene autonome. Cazuri rare de hiperparatiroidism benign sunt consecinta unor mutatii inactivatoare ale CASR.

Hipoparatiroidismul este cel mai adesea consecinta interventiilor chirurgicale pe tiroida, dar se poate produce de asemenea si printr-un mecanism autoimun sau ca urmare a unor mutatii activatoare CASR. Se manifesta prin hipocalcemie, cu tetanie si posibil atrofie de nerv optic⁸.

Recomandari pentru determinarea PTH­ - diagnosticul afectiunilor parotidiene (tumori, hiperplazii); diagnosticul altor afectiuni care altereaza balanta fosfo-calcica; monitorizarea pacientilor cu dializa renala⁶.

Pregatire pacient - obligatoriu à jeun;

• exista o variatie diurna a nivelului de PTH in sange; recoltarea pentru determinarea PTH se face dimineata, cand nivelul sau este minim;

• se recomanda determinarea simultana de calciu total, calciu ionic, fosfor, magneziu; este utila si determinarea creatininei sanguine⁵.

Specimen recoltat - sange venos⁵.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu /fara gel separator⁵.

Cauze de respingere a probei - specimen intens hemolizat⁵.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa cat mai repede serul prin centrifugare⁵.

Volum proba – minim 0.5 mL ser⁵.

Stabilitate proba - serul separat este stabil 6 ore temperatura camerei, 24 ore la 2-8°C si  timp indelungat la

-20°C sau la -70°C ; nu decongelati/recongelati⁵.

Metoda - imunochimica cu detectie prin electrochemiluminiscenta (ECLIA); se determina PTH intact si se elimina astfel interferenta exercitata de metaboliti; cei 2 anticorpi monoclonali utilizati reactioneaza cu epitopi corespunzatori regiunilor de aminoacizi 26-32 si 37-42 din molecula PTH⁵.

Valori de referinta - 15-65 pg/mL⁵.

Limita de detectie - 1.20 pg/mL⁵.  

Interpretarea rezultatelor

Cresteri: hiperparatiroidism primar, hiperparatiroidism secundar, sindrom Zollinger-Ellison, formele ereditar de rahitism dependent de vitamina D, leziuni ale maduvei spinarii.

Scaderi: hipoparatiroidism prin mecanism autoimun sau indus chirurgical, hipercalcemie de cauza non-paratiroidiana, deficit de magneziu, sarcoidoza, hipertiroidism, sindrom DiGeorge^2;6.

In tabelul de mai jos sunt prezentate nivelele inregistrate de PTH si calciu seric in diverse afectiuni⁶:

Aproximativ 90% dintre pacientii cu hiperparatirodism primar au niveluri crescute de PTH; restul pacientilor prezinta niveluri normale de PTH, dar inadecvate fata de valoarea calcemiei. La ~40% dintre pacientii cu hiperparatiroidism primar nivelul fosforului seric este <2.5 mg/dL si la ~80% nivelul fosforului este <3 mg/dL.

Un nivel scazut (adecvat) de PTH insotit de un nivel crescut al fosforului la un pacient hipercalcemic indica faptul ca hipercalcemia nu este cauzata de PTH sau de molecule asemanatoare acestuia.

Un nivel scazut (adecvat) insotit de un nivel scazut al fosforului la un pacient hipercalcemic este sugestiv pentru diagnosticul de hipercalcemie paraneoplazica determinata de PTHRP (parathyroid-related peptide). Aceasta molecula prezinta omologie amino-terminala cu PTH si poate transactiva receptorul PTH. Poate fi produsa de multe tipuri de tumori.

O valoare scazuta sau normala a PTH la un pacient cu hipocalcemie sugereaza hipoparatiroidism cu conditia ca nivelul magneziului sa fie normal. Hipomagneziemia inhiba eliberarea si exercitarea actiunilor PTH putand astfel mima hipoparatiroidismul.

Hipocalcemia asociata cu valori crescute PTH la un pacient cu functie renala normala sugereaza rezistenta la actiunile PTH (pseudohipoparatiroidism tip 1a, 1b, 1c sau 2) sau, foarte rar, un PTH cu activitate biologica ineficienta.

Un numar limitat de fragmente PTH-C care se acumuleaza in insuficienta renala, in principal PTH 7-84, reactioneaza incrucisat in acest test. PTH intact inregistreaza de asemenea valori crescute in insuficienta renala, cresterile usoare fiind considerate benefice (compenseaza rezistenta la PTH a organelor tinta). In consecinta, concentratiile de 1.5-3 ori mai mari fata de limita superioara a valorilor de referinta sunt optime in cazul pacientilor aflati in faza terminala a insuficientei renale. La aceasta categorie de pacienti concentratiile mai scazute de PTH pot fi asociate cu afectare osoasa adinamica, in timp ce valorile mai mari sugereaza un posibil hiperparatiroidism secundar sau tertiar ce poate conduce la osteodistrofie renala cu turn-over osos crescut.

Unii pacienti cu hipercalcemie moderata si niveluri de fosfor variabile, care au fie un PTH usor crescut, fie normal (inadecvat) pot suferi de hipercalcemie hipocalciurica idiopatica cauzata de o mutatie inactivatoare CASR⁸.

Limite si interferente

Deficienta de vitamina D induce cresterea nivelului de PTH. Sindromul lapte-alcaline (Burnett) poate determina o falsa scadere a nivelurilor de PTH^1;2;7.

Fragmentul PTH-C 7-84, care se acumuleaza in insuficienta renala, prezinta o reactivitate incrucisata semnificativa in cadrul acestui test. Din acest motiv, la pacientii cu insuficienta renala nu se vor aplica valorile de referinta pentru populatia sanatoasa⁸.

• Medicamente

Cresteri: ciclosporina, fenitoin, foscarnet, hormon uman de crestere, hidrocortizon, izoniazida, ketoconazol, litiu, nifedipina, pamidronat, prednison, tamoxifen, terapie estro-progestativa, verapamil³.

Scaderi: calcitriol, cimetidina, contraceptive orale, diltiazem, famotidina, gentamicina, hidroxid de aluminiu, pindolol, prednison, sulfat de magneziu, tiazide, vitamina D³.

• Interferente analitice

Pot produce interferente cu unele componente ale kit-ului si conduce la rezultate neconcludente urmatoarele:

- tratamentul cu biotina in doze mari (>5 mg/zi); de aceea se recomanda ca recoltarea de sange sa se faca dupa minimum 8 ore de la ultima administrare;

- titrurile foarte crescute de anticorpi anti-streptavidina si anti-ruteniu⁵.

Bibliografie

1. D.C.Cojocaru, Doina-Irina Cojocaru, Elena Ciornea. Biochimia hormonilor. CORSON, Romania, Ed. 1999, 76-80.

2. Frances Fischbach. Overview of Chemistry Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009, 396-398.

3. Frances Fischbach. Effects of the Most Commonly Used Drugs on Frequently Ordered Laboratory Tests. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 7 Ed., 2004, 1188-1238.

4. Ion Haulica. Fiziologia umana, 2002, 823-832.

5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

6. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Parathyroid Hormone (PTH), Intact. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

7. Lothar Thomas, Cristian Kasperk, Reinhard Ziegler. Parathyroid hormone. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. Lothar Thomas. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany,.1 Ed., 1998, 248-250.

8. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: 25-Hydroxyvitamin D2 and D3, Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.

9. Richard A. Mc.Pherson, Mattew R. Pincus. Biochemical markers of bone metabolism. In Henry´S.Clinical Diagnosis and Management By Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 173-174.

Osteocalcinul (denumit si proteina G1a a osului) – principala proteina necolagenica a tesutului osos – este produs exclusiv de osteoblaste, de aceea este un marker relevant al procesului de formare osoasa. Are o greutate moleculara de aproximativ 5800 daltoni si este alcatuit din 49 aminoacizi, ce includ trei resturi de acid gama-carboxiglutamic. Este specific osului si dentinei, iar sinteza sa implica prezenta vitaminelor K si D3. O parte din osteocalcin este eliberat in sange, iar restul (peste 80%) intra in componenta matricei osoase alaturi de colagen^2;4;6. Osteocalcinul are rol in mineralizarea osoasa unde, datorita afinitatii sale deosebite pentru calciu, ar putea constitui situsul depunerii cristalelor de hidroxiapatita⁸.

In circulatie sunt prezente atat osteocalcinul intact (49 aminoacizi) cat si fragmentul mare N-MID (43 aminoacizi). Osteocalcinul intact este instabil datorita clivajului proteazic intre aminoacizii 43 si 44, in timp ce fragmentul N-MID rezultat in urma clivajului este mult mai stabil⁵. Osteocalcinul este metabolizat in principal in rinichi si mai putin la nivel hepatic; are un timp de injumatatire de aproximativ 5 minute⁸. 

Nivelurile de osteocalcin sunt influentate de varsta (perioada de crestere rapida), sex (mai mari la barbati) si cresc o data cu instalarea menopauzei².

Valori crescute ale osteocalcinului se inregistreaza in afectiuni insotite de cresterea turn-over-ului osos⁸.

Recomandari pentru determinarea osteocalcinului - osteoporoza: monitorizarea terapiei antiresorbtive (tratament de substitutie hormonala, bifosfonati, calcitonina, modulatori selectivi ai receptorilor de estrogeni) si estimarea riscului de fracturi;evaluarea altor afectiuni osoase (inclusiv procese maligne)^1;6;7.

Pregatire pacient - à jeun⁵.

Specimen recoltat - sange venos⁵.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator⁵.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare⁵.

Volum proba – minim 0.5 mL ser⁵.

Cauze de respingere a probei - specimen hemolizat⁵.

Stabilitate proba - serul separat este stabil 8 ore la temperatura camerei; 3 zile la 2-8°C;1 luna la -20°C; se va evita decongelarea/recongelarea⁵.

Metoda - imunochimica cu detectie prin electrochemiluminiscenta (ECLIA); testul foloseste 2 anticorpi monoclonaliindreptati impotriva epitopilor de pe fragmentul N-MID si de pe fragmentul N-terminal; sunt detectati astfel atat fragmentul N-MID stabil cat si osteocalcinul ramas intact; astfel, testul nu este dependent de fragmentul C-terminal (aminoacizii 43-49) al moleculei de osteocalcin, asigurand determinari constante in conditii de rutina^5;7.

Valori de referinta

Femei:

- premenopauza: 11-43 ng/mL

- postmenopauza (fara tratament hormonal de substitutie): 15-46 ng/mL

Barbati:

- 18-30 ani: 24-70 ng/mL

- 30-50 ani: 14-42 ng/mL

- >50 ani: 14-46 ng/mL⁵.

Limita de detectie - 0.5 ng/mL⁵.

Interpretarea rezultatelor

Frecventa testarii la pacientii sub tratament antiresorbtiv:

• inainte de initierea tratamentului (concentratia bazala);

• la 3 luni (reducerea concentratiei cu minimum 20-40% indica succes terapeutic);

• continuarea monitorizarii la fiecare 6-12 luni^1;3;7.

Limite si interferente

Repausul prelungit la pat determina cresteri ale osteocalcinului².

Functia renala influenteaza concentratia de osteocalcin; astfel nivelul seric de osteocalcin creste la pacientii cu afectiuni renale⁵.

• Interferente analitice

Pot produce interferente cu unele componente ale kit-ului si conduce la rezultate neconcludente urmatoarele:

- tratamentul cu biotina in doze mari (>5 mg/zi); de aceea se recomanda ca recoltarea de sange sa se

  faca dupa minimum 8 ore de la ultima administrare;

- titrurile foarte crescute de anticorpi anti-streptavidina si anti-ruteniu;

- anticorpii monoclonali proveniti de la soarece administrati la unii pacienti in scop diagnostic sau terapeutic⁵.

 Bibliografie

1. Delmas PD, Eastell R, Garnero P, et.al. The use of biochemical markers of bone turnover in osteoporosis. In Osteoporosis Int. IOF Recommendations, 11 (Suppl 6):S2-S17, 2000. Ref Type: Journal (Full).

2. Frances Fischbach. Chemistry Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009, 382-383.

3. Hermien W. Goderie-Plomp, Marjolein van der Klift, Willem de Ronde, et.al. Endogenous Sex Hormones, Sex Hormone-Binding Globulin and the Risk of Incident Vertebral Fractures in Elderly Men and Women: The Rotterdam Study. In The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 8:3261-3269, 2004. Ref Type: Journal (Full).

4. Johnell O, Kanis JA, Odén A, et.al. Mortality after osteoporotic fractures. In Osteoporosis Int , 15:38-42, 2004. Ref Type: Journal (Full).

5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

6. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Osteocalcin, Serum. www.labcorp.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.

7. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Osteocalcin, Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.

8. Richard A. Mc.Pherson, Mattew R. Pincus. Biochemical markers of bone metabolism. In Henry´S.Clinical Diagnosis and Management By Laboratory Methods, Ed.Saunders, 2007, 181.

Osteoporoza este definita ca o afectiune evolutiva a sistemului osos caracterizata prin pierderea de masa osoasa si prin alterari ale microarhitecturii tesutului osos, avand drept consecinta cresterea fragilitatii osoase si a riscului de fracturi.

Datorita corelatiei bine determinate dintre densitatea minerala osoasa si riscul de fracturi, pentru monitorizarea tratamentului in osteoporoza se recomanda de obicei efecturea osteodensitometriei. Cu toate acestea, indiferent de tratamentul utilizat, masurarea densitatii minerale osoase nu este relevanta pentru evaluarea eficientei terapeutice decat dupa un an de la inceputul tratamentului.

Exista mai multe motive care contribuie la un raspuns inadecvat la tratament, lipsa compliantei pacientilor situandu-se probabil pe primul loc. Din acest motiv, ar fi util atat pentru medici cat si pentru pacienti sa se obtina precoce informatii privind eficienta terapiei si in acest sens subliniem contributia markerilor ososi. Daca densitometria osoasa cuantifica masa osoasa – imagine statica – determinarea markerilor ososi furnizeaza informatii despre procesul de „remodelare”  osoasa – imagine dinamica⁴.

Astfel markerii ososi pot fi folositi in monitorizarea terapiei (inclusiv a compliantei la tratament) si pentru estimarea riscului de fracturi cauzate de osteoporoza. In momentul de fata nu se recomanda folosirea markerilor ososi pentru estimarea riscului de pierdere osoasa spontana la pacientii netratati^1;2.

Utilitatea markerilor ososi nu este limitata  numai la evaluarea osteoporozei, acestia avand valoare clinica si in alte afectiuni osoase, cum ar fi : boala Paget a osului, hiperparatiroidism primar si secundar, osteomalacie si boli metabolice ale osului³.

Mai mult de 90% din matricea organica a osului este alcatuita din colagenul de tip I, care este sintetizat preferential la acest nivel. In cursul metabolismului osos normal colagenul de tip I matur sufera un proces de degradare rezultand mici fragmente ce sunt eliberate in circulatie si excretate apoi prin rinichi. In conditiile unei resorbtii osoase crescute (fiziologic: varsta inaintata, patologic: osteoporoza) colagenul de tip I este degradat intr-o masura mai mare, astfel ca nivelul fragmentelor eliberate in circulatie este crescut. Printre fragmentele cu relevanta clinica se numara si telopeptidele C-terminale (CTx).  Pe masura ce osul “imbatraneste” acidul α-aspartic prezent in telopeptidele C-terminale este convertit in forma β (β –CTx). Aceste telopeptide izomerizate sunt specifice pentru degradarea colagenului de tip I ce predomina la nivelul osului.

β–CTx (Beta-CrossLaps) apare in faza incipienta a degradarii colagenului de tip I; de aceea este un marker specific si stabil al resorbtiei osoase⁴;⁵.

Recomandari pentru determinarea Beta-CrossLaps - osteoporoza : monitorizarea terapiei antiresorbtive (tratament de substitutie hormonala, bifosfonati, calcitonina, modulatori selectivi ai receptorilor de estrogeni) si estimarea riscului de fracturi (marker de electie)¹.

Pregatirea pacientului - à jeun⁵.

Specimen recoltat - sange venos⁵.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator⁵.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare⁵.

Volum proba – minim 0.5 mL ser⁵.

Cauze de respingere a probei - specimen hemolizat⁵.

Stabilitate proba - serul separat este stabil 24 ore la temperatura camerei; 3 luni la -20°C; timp indelungat la        -70°C; se va evita decongelarea/recongelarea⁵.

Metoda - imunochimica cu detectie prin electrochemiluminiscenta (ECLIA); testul utilizeaza 2 anticorpi monoclonali ce recunosc fiecare octapeptidele lineare β-8AA; astfel testul cuantifica fragmentele de degradare a colagenului de tip I ce contin de doua ori octapeptidele lineare β-8AA (β–CTx)⁵.

Valori de referinta⁵ 

Factor de conversie: ng/mL x 0.01 = pg/mL.

Limita de detectie – 0.01 ng/mL (10 pg/mL)⁵. 

Interpretarea rezultatelor

Frecventa testarii la pacientii sub tratament antiresorbtiv:

• inainte de initierea tratamentului (concentratia bazala);

• la 3 luni (reducerea concentratiei cu minimum 35-55% indica succes terapeutic);

• continuarea monitorizarii la fiecare 6-12 luni.

Estimarea riscului de fracturi osteoporotice: valori crescute cu 2 deviatii standard fata de valoarea corespunzatoare perioadei de premenopauza se asociaza cu o crestere de doua ori  a riscului de fracturi¹.

Limite si interferente

Interpretarea rezultatelor la pacientii cu disfunctii renale trebuie efectuata cu prudenta (se poate produce o diminuare a excretiei markerului si o crestere in consecinta a nivelului seric al acestuia)⁵.

• Interferente analitice

Pot produce interferente cu unele componente ale kit-ului si conduce la rezultate neconcludente urmatoarele:

- tratamentul cu biotina in doze mari (>5 mg/zi); de aceea se recomanda ca recoltarea de sange sa se

  faca dupa minimum 8 ore de la ultima administrare;

- titrurile foarte crescute de anticorpi anti-streptavidina si anti-ruteniu;

- anticorpii monoclonali proveniti de la soarece administrati la unii pacienti in scop diagnostic sau terapeutic⁵.

Bibliografie

1. Delmas PD, Eastell R, Garnero P, et.al. The use of biochemical markers of bone turnover in osteoporosis. In Osteoporosis Int. IOF Recommendations, 11 (Suppl 6):S2-S17, 2000. Ref Type: Journal (Full).

2. Frances Fischbach. Chemistry Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009, 382-383.

3. Hermien W. Goderie-Plomp, Marjolein van der Klift, Willem de Ronde, et.al. Endogenous Sex Hormones, Sex Hormone-Binding Globulin and the Risk of Incident Vertebral Fractures in Elderly Men and Women: The Rotterdam Study. In The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 8:3261-3269, 2004. Ref Type: Journal (Full).

4. Johnell O, Kanis JA, Odén A, et.al. Mortality after osteoporotic fractures. In Osteoporosis Int , 15:38-42, 2004.

Ref Type: Journal (Full).

5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.