Electroforeza cu voltaj crescut sau focalizarea izolectrica a unui lichid cefalorahidian (LCR) concentrat prezinta utilitate in depistarea benzilor oligoclonale, definite ca doua sau mai multe benzi discrete distincte in regiunea gamma, ce sunt absente sau de intensitate mai redusa la electroforeza proteinelor serice efectuata simultan. Aceste benzi corespund unor gamaglobuline anormale produse de un numar limitat de clone celulare imunocompetente, fiecare dintre acestea sintetizand imunoglobuline G cu specificitate proprie^1;2;4.

Mai mult de 90% dintre pacientii cu scleroza multipla prezinta benzi oligoclonale in LCR intr-un anumit moment al evolutiei bolii, care insa nu se coreleaza cu activitatea procesului demielinizant sau vechimea afectiunii. Benzile oligoclonale pot fi decelate chiar si atunci cand nivelul IgG in LCR este normal^2;4.

Productia crescuta de IgG in sistemul nervos central nu este specifica sclerozei multiple, fiind indicatorul unui proces inflamator cronic. Astfel a fost raportata prezenta de benzi oligoclonale in LCR si in neurosifilis, meningita acuta bacteriana sau virala, leucoencefalita multifocala progresiva, nevrita optica, panencefalita sclerozanta subacuta, encefalita rubeolica progresiva, toxoplasmoza cerebrala, meningita criptococica, sindromul imunodeficientei dobandite (SIDA), tripanosomiaza, neuropatii inflamatorii, alte infectii si boli autoimune^1;2;4;5.

Deoarece in conditii normale 80% din proteinele din LCR provin din ser, pacientii cu  proteine monoclonale serice pot sa prezinte benzi corespunzatoare in LCR. In plus, benzi oligoclonale pot fi intalnite in serul pacientilor cu leucemii, limfoame, unele boli infectioase si inflamatorii, afectiuni autoimune precum si la unele persoane sanatoase (intr-un procent de pana la 5%). Din aceste motive testarea trebuie sa includa obligatoriu probe pereche, din ser si din LCR pentru compararea pattern-ului electroforetic^2;4.

Recomandari pentru determinarea benzilor oligoclonale – marker util in diagnosticul anumitor afectiuni SNC: scleroza multipla, neurosifilis, meningite, tumori⁴.

Pregatire pacient - se aduce la cunostinta pacientului procedura de recoltare³.

Specimen recoltat - se recolteaza obligatoriu 2 probe: 1) lichid cefalorahidian si 2) sange venos³.

Recipient de recoltare – 1) flacon steril; 2) vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator³.

Prelucrare  necesara dupa recoltare – 2) se separa serul prin centrifugare³

Volum minim proba – 1) 2 mL; 2) 1 mL³.

Cauze de respingere a probei – 2) ser hemolizat; plasma in loc de ser³.                       

Stabilitate proba - 7 zile la  2-8⁰C atat pentru ser cat si pentru LCR³.

Metoda – electroforeza cu focalizare izoelectrica; analiza include 2 etape: focalizarea pe gel de agaroza cu gradient de pH pentru separarea proteinelor in ser si LCR la punctul izoelectric si imunofixarea cu antiseruri anti-IgG marcate enzimatic pentru evidetierea benzilor oligoclonale³.

Valori de referinta – benzi oliglonale in LCR absente³.

Interpretarea rezultatelor

Benzile oligoclonale sunt decelate la 85-95% dintre pacientii cu scleroza multipla certa si la 30-40% dintre cei cu scleroza multipla probabila (specificitate 79%). Reprezinta cel mai sensibil marker al acestei afectiuni. Pot persista si in perioadele de remisiune a bolii. In cursul corticoterapiei prevalenta benzilor oligoclonale si a altor anomalii ale gamaglobulinelor se poate reduce cu 30-50%.

Rezultate pozitive pot sa apara si la ≤10% dintre pacientii cu boli neurologice noninflamatorii (carcinomatoza meningeala, infarct cerebral) si la ≤ 40% dintre bolnavii cu afectiuni inflamatorii ale SNC².

Limite si interferente

Un numar redus de pacienti cu scleroza multipla certa prezinta imunoglobuline normale in LCR si absenta benzilor oligoclonale².

Aspectul de benzi oligoclonale poate fi incert in prezenta unui raspuns inflamator concomitent care determina trecerea in LCR a unei cantitati mari de proteine plasmatice. Daca nivelul proteinelor in LCR este > 200 mg/dL, chiar si o productie locala crescuta de imunoglobuline poate fi mascata de prezenta proteinelor plasmatice.

Bibliografie

1. Frances Fischbach. Cerebrospinal Fluid Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 ed. 2009, 333-335.

2. Jacques Wallach. Afectiuni ale sistemului nervos. In Interpretarea testelor de diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, 7 Ed., 2001, 399.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

4. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Oligoclonal Banding. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

5. Richard A. McPetersen, Matthew R. Pincus. Cerebrospinal, Synovial and Serous Body Fluids. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods- Sauders Elsevier 21-Ed 2007- 432.

Pe de alta parte continutul proteic total al LCR este mult mai scazut fata de cel al serului (reprezinta <0.5% din concentratia de proteine serice totale). Peste 80% din proteinele care se gasesc in LCR-ul normal provin din ser: (albumina, IgG, alfa1-antitripsina, hemopexina, alfa1-glicoproteina acida si transferina), restul fiind produse local in sistemul nervos central³.

Pentru diagnosticul diferential al diverselor afectiuni neurologice este esential sa se cunoasca daca proteinele din LCR sunt transudate din ser sau sunt sintetizate local. In acest scop sunt determinate simultan in LCR si ser albumina si imunoglobulina G (IgG), iar pentru interpretarea rezultatelor obtinute sunt utilizate anumite rapoarte, indici si diagrame.

Permeabilitatea barierei hemato-encefalice poate fi evaluata prin cuantificarea raportului dintre concentratia albuminei in LCR si cea din ser. Astfel indicele albuminic se calculeaza dupa urmatoarea formula:

                                                    Albumina in LCR (mg/L)

Indicele albuminic Qalb   = ———————————

                                                    Albumina in ser (g/L)

 O valoare a indicelui mai mica decat 9 este asociata cu o bariera hemato-encefalica integra. Valorile cuprinse intre 9 si 14 indica o afectare usoara, cele intre 14 si 30 o afectare moderata iar cele peste 30 o afectare severa a barierei-hemato-encefalice. Indicele este usor crescut la copiii < 6 luni datorita imaturitatii barierei hemato-encefalice  si creste treptat dupa varsta de 40 ani.

In mod normal concentratia de IgG in LCR reprezinta 3-5% din cantitatea totala de proteine, dar in scleroza multipla se apropie de cea din plasma (15-18%). Cresterea sintezei intratecale de IgG se reflecta intr-o crestere a raportului dintre concentratia IgG in LCR si cea in ser:

                 IgG in LCR (mg/L)

QIgG   = ————————–   (normal: < 3)

                  IgG in ser (g/L)

 Pentru a elimina influenta imunoglobulinelor derivate din plasma care sunt transudate in LCR se calculeaza indicele IgG prin raportarea QIgG la indicele albuminic⁵:

                          QIgG

Index IgG    = ———— 

                         QAlb

 Valorile indexului IgG sunt crescute la 80-90% dintre pacientii cu scleroza multipla insa modificarea nu este caracteristica acestei boli, fiind intalnita si in alte afectiuni inflamatorii SNC: polineuropatie, neurosifilis etc⁴.

Pentru o diferentiere mai clara a raspunsului imun umoral, Felgenhauer si Reiber au dezvoltat o diagrama in care pe abscisa sunt reprezentate valorile QAlb, iar pe ordonata valorile QIgG. Valorile situate dedesubtul unei linii definite indica transferul pasiv prin bariera hemato-encefalica, iar cele plasate deasupra liniei sinteza locala de imunoglobuline (vezi figura).

 Interpretare diagrama Reiber:

• Zona valorilor de referinta.
• Perturbarea barierei hemato-encefalice fara sinteza IgG locala
• Perturbarea barierei hemato-encefalice asociata cu sinteza IgG locala.
• Sinteza IgG locala fara perturbarea barierei hemato-encefalice.
• In aceasta zona datele nu prezinta semnificatie clinica (ex: eroare de recoltare)³.

 x     = valori de referinta ≤ 15 ani

xx   = valori de referinta 15 – 40 ani

xxx = valori de referinta 41- 60 ani.

Calcularea indexului imunoglobulinic poate fi aplicata si pentru imunoglobulinele M si A cu introducerea in final a rezultatelor in diagrama Reiber. O parte din pacientii cu scleroza multipla prezinta secretie intratecala crescuta de IgM si IgA⁵.

Recomandari pentru determinarea indexului imunoglobulinic – detectarea sintezei intratecale de imunoglobuline, cu utilitate in diagnosticul sclerozei multiple (impreuna cu determinarea benzilor oligoclonale in LCR)⁴.

Pregatire pacient - se aduce la cunostinta pacientului procedura de recoltare³.

Specimen recoltat - se recolteaza obligatoriu 2 probe: 1) lichid cefalorahidian si 2) sange venos³.

Prelucrare  necesara dupa recoltare – 2) se separa serul prin centrifugare³.

Volum minim proba – 1) 2 mL; 2) 1mL³.

Cauze de respingere a probei – 2) ser hemolizat; plasma in loc de ser³.                       

Stabilitate proba - 7 zile la  2-8⁰C atat pentru ser cat si pentru LCR³.

Metoda – nefelometrica³.

Valori de referinta si interpretarea rezultatelor

Pe buletinul final de rezultate sunt comunicati urmatorii parametri:

Buletinul va contine si interpretarea rezultatelor conform diagramei Reiber (se va comunica zona in care se incadreaza valorile respective)^1;2;3.

In mod obisnuit scleroza multipla nu se asociaza cu o crestere a albuminei in LCR². Aceasta modificare se  inregistreaza in afectiunile insotite de perturbarea barierei hemato-encefalice:

-leziuni ale plexului coroid;

-procese tumorale localizate in SNC;

-meningita bacteriana;

-sindrom Guillain-Barré;

-infectii severe: febra tifoida, tularemie, difterie, septicemie¹.

Indicele IgG indica sinteza IgG la nivelul SNC. Este anormal la 90% dintre pacientii cu scleroza multipla dar si in alte afectiuni neurologice. Nu se coreleaza cu durata, gradul de activitate sau evolutia sclerozei multiple².

Limite si interferente

O punctie lombara traumatica sau o mielografie recenta invalideaza testul^2;3. Rezultatele indicelului IgG se coreleaza de obicei cu testul pentru benzi oligoclonale. In absenta benzilor oligoclonale valorile crescute ale indexului IgG nu prezinta semnificatie clinica.

Sensibilitatea testului de detectare a benzilor oligoclonale pentru scleroza multipla prin utilizarea metodei de focalizare izoelectrica este mai mare decat a indicelui IgG⁴.

Bibliografie

1. Frances Fischbach. Cerebrospinal Fluid Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 ed. 2009, 333-335.

2. Jacques Wallach. Afectiuni ale sistemului nervos. In Interpretarea testelor de diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, 7 Ed., 2001, 399.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

4. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Immunoglobulin IgG Index. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

5. Richard A. McPetersen, Matthew R. Pincus. Cerebrospinal, Synovial and Serous Body Fluids. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods- Sauders Elsevier 21-Ed 2007- 432.