HTLV (Human T-cell Lymphotropic Viruses) este un oncovirus ARN care face parte din familia retrovirusurilor si este responsabil de leucemiile cu celule T, limfoamele cutanate, pareza spastica tropicala si alte afectiuni caracterizate prin demielinizare. Tumorile sunt  provocate de expansiunea clonala a unei celule care contine genomul proviral integrat. Oncogeneza HTLV este initiata de o alterare a genomului gazda mediata de o proteina virala tax. Modificarile procesului de reglare a proliferarii determina o susceptibilitate crescuta a celulelor infectate la mutatii si transformare maligna. Numarul redus de tumori determinate de HTLV arata ca infectia virala este necesara dar nu suficienta pentru oncogeneza.

Au fost descrise doua tipuri virale: HTLV-1 si 2.  Acestea au tropism pentru limfocitele CD4 si se pot transmite prin contact sexual, produse de sange, administrare intravenoasa de droguri, transplacentar si prin laptele matern.

HTLV-1 a fost izolat in 1980 de la un pacient cu limfom cutanat cu celule T, in timp ce HTLV-2 a fost identificat la un pacient cu leucemie cu celule paroase in 1982¹. 

Infectia cu HTLV-1 este endemica in Japonia de sud-vest, Caraibe, Malaezia, si o anumita parte din Africa, unde procentul de pacienti seropozitivi este de 15% din populatia generala. Un procent mai mic de bolnavi au un istoric de administrare intravenoasa de droguri sau transfuzii de sange. Infectia HTLV-1 poate cauza doua boli: leucemia /limfomul cu celule T a/al adultului si o boala neurodegenerativa cronica, cunoscuta sub numele de mielopatie asociata cu HTLV-1 (HAM) sau parapareza spastica tropicala (TSP). Mai recent, infectia cu HTLV de tip 1 a fost asociata cu leucemii limfocitare cronice cu celule T si B (LLC), mielom multiplu, unele cazuri de limfom non-Hodgkin, mycosis fungoides, polimiozita, artrita, sarcom Kaposi, uveita, strongiloidoza.

Tipul 1 de HTLV este neomogen raspandit in intreaga lume, spre deosebire de tipul 2, care se gaseste mai frecvent in America de Nord, de Sud si Centrala. Acesta din urma a fost izolat pentru prima data de la un pacient cu leucemie limfocitara cu celule paroase, insa lipsesc dovezile stiitifice care sa stabileasca relatia de cauzalitate dintre virus si boala. Studii clinice efectuate recent sugereaza ca HTLV-2 este asociat cu leucemii si limfoame, dar si afectiuni neurodegenerative, ca parapareza spastica sau ataxia. Un numar semnificativ de persoane HTLV-2 seropozitive se inregistreaza in randul consumatorilor de droguri intravenoase^1;4.

Recomandari pentru determinarea HTLV - pacienti cu tablou clinic de leucemie/limfom cu celule T a/al adultului sau HAM care prezinta factori de risc pentru infectia HTLV (consumatori de droguri iv, persoane cu parteneri sexuali multipli sau provenite din zone endemice); miopatie sau mielopatie de cauza neprecizata^1;4. 

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate)².

Specimen recoltat - sange venos².

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator².

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare².

Volum proba - 1 mL ser²

Cauze de respingere a probei - specimen hemolizat; specimen expus la temperaturi ridicate; specimen contaminat bacterian².

Stabilitate proba - serul este stabil 3 zile la 25°C;10 zile la 2-8°C; timp indelungat la -20°C; evitati decongelarea/recongelarea².

Metoda – imunoenzimatica (EIA)².

Valori de referinta - anti-HTLV 1+2 negativ².

Interpretarea rezultatelor

Un rezultat pozitiv al testului de screening este sugestiv pentru o infectie cu HTLV-1 sau HTLV-2, dar cu toate acestea infectia nu poate fi confirmata cu certitudine si nici nu se poate face diferentierea intre cel doua tipuri de virus, din acest motiv fiind necesare teste suplimentare⁴.

Limite si interferente

Acest test nu este destinat pentru screening-ul donatorilor de celule umane, tesuturi sau organe solide.

Un rezultat negativ la testele de screening nu exclude posibilitatea prezentei infectiei cu HTLV-1 sau HTLV-2, deoarece in perioada timpurie de infectare nivelele de anticorpi pot fi nedetectabile⁴.

Bibliografie

1. Cernescu C. Retroviridae. In Virusologie medicala, Editura medicala, 2008, 186-188.

2. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Human T-Cell Lymphotropic Virus 1, 2 (HTLV-1/HTLV-2) Antibodies, Preliminary Test With Confirmation www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

4. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. HTLV-I/II Antibody, WB (CSF). www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.

Virusul hepatitei E (HEV), recent inclus in genul Hepevirus al familiei Hepeviridae, cauzeaza o infectie acuta, de obicei, autolimitanta. Este un virus sferic, lipsit de invelis, cu diametru de 27-34 nm, alcatuit dintr-un genom ARN monocatenar cu polaritate pozitiva. Sunt descrise 4 genotipuri majore si un singur serotip. Genomul prezinta 3 cadre de citire (open reading frames = ORF): ORF1 codifica metiltransferaza, proteaza, helicaza si replicaza; ORF 2 codifica proteina capsidei; ORF3 codifica o proteina a carei functie nu a fost definita⁴.

HEV se transmite pe cale fecal-orala; consumul de apa potabila contaminata cu fecale este responsabil de aparitia majoritatii epidemiilor. Transmiterea directa de la o persoana la alta este neobisnuita. Transmiterea pe cale sexuala sau prin transfuzii nu a fost dovedita^1;4.

Hepatita cu virus hepatitic E este endemica in Asia de sud-est si centrala, cu mai multe focare in Orientul Mijlociu, Africa de nord si de vest si Mexic, datorita conditiilor de igiena deficitara.  In tarile dezvoltate infectiile HEV apar in special la persoanele care au calatorit in zonele unde boala este endemica.

Recent au fost descrise in tarile industrializate cazuri de infectii HEV sporadice, in absenta calatoriilor in strainatate, adesea cu evolutie subclinica sau asimptomatica. Majoritatea acestor cazuri denumite “autohtone” sunt asociate cu genotipul 3 HEV care prezinta o omologie marcata a secventelor cu genotipul 3 izolat de la porcine. Se ia astfel in considerarea posibilitatea unor infectii zoonotice transmise de la porcine sau alte animale. Cazurile severe apar la adultii tineri sau de varsta mijlocie (3%), dar mortalitatea este scazuta, cu exceptia femeilor gravide infectate in ultimul trimestru de sarcina (mortalitate aproximativ 20%).

Tabloul clinic este asemanator celui din hepatita A. Dupa o perioada de incubatie ce dureaza intre 15 si 60 de zile, pacientii infectati cu HEV dezvolta semne si simptome de hepatita (febra, hepatomegalie, cresterea moderata a transaminazelor), cu aparitia anticorpilor anti-HEV de tip IgM in ser, urmate de nivele detectabile de anticorpi anti-HEV IgG in termen de cateva zile. Anticorpii anti-HEV IgM pot ramane pozitivi pana la 6 luni de la debutul simptomelor, in timp ce anticorpii de tip IgG persista, de obicei, ani de la infectie. Viremia si excretia virusului in fecale apar in faza preicterica si continua si in faza clinica. Urmarirea pe termen indelungat a pacientilor cu hepatita E acuta a infirmat posibilitatea cronicizarii infectiei si existenta starii de carrier^1;2;3.

Recomandari pentru determinarea HEV:

-detectarea infectiei recente cu virus hepatitic E;

-monitorizarea pacientilor postinfectie³. 

Pregatire pacient - preferabil à jeun (pe nemancate)¹.

Specimen recoltat - sange venos¹.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator¹.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare in ziua recoltarii¹.

Volum proba - minim 2 mL ser¹.

Cauze de respingere a probei -  specimen intens hemolizat; specimen contaminat bacterian¹.

Stabilitate proba - serul este stabil 6 zile in conditii ambientale; 7 zile la 2-8°C; timp indelungat la -20°C; evitati decongelarea/recongelarea repetata¹.

Metoda – Imunoblot

Testul utilizeaza antigene recombinate purificate, relevante serologic, care sunt separate pe baza greutatii moleculare prin electroforeza in gel de poliacrilamida in prezenta de sodium dodecil sulfat (SDS-PAGE) si transferate ulterior electroforetic pe o membrana de nitroceluloza (Western blotting). Situsurile de legare libere de pe membrana sunt saturate cu o solutie de proteine, dupa care matricea este spalata si taiata in fasii (strip-uri). Sunt detectati separat anticorpii de tip IgG si IgM. Selectarea proteinelor omoloage de la doua genotipuri diferite (genotipul 1 si 3) asigura o sensibilitate inalta chiar si pentru cazurile de infectie provenite din zonele non-endemice (“autohtone”). Testul detecteaza cele 4 genotipuri HEV si poate fi folosit atat pentru screening-ul cat si pentru confirmarea infectiei.

Antigenele sunt reprezentate, in ordinea fixarii pe strip, de:

-O2N: portiunea N-terminala a proteinei ORF2;

-O2C: portiunea C-terminala a proteinei ORF2;

-O2M: portiunea mijlocie a proteinei ORF2;

-O3: proteina ORF3.

Intr-o prima etapa strip-ul incarcat cu antigenele HEV este incubat impreuna cu serul diluat al pacientului. Dupa o etapa de spalare, strip-ul este incubat, in functie de clasa de anticorpi testata, cu un conjugat anti-IgG sau anti-IgM uman marcat cu peroxidaza. Conjugatul se va atasa la complexul antigen-anticorp format. Dupa indepartarea prin spalare a conjugatului nelegat se adauga solutia de colorare – un sistem de detectie enzimatica colorimetrica care contine peroxid de hidrogen. Daca este prezent conjugatul legat, reactia enzimatica va genera un produs colorat albastru-inchis la nivelul benzilor ocupate de anticorpii specifici. Astfel, benzile vizualizate sunt rezultatul legarii anticorpilor specifici de antigenele individuale recombinate de la nivelul strip-ului¹.

Valori de referinta  si interpretarea rezultatelor

Fiecare strip contine in partea superioara o banda de control care reprezinta controlul reactiei necesar pentru a confirma efectuarea corecta a testului.

Intensitatea benzilor probelor este comparata cu cea a benzii O2C a controlului slab pozitiv inclus obligatoriu la fiecare rulare. Sunt posibile urmatoarele exprimari semicantitative:

 Interpretarea definitiva a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (dupa scanarea strip-urilor) care in functie de intensitate (de la – la  ++) acorda un punctaj pentru fiecare banda a strip-ului de la 0 la 3.

 In final este calculata suma  punctelor acordate si se va genera rezultatul testului¹:

Obtinerea unui rezultat pozitiv pentru anticorpii anti-HEV de tip IgM confirma diagnosticul de infectie recenta (in ultimele 6 luni).

Obtinerea unui rezultat pozitiv pentru anticorpii anti-HEV de tip IgG indica o infectie in antecedente sau o infectie acuta in faza de covalescenta.

In cursul infectiei acute se inregistreaza o reactivitate a anticorpilor anti-HEV IgG cu toate componentele proteice ORF2 si ORF3. Intensitatile benzilor O2N si O3 scad in timp, insa intensitatea benzii O2C creste progresiv, astfel ca in cazul infectiilor vechi anti-HEV IgG sunt indreptati in principal asupra portiunii C-terminale a proteinei ORF2³.

Limite si interferente

Obtinerea unui rezultat negativ pentru anticorpii anti-HEV de tip IgM nu exclude intotdeauna o infectie recenta (in ultimele 6 luni) deoarece  acestia sunt prezenti in medie 6-7 saptamani de la debutul infectiei (dar nu mai mult de 6 luni) la aproximativ 80% din pacientii infectati. La restul bolnavilor diagnosticul este stabilit in urma detectiei ARN viral in ser sau materii fecale.

In unele cazuri anticorpii anti-HEV de tip IgG apar la 2-4 saptamani de la debutul clinic si de aceea testarea trebuie repetata pentru confirmarea prezentei anticorpilor specifici^2;3.

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog

2.Lothar Thomas. Hepatitis E. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998,1282-1284.

3.Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. Hepatitis E Antibody, IgM, IgG , Serum. www.mayomedicallaboratories.com.  Ref Type: Internet Communication.

4.Panda SK, Thakral SA, Rehman S. Hepatitis E virus. In Rev Med Virol  2007, 17(3):151-180. 

Acest test este util pentru a confirma prezenta anticorpilor IgG specifici fata de virusul hepatitei C in probele de ser care au dat rezultate reactive (pozitive) la testele screening anti-HCV (efectuate prin tehnici ELISA sau similare acestora). Este folosit mai ales in bancile de sange. Spre deosebire de testele screening, testul de confirmare permite, prin separarea electroforetica a antigenelor, o detectare a anticorpilor asociati cu diferite etape ale infectiei^1;2;3;4;5.

Datorita imbunatatirii performantei testelor screening si dezvoltarii tehnicilor moleculare testul de confirmare este din ce in ce mai mult rezervat cazurilor in care s-au obtinut rezultate slab pozitive la etapa de screening^1;3.

Pregatire pacient - preferabil à jeun (pe nemancate)⁴.

Specimen recoltat - sange venos⁴.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator⁴.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare in ziua recoltarii⁴.

Volum proba - minim 2 mL ser⁴.

Cauze de respingere a probei -  specimen intens hemolizat; specimen contaminat bacterian⁴.

Stabilitate proba - serul este stabil 6 zile in conditii ambientale; 7 zile la 2-8°C; timp indelungat la -20°C; evitati decongelarea/recongelarea repetata⁴.

Metoda - Imunoblot

Testul utilizeaza 5 antigene HCV recombinate purificate, relevante serologic, care sunt separate pe baza greutatii moleculare prin electroforeza in gel de poliacrilamida in prezenta de sodium dodecil sulfat (SDS-PAGE) si transferate ulterior electroforetic pe o membrana de nitroceluloza (Western blotting). Situsurile de legare libere de pe membrana sunt saturate cu o solutie de proteine, dupa care matricea este spalata si taiata in fasii (strip-uri). Antigenele sunt reprezentate, in ordinea fixarii pe strip, de:

-NS-3: proteina non-structurala cu activitate de helicaza virala si proteaza;

-Helicaza: proteina non-structurala/parte din NS3 cu activitate de helicaza virala;

-NS-5-12: proteina non-structurala/parte din NS5 (ARN polimeraza);

-NS-4: proteina non-structurala/partea N-terminala a NS4 cu functie neprecizata;

-Core: proteina structurala care formeaza cea mai mare parte a nucleocapsidei virale.

Intr-o prima etapa strip-ul incarcat cu antigenele HCV este incubat impreuna cu serul diluat al pacientului. Daca in ser sunt prezenti anticorpi specifici acestia se vor lega de antigenele corespunzatoare de pe strip. Dupa o etapa de spalare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu peroxidaza. Conjugatul se va atasa la portiunea IgG a complexului antigen-anticorp. Dupa indepartarea prin spalare a conjugatului nelegat se adauga solutia de colorare – un sistem de detectie enzimatica colorimetrica care contine peroxid de hidrogen si 4-cloro-1-naftol. Daca este prezent conjugatul legat reactia enzimatica va genera un produs colorat albastru-inchis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legarii  de anticorpilor specifici de antigenele individuale recombinate de la nivelul strip-ului⁴.

Valori de referinta  si interpretarea rezultatelor

Intensitatea benzilor probelor este comparata cu cea a benzii antigenului core a controlului slab pozitiv inclus obligatoriu la fiecare rulare. Sunt posibile urmatoarele exprimari semicantitative

Interpretarea definitiva a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (dupa scanarea strip-urilor) care in functie de intensitate (de la +/- la  ++) acorda un punctaj pentru fiecare banda a strip-ului, astfel:

 In final este calculata suma  punctelor acordate si se va genera rezultatul testului⁴:

Un rezultat pozitiv confirma prezenta anticorpilor specifici anti-HCV datorati unei infectii in antecedente sau cronice.

Un rezultat echivoc indica faptul ca prezenta anticorpilor anti-HCV este incerta; testul trebuie repetat la un interval de 1-2 luni pentru a determina statusul definitiv anti-HCV. Sunt posibile urmatoarele situatii in cazul unui rezultat echivoc:

-reactivitate specifica in cursul fazei de seroconversie (la repetarea testului se va obtine un rezultat pozitiv);

-productia limitata a unui anticorp specific la pacienti imunodeprimati;

-reactivitate nespecifica.

Rezultatele echivoce trebuie interpretate in contextul clinic si epidemiologic al  pacientului (existenta factorilor de risc pentru infectia HCV). La pacientii imunodeprimati cu risc crescut de a dezvolta infectie dar care prezinta un rezultat echivoc la testul de confirmare se indica ARN viral hepatita C.

Un rezultat negativ indica absenta anticorpilor specifici anti-HCV si un rezultat fals-pozitiv la testele screening^1;2;3.

Analiza raspunsului imun dupa o infectie HCV recenta indica faptul ca anticorpii fata de NS3 si antigenul core apar in mod obisnuit cu cateva saptamani inaintea anticorpilor anti- NS4 si NS5. In timp ce anticorpii anti-NS3 sunt aproape intotdeauna detectabili, anticorpii fata de antigenul core pot fi initial absenti, in special in cazul infectiilor auto-limitante sau asimptomatice, si la aproximativ o treime din pacienti nu apar decat in faza cronica.

In infectia HCV cronica apare de obicei intreaga paleta de anticorpi. Cu toate acestea, intensitatea benzilor variaza semnificativ in  decursul infectiei. In eventualitatea unui spectru incomplet de benzi, care este intalnit  in special la pacientii imunodeprimati, anticorpii anti-NS4 si anti-NS5 sunt in mod obisnuit absenti.

Dupa vindecarea infectiei HCV anticorpii specifici dispar de obicei in decurs de cativa ani; anticorpii fata de antigenul core persista cel mai mult².

Limite si interferente

O banda NS4 izolata reprezinta cel mai adesea o reactie nespecifica. Benzi NS3 sau NS4 izolate pot fi depistate in serul unor pacienti carora li s-a administrat sange sau alte derivate².

Bibliografie

1. ARUP Laboratories. Test Directory. Hepatitis C Virus Antibody, RIBA. www.aruplab.com. Ref Type: Internet Communication, 2010.

2. Gert Frösner. Viral hepatitis. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. Lothar Thomas. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany,1 ed. 1998, 1275-1276.

3. Guidelines for Laboratory Testing and Result Reporting of Antibody to Hepatitis C Virus. CDC. Morbidity and Mortality Weekly Report; February 7, 2003 / Vol. 52 / No. RR-3.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog

Virusul imunodeficientei umane (HIV), agentul etiologic al sindromului imunodeficientei umane dobandite (SIDA), este un retrovirus, care are capacitatea de a infecta si distruge limfocitele T helper⁴.

Exista doua tipuri de HIV, fiecare cu mai multe subtipuri, diferentiate pe zone geografice:

HIV-1

• mai virulent;

• responsabil de epidemia globala actuala;

• severitatea infectiei variaza de la o persoana la alta;

HIV-2

• descoperit initial in vestul Africii;

• transmiterea nu este atat de eficienta ca in cazul HIV-1;

• genomul sau este mai inrudit cu genomul SIV decat in cazul HIV-1.

HIV se transmite prin sange contaminat si derivate de sange, prin contact sexual si de la mama infectata la copil, in timpul si dupa nastere. Principalele grupe de risc sunt: homosexualii, hemofilicii si primitorii de sange, prostituatele, toxicomanii care folosesc droguri injectabile, personalul medico-sanitar³.

In ceea ce priveste infectia neonatala, 40% dintre sugarii nascuti de mame infectate dobandesc infectia HIV si 30% dintre sugarii infectati sunt pozitivi la nastere (ARN-HIV prezent), element ce sugereaza infectie in utero, in timp ce 75% sunt HIV-negativi la nastere, dar pozitivi dupa 7 zile, ceea ce sugereaza infectie intrapartum. >90% dintre sugarii infectati sunt HIV-pozitivi la 14 zile⁴.

Depistarea gravidelor HIV-pozitive este esentiala pentru prevenirea transmiterii infectiei la fat. ACTG 076 a fost primul studiu clinic care a demonstrat eficienta terapiei antiretrovirale in prevenirea transmiterii verticale a infectiei. Astfel administrarea orala de zidovudin (AZT) in saptamanile 14-34 de sarcina, urmata de administrarea intravenoasa de AZT in cursul travaliului reduce rata de transmitere a infectiei cu 67%¹.

Evolutia infectiei HIV se desfasoara in decurs de cel mult 10 ani, finalul survenind prin SIDA, al carui sfarsit letal se consuma in cateva luni sau ani de la debutul bolii⁴.

Productia de anticorpi este detectabila dupa 4-12 saptamani de la infectie si dureaza toata viata³.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate)².

Specimen recoltat - sange venos².

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator².

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare².

Volum proba - minim 0.5 mL ser²

Cauze de respingere a probei - specimen hemolizat; specimen expus la temperaturi ridicate; specimen contaminat bacterian².

Stabilitate proba - serul este stabil 3 zile la 25°C;10 zile la 2-8°C; timp indelungat la -20°C; evitati decongelarea/recongelarea².

Metoda - imunochimica cu detectie prin electrochemiluminiscenta (ECLIA)².

Testul HIV combi este un test de generatia a 4-a care combina detectia anticorpilor HIV cu cea a antigenului. Sunt recunoscute astfel toate grupele si subtipurile majore de HIV-1, inclusiv divergentul grup O si HIV-2. Detectia simultana a antigenului si anticorpilor conduce la o sensibilitate clinica mai mare in faza precoce de seroconversie. In plus permite o identificare mai buna a pacientilor aflati in stadiu avansat al bolii, care prezinta modificari ale antigenemiei si sintezei de anticorpi.

Obtinerea unui rezultat reactiv impune confirmarea prin testul Western blot².

Valori de referinta - anti-HIV 1+2 negativ².

Limite si interferente

Exista o “fereastra serologica” (6-12 saptamani de la contactul infectant), adica o perioada cand HIV se gaseste in sange si celelalte produse, dar anticorpii nu au aparut inca. Acest sange donat poate transmite HIV!

Anticorpii de tip IgG traverseaza placenta in cursul ultimului trimestru de sarcina; toti sugarii nascuti de catre mame infectate cu HIV-1 sunt seropozitivi pentru HIV-1 timp de aproximativ 18 luni. Datorita transferului pasiv de anticorpi materni anti-HIV, testele serologice sunt dificil de interpretat la sugari. Metoda de electie pentru diagnosticul infectiei neonatale este PCR pentru ARN HIV⁴.

• Interferente analitice

Pot produce interferente cu unele componente ale kit-ului si conduce la rezultate eronate urmatoarele:

- tratamentul cu biotina in doze mari (>5 mg/zi); de aceea se recomanda ca recoltarea de sange sa se faca dupa minimum 8 ore de la ultima administrare;

- titrurile foarte crescute de anticorpi anti-streptavidina si anti-ruteniu;

- anticorpii monoclonali proveniti de la soarece administrati la unii pacienti in scop diagnostic sau terapeutic.

Bibliografie

1. Ann M. Gronowski. Screening and Diagnosis of Congenital Infections. In Handbook of Clinical Laboratory Testing During Pregnancy. Totowa, NJ: Humana Press ed. 2004, 258-260.

2. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

3. Lothar Thomas. Viral Diseases. In Clinical Laboratory Diagnostics – Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Ed. 1, 1998, 1240-1243.

4. Wallach J. Sindromul imunodeficientei dobandite (SIDA). In Interpretarea testelor de diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, Ed.7, 2001, 1088-1090.

In coinfectiile VHB – VHD, autolimitante, anticorpii anti-HD sunt in multe cazuri nedetectabili, deoarece titrul lor este foarte scazut si au o remanenta scurta⁴.

In cazul suprainfectiei cu VHD, detectarea anticorpilor poate fi negativa la scurt timp dupa instalarea bolii; cu toate acestea se produce o seroconversie pana in saptamana 4 de la debut. In cazurile in care se produce tranzitia catre infectia cronica, se depisteaza in mod obisnuit titruri persistent crescute de anticorpi dupa 4-6 luni de la debutul bolii.

Determinarea anticorpilor anti-HD reprezinta cel mai important test de screening al hepatitei cronice D, iar anticorpii sunt aproape intotdeauna prezenti in titru mare³.

Recomandari pentru determinarea anti-HD

• diagnosticul infectiei acute/cronice cu VHD;

• diagnosticul postinfectiilor cu VHD².

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate)¹.

Specimen recoltat - sange venos¹.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator¹.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare; se lucreaza imediat; daca acest lucru nu este posibil, serul se pastreaza la 2-8°C sau la -20°C¹.

Volum proba - minim 0.5 mL ser¹

Cauze de respingere a probei - specimen hemolizat; specimen expus la temperaturi ridicate; specimen contaminat bacterian; specimen care contine azida de sodiu¹. 

Stabilitate proba - serul este stabil 24 ore la 2-8°C; timp indelungat la -20°C; evitati decongelarea/recongelarea¹.

Metoda - ELISA¹.

Valori de referinta – anti-HD negativ¹.

Limite si interferente

O infectie cu VHD este foarte rara in absenta AgHBs (la personele cu abuz de droguri administrate i.v.). Pentru diagnosticul acestei conditii este nevoie sa se determine ARN-VHD. Se pare ca aceasta anomalie se datoreaza in principal unei replicari a VHB sub limita de detectie sau poate fi indusa si de infectia cu un VHB mutant care produce un rezultat fals negativ la testarea AgHBs (mutanti virali care scapa diagnosticului).

La pacientii cu imunodeficienta sinteza anticorpilor anti-HD poate scadea sub limita de detectie³.

•  Interferente analitice

Contaminarea bacteriana sau inactivarea prin caldura a probelor poate afecta valorile absorbantelor si prin urmare poate conduce la rezultate eronate; trebuie evitata adaugarea de conservanti la probe deoarece acestia pot afecta activitatea enzimatica a kitului¹.

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referinþele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

2. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

3. Lothar Thomas. Hepatitis D. In Clinical Laboratory Diagnostics – Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998, 1279-1280.

4. Wallach J. Afectiuni hepatobiliare si pancreatice. In Interpretarea testelor de diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, Ed.7, 2001, 324-326.

Virusul hepatitei C (VHC) este raspunzator de  aproximativ 20% din hepatitele acute, 60-70 % din hepatitele cronice si aproximativ 30% din cirozele si cancerele hepatice.

VHC, depistat in 1989, este un virus ARN din genul Flavivirus, familia Togaviridae, cu dimensiuni intre 40-60 nm si cu un continut preponderent lipidic. Exista 6 genotipuri majore si 50 de serotipuri de VHC. Cunoasterea genotipului sau serotipului (anticorpii specifici genotipului) de VHC este utila in recomandarea si conducerea tratamentului. VHC este transmis prin contactul cu sange sau produse de sange infectat: transfuzii, folosirea acelor si seringilor de la o persoana la alta, fara sterilizare sau insuficient sterilizate, tatuarea corpului, vaccinarea cu echipament nesterilizat, folosirea in comun a periutei de dinti, aparatului de barbierit, pensetei, trusei de manichiura. Este prezent si in medii biologice (saliva, lapte, secretii vaginale, sperma etc.), dar in concentratie mai mica decat virusul B. Se poate transmite si de la mama la fat^2;5. Rata de transmisie verticala la gravidele cu anti-HCV pozitiv a fost estimata la 2.7-4.4%, aceasta rata atingand valori de 5.4-8.6% la gravidele care au coinfectie VHC – HIV¹.

Este bine de stiut faptul ca virusul nu se transmite prin folosirea in comun a veselei, piscinelor si toaletelor².

Aproximativ 85% din formele acute se cronicizeaza.

Dintre purtatorii cronici, cu sau fara valori serice anormale de ALT,

•  ~ 15% se vindeca;

•  ~ 70% dezvolta hepatita cronica (interval mediu 10 ani);

•  ~ 10-20% dezvolta ciroza (interval mediu 20 ani);

•  ~ 50% mor din cauza infectiei cu VHC.

Carcinomul hepatocelular poate aparea la cca. 20% din pacientii cu ciroza (interval mediu 30 ani) si la 1-5% din cei infectati cu VHC⁵.

Testele diagnostice pentru depistarea infectiei cu VHC sunt de 2 categorii:

I – teste serologice pentru depistarea anticorpilor;

II – teste moleculare pentru detectarea particulelor virale.

Debutul este insidios, virusul  fiind numit si “bomba cu efect intarziat”.

“Fereastra serologica” intre infectia VHC si detectarea anti-HCV variaza de la pacient la pacient.

Cu testele serologice curente anticorpii se depisteaza in medie la 7-8 saptamani de la debutul infectiei. In cazul eradicarii spontane a infectiei, anti-HCV pot sa persiste toata viata sau sa scada treptat pana la disparitie in cativa ani. La pacientii cu infectie cronica anti-HCV persista indefinit. In populatia cu risc scazut procentul de persoane care scapa diagnosticarii este de 0.5-1%.

Rezultatele pozitive trebuie confirmate printr-o analiza suplimentara – RIBA (recombinant immunoblot assay) care sa indice rectivitatea fata de 2 antigene virale.

O data cu imbunatatirea testelor screening si a tehnicilor moleculare, confirmarea prin RIBA devine din ce in ce mai putin necesara (exceptie bancile de sange).

Testarea pentru ARN-VHC (prin PCR) confirma diagnosticul si cuantifica numarul de copii virale in sange (viremie). Aproape toti pacientii cu infectie cronica au ARN-VHC detectabil in sange^4;5.

Recomandari pentru determinarea anti-HCV

•  diagnosticul de infectie acuta/cronica sau in antecedente cu virusul hepatitei C;

•  screening-ul produselor de sange si al donatorilor;

•  screening-ul prenatal, in scopul prevenirii transmiterii infectiei la fat^1;4.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate)³.

Specimen recoltat - sange venos³.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator³.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare. Se lucreaza imediat, daca acest lucru nu este posibil, serul se pastreaza la 2-8°C sau la -20°C³.

Volum proba - minim 0.5 mL ser³

Cauze de respingere a probei -  specimen hemolizat; specimen expus la temperaturi ridicate; specimen contaminat bacterian; specimen care contine azida de sodiu³.

Stabilitate proba - serul este stabil 5 zile la 2-8°C; timp indelungat la -20°C; evitati decongelarea/recongelarea³.

Metoda - imunochimica cu detectie prin electrochemiluminiscenta (ECLIA).

Testul utilizeaza antigene derivate dintr-o proteina structurala (core) si 2 proteine non-structurale (NS3 si NS4) ale VHC; NS3 – antigenul imunodominant VHC – este obtinut prin recombinare genetica si este “reinfasurat” pentru a se obtine o activitate imunologica crescuta; testul prezinta o sensibilitate mare fata de toate cele 6 genotipuri provenite din arii geografice diferite³.

Valori de referinta - anti-HCV negativ³.

Limite si interferente

Rezultate fals negative pot fi intalnite la imunodeprimati (HIV pozitivi), pacienti cu insuficienta renala, crioglobulinemie mixta esentiala, in caz de congelari si decongelari repetate sau depozitare prelungita a esantioanelor de sange.

Rezultate fals pozitive, chiar si pentru testele de generatia a 3-a, pot sa apara in boli autoimune (80% dintre cazurile de hepatita cronica activa autoimuna), poliarterita nodoasa, prezenta de factor reumatoid, hipergamaglobulinemie, paraproteinemie, transfer pasiv de anticorpi, anticorpi antisuperoxid dismutaza (o enzima umana utilizata in procesul de clonare)⁵.

Detectarea anticorpilor anti-HCV nu permite distinctia dintre o infectie curenta si o infectie in antecedente. Pentru confirmarea diagnosticului de infectie activa cu virusul hepatitei C este necesara efectuarea ARN-VHC⁴.

Intr-un procent redus de cazuri se poate obtine un rezultat slab pozitiv pentru anti-HCV (analizorul indica o valoare apropiata de valoarea cut-off a pozitivitatii); in aceste cazuri este folosita si o metoda alternativa de testare (ELISA). Laboratorul va comunica astfel de situatii, cu recomandarea de a se verifica specificitatea anticorpilor anti-HCV prin testul de confirmare Western blot³.

Bibliografie

1. Ann M. Gronowski. Screening and Diagnosis of Congenital Infections. In Handbook of Clinical Laboratory Testing During Pregnancy. Totowa, NJ: Humana Press ed. 2004, 257.

2. Georg M. Lauer, Bruce D.Walker. Hepatitis C Virus Infection. In N Engl J Med 345, 41-50. 2001. Ref Type: Journal (Full).

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

4. Lothar Thomas. Hepatitis C. In Clinical Laboratory Diagnostics – Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998, 1273-1276.

5. Wallach J. Afectiuni hepatobiliare si pancreatice. In Interpretarea testelor de diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, Ed. 7, 2001, 316-323.

Hepatita virala B se vindeca in totalitate la 90% dintre pacienti in decurs de 12 saptamani, cu disparitia AgHBs si aparitia anticorpilor protectori anti-HBs¹.

Anti-HBs sunt prezenti in ser la 4-6 luni de la debutul bolii si raman detectabili la 80-90% dintre pacientii cu virusul eliminat⁴.

Prezenta anticorpilor anti-HBs fara AgHBs detectabil indica vindecarea dupa o infectie cu VHB, absenta contagiozitatii si imunitate fata de o infectie ulterioara cu VHB; in caz de expunere, pacientul nu necesita administrarea de gamaglobuline; sangele lui poate fi transfuzat^1;4.

Anti-HBs apar si dupa transfuzii prin transfer pasiv^1;4.

Prezenta anti-HBs poate fi utilizata pentru a demonstra eficienta programelor de imunizare. Apar la 90% dintre adultii sanatosi dupa administrarea a 3 doze imunizante; 30-50% dintre acestia pierd anticorpii dupa 7 ani si necesita revaccinare^1;4.

Recomandãri pentru determinarea anti-HBs

•  monitorizarea evolutiei infectiei acute cu hepatita B;

•  monitorizarea eficientei programelor de imunizare^1;4.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate)².

Specimen  recoltat - sange venos².

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator².

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare; se lucreaza imediat; daca acest lucru nu este posibil, serul se pastreaza la 2-8°C sau la -20°C².

Volum proba - minim 0.5 mL ser².

Cauze de respingere a probei - specimen hemolizat; specimen lipemic; specimen expus la temperaturi ridicate; specimen contaminat bacterian².

Stabilitate proba - serul este stabil 6 zile la 2-8°C; timp indelungat la -20°C; evitati decongelarea/recongelarea².

Metoda - imunochimica cu detectie prin electrochemiluminiscenta (ECLIA)².

Valori de referinta  - <10 UI/L².

Limite si interferente

Un numar mic de persoane dobandesc o infectie cu VHB dupa ce au dezvoltat un titru ridicat de anticorpi anti- HBs datorita unui VHB mutant.

In hepatita fulminanta anticorpii apar precoce si pot coexista cu un titru scazut de antigene.

La purtatorii cronici nu este prezent nici nu anticorp de tip IgM, dar titrul antigenelor este foarte ridicat¹.

•  Interferente analitice

Pot produce interferente cu unele componente ale kit-ului si conduce la rezultate neconcludente urmatoarele:

- tratamentul cu biotina in doze mari (>5 mg/zi); de aceea se recomanda ca recoltarea de sange sa se faca dupa minimum 8 ore de la ultima administrare;

- titrurile foarte crescute de anticorpi anti-streptavidina si anti-ruteniu².

Bibliografie

1. Jacques Wallach. Hepatita B (Anti-HBs). In Interpretarea testelor de diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, Ed. 7, 2001, 312-315.

2. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Hepatitis B Surface Antibody. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

4. Lothar Thomas. Hepatitis B (Antibodies to HBsAg). In Clinical Laboratory Diagnostics – Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998, 1266-1268.

Anti-HBe apar dupa disparitia AgHBe si raman detectabili timp indelungat. Indica scaderea gradului de contagiozitate si sugereaza un prognostic bun in ceea ce priveste rezolutia infectiei acute. Asocierea cu anti-HBc, in absenta AgHBs si a anti-HBs, confirma diagnosticul de infectie acuta recenta (2-16 saptamani).

Investigarea anti-HBe nu este recomandata pentru determinarea prevalentei infectiei cu VHB, avand in vedere ca anti-HBe se intalnesc mult mai rar decat anticorpii anti-HBc sau anti-HBs. Practic toate serurile anti-HBe pozitive, sunt si anti-HBc pozitive.

Atat testarea AgHBe cat si a anti-HBe se recomanda doar la serurile AgHBs pozitive³.

In cursul terapiei cu interferon, disparitia antigenului HBe si aparitia anticorpilor anti-HBe constituie un element de prognostic favorabil².

Recomandari pentru determinarea anti-HBe

•  investigarea gradului de infectiozitate a serului;

•  monitorizarea infectiilor cu hepatita B acuta sau cronica².

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate)¹.

Specimen recoltat - sange venos¹.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator¹.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare; se lucreaza imediat ; daca acest lucru nu este posibil, serul se pastreaza la 2-8°C sau la -20°C¹.

Volum proba - minim 0.5 mL ser¹

Cauze de respingere a probei – specimen hemolizat; specimen expus la temperaturi ridicate; specimen contaminat bacterian¹.

Stabilitate proba - serul este stabil 5 zile la 2-8°C; timp indelungat la -20°C; evitati decongelarea/recongelarea¹.

Metoda - imunochimica cu detectie prin electrochemiluminiscenta (ECLIA)¹.

Valori de referinta - anti-HBe negativ¹.

Limite si interferente

Anticorpii anti-HBe nu sunt de obicei detectabili in infectii cu un VHB mutant, care nu produce antigen HBe.

In unele cazuri serul prezinta infectiozitate mare, desi sunt prezenti anti-HBe. Singura modalitate de a testa infectiozitatea serurilor AgHBe negative ramane determinarea ADN-VHB².

•  Interferente analitice

Pot produce interferente cu unele componente ale kit-ului si conduce la rezultate neconcludente urmatoarele:

- tratamentul cu biotina in doze mari (>5 mg/zi); de aceea se recomanda ca recoltarea de sange sa se faca dupa minimum 8 ore de la ultima administrare;

- titrurile foarte crescute de anticorpi anti-streptavidina si anti-ruteniu;

- anticorpii monoclonali proveniti de la soarece administrati la unii pacienti in scop diagnostic sau terapeutic¹.

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

2. Lothar Thomas. Hepatitis B. In Clinical Laboratory Diagnostics – Use and Assessment of Clinical

Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998, 1269-1270.

3. Wallach J. Afectiuni hepatobiliare si pancreatice. In Interpretarea testelor de diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, Ed.7, 2001, 313-317.

Anticorpii anti-HBc-IgM apar in ser in timpul proliferarii active a virusului hepatitei B. Ei pot fi detectati in titru ridicat pentru o scurta perioada de timp in cursul stadiului acut al bolii, interval ce acopera fereastra serologica, dupa care scad la niveluri joase, caracteristice fazei de convalescenta³. Titrul cel mai mare de anti-HBc-IgM este depistat in saptamanile 2-3 de boala. In majoritatea cazurilor acesti anticorpi raman detectabili o perioada mai mare de 2 luni si, intr-un procent redus, mai mult de 1 an, chiar in conditiile vindecarii hepatitei².

Impreuna cu anti-HBc pot fi singurii markeri serologici prezenti dupa ce AgHBs si AgHBe au disparut, dar inainte ca anticorpii corespunzatori sa fi aparut, si pot diferentia infectia acuta cu VHB de cea cronica.

Testele de determinare a anticorpilor anti – HBc – IgM se fac impreuna cu determinarile de antigen HBs, pentru identificarea infectiilor acute cu virusul hepatitei B³.

Anti – HBc – IgM pot fi detectati si in hepatita cronica B, insa aproape intotdeauna in titruri mici. In hepatita cronica B prezenta si titrul anti – HBc – IgM se coreleaza cu activitatea inflamatorie a bolii. Astfel anti-HBc-IgM pot fi utilizati in monitorizarea hepatitei B cronice, iar unii autori considera detectarea anti – HBc – IgM ca un semn favorabil in cursul tratamentului cu interferon².

Recomandari pentru determinarea anti – HBc – IgM 

•  diagnosticul hepatitei B acute;

•  monitorizarea hepatitei B cronice².

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate)¹.

Specimen recoltat - sange venos¹.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator¹.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare; se lucreaza imediat; daca acest lucru nu este posibil, serul se pastreaza la 2-8°C sau la -20°C¹.

Volum proba - minim 0.5 mL ser¹.

Cauze de respingere a probei – specimen hemolizat; specimen expus la temperaturi ridicate; specimen contaminat bacterian¹.

Stabilitate proba - serul este stabil 6 zile la 2-8°C; timp indelungat la -20°C; evitati decongelarea/recongelarea¹.

Metoda - imunochimica cu detectie prin electrochemiluminiscenta (ECLIA)¹.

Valori de referinta – anti – HBc – IgM negativ¹.

Limite si interferente

In cazul hepatitei B cronice, titrul mare al anticorpilor anti-HBc-IgG poate sa interfere cu determinarea

anti – HBc – IgM, dand rezultate fals pozitive, daca blocarea acestora este insuficienta². 

•  Interferente analitice

Pot produce interferente cu unele componente ale kit-ului si conduce la rezultate neconcludente urmatoarele:

-tratamentul cu biotina in doze mari (>5 mg/zi); de aceea se recomanda ca recoltarea de sange sa se faca dupa minimum 8 ore de la ultima administrare;

-titrurile foarte crescute de anticorpi anti-streptavidina si anti-ruteniu;

-anticorpii monoclonali proveniti de la soarece administrati la unii pacienti in scop diagnostic sau terapeutic¹.

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

2. Lothar Thomas. Hepatitis B. In Clinical Laboratory Diagnostics – Use and Assessment of Clinical

Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1998, 1268-1269.

3. Wallach J. Afectiuni hepatobiliare si pancreatice. In Interpretarea testelor de diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, Ed. 7, 2001, 313-317.