Activitatea fosfatazei alcaline este prezenta in citoplasma neutrofilelor, osteoblastelor, celulelor endoteliului vascular si unor limfocite.

Determinarea activitatii (indicelui) fosfatazei alcaline leucocitare este utilizata in :

-diferentierea leucemiei granulocitare cronice de alte boli mieloproliferative (in particular metaplazie mieloida cu mielofibroza si policitemia vera) si  de reactiile leucemoide (infectii, neoplazii);

-diferentierea poliglobuliilor secundare de policitemia vera;

-parametru de prognostic in LGC, ce reflecta diferitele faze de activitate ale bolii;

-diferentierea formelor stabile, benigne de hairy cell leukemia (HCL) cu FAL normal, de formele active de boala, cu neutropenie severa si FAL mult crescut^1;3;6.

Principiul reactiei      

Fosfataza alcalina leucocitara catalizeaza reactia de hidroliza a esterilor fosfati in mediu alcalin.1-naftolul  rezultat din 1-naftil-fosfat se cupleaza cu o sare de diazoniu, formand precipitate brune, in functie de localizarea si activitatea  fosfatazei alcaline in celule. Intensitatea si frecventa granulelor se evalueaza prin examen microscopic^1,3.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese)³.

Specimen recoltat

a) sange capilar si/sau aspirat medular – frotiuri

b) se recomanda recoltarea simultana de sange venos pentru hemograma³.

Cauze de respingerea probei 

-frotiuri nefixate in maxim 8 ore de la recoltare;

- frotiuri executate din sange recoltat pe EDTA³.

Recipient de recoltare

a) se executa frotiuri de sange capilar direct pe lame de microscopie;

b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemograma³.

Cantitate recoltata 

a) 3-5 frotiuri;

b) 2 mL³.

Prelucrare necesara dupa recoltare 

Este preferabil ca fixarea frotiurilor sa se faca in primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se poate face in primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 parti + formol 40% 1 parte. Fixarea se cronometreaza 30 secunde, dupa care frotiurile se spala cu jet de apa de robinet. Frotiurile fixate se pot colora imediat sau se pot pastra cateva zile la temperatura camerei, pana la colorare³.

Stabilitate proba

-frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30ºC;

-frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei³.

Metoda - examinare microscopica³.

Determinarea citochimica a fosfatazei alcaline este bazata pe formarea unui precipitat colorat brun, a carui intensitate este subiectiv gradata de la 0 la 5:

-grad 0= fara pigment, granulatii absente

-grad 1= una-putine granulatii distincte

-grad 2= cateva granulatii localizate

-grad 3= granulatii difuz distribuite

-grad 4= precipitate intense compacte care acopera citoplasma celulelor, dand aspect de pigment continuu, nucleul celulelor fiind insa vizibil

-grad 5= numar maxim de granulatii, cu nucleul frecvent invizibil.

Scorul fosfatazei alcaline leucocitare intr-un frotiu este dat de suma scorurilor de colorare a 100 granulocite neutrofile mature^1;3.

Valori de referinta³ -  Scor FAL:10-100.

Interpretarea rezultatelor

Valori scazute:

- leucemie granulocitara cronica (tipic, FAL este foarte scazuta sau absenta);

- hemoglobinurie paroxistica nocturna;

- sindroame mielodisplazice⁶.

Valori crescute

- boli mieloproliferative, altele decat LGC (policitemia vera si unele cazuri de metaplazie mieloida cu mielofibroza);

- LGC in remisiune (poate avea FAL normal sau chiar crescut);

- infectii;

- afectiuni inflamatorii;

- leucemie cu celule paroase^1,6.

Limite si interferente

• Conditii fiziologice de stress: sarcina, efort fizic intens (cresc indicele FAL).

• Conditii patologice: infectiile asociate LGC pot creste valoarea FAL.

• Medicamente: terapia cu factori de crestere, contraceptive orale, preparatele cortizonice, litiu, (determina cresteri ale indicelui FAL).

• Interferente analitice

Scaderi : EDTA (activitatea enzimei scade rapid in timp)⁶.

Observatie: Pentru a determina indicele FAL, trebuie sa existe suficiente granulocite neutrofile mature in formula leucocitara³.

Bibliografie

1. Dan Colita. Tratat de Medicina Interna-Hematologie, partea a II-a (sub redactia Radu Paun), ed 1999, 1014-1026.

2. Lothar Thomas. Hematology. In Clinical Laboratory Diagnostics, ed 1998, 520.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog;

4. Marsha C.Kinney, John N.Lukens. Classification and differentiation of the acute leukemias. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 2211-2220.

5. Shafer J, Canadian Society of Laboratory Technologist Congress, Winnipeg, Manitoba, June 16 to 20, 1996, Workshop Manual, p 167-176.

6. Sherrie L. Perkins. Cytochemical Stains. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 26-27.

Coloratiile citochimice ofera informatii in legatura cu linia celulara si diferentierea celulelor hematopoietice si joaca un rol important in evaluarea anomaliilor hematologice, in special in diagnosticul diferential si clasificarea bolilor maligne ale sangelui.

Un principiu de care trebuie tinut seama este faptul ca, o reactie pozitiva este intotdeauna valoroasa, in timp ce reactia negativa este neconcludenta. Pentru certitudine, in majoritate cazurilor reactiile citochimice se practica cu un martor pozitiv al reactiei^1;2.

 - negativ ; +/- slab pozitiv ; + pozitiv ;+ + intens pozitiv.

Un diagnostic corect de laborator al LAM, cu subtipurile FAB si LAL necesita coroborarea datelor de microscopie optica – morfologie si coloratii citochimice – cu imunofenotiparea, eventual datele de microscopie electronica.

Informatii generale

Reactia MPO este coloratia citochimica de electie pentru recunoasterea celulelor granulocitare, prezenta sa reprezentand singurul marker fara echivoc al diferentierii mieloide. Mieloperoxidaza este o enzima localizata in granulatiile azurofile ale celulelor seriilor granulocitare si monocitare si in granulatiile specifice ale eozinofilelor⁴. 

Principiul reactiei  

Peroxidazele celulare descompun apa oxigenata  si elibereaza oxigenul, care oxideaza benzidina si genereaza un compus brun-auriu insolubil si stabil, localizat in citoplasma celulelor peroxidazo-pozitive^1;3.

Recomandari pentru determinarea activitatii peroxidazei

-  diferentierea leucemiei acute mieloblastice (LAM) de cea limfoblastica (LAL);

-  demonstrarea corpilor Auer;

- detectarea scaderii activitatii, la subiectii cu deficit de MPO congenitala sau dobandita (in mielodisplazii)¹.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese)³.

Specimen recoltat

a) sange capilar si/sau aspirat medular – frotiuri

b) se recomanda recoltarea simultana de sange venos pentru hemograma³.

Cauze de respingerea probei 

-frotiuri nefixate in maxim 8 ore de la recoltare;

-frotiuri executate din sange recoltat pe EDTA³.

Recipient de recoltare

a) se executa frotiuri de sange capilar direct pe lame de microscopie;

b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemograma³.

Cantitate recoltata 

a) 3-5 frotiuri;

b) 2 mL³.

Prelucrare necesara dupa recoltare 

Este preferabil ca fixarea frotiurilor sa se faca in primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se poate face in primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 parti + formol 40% 1 parte. Fixarea se cronometreaza 30 secunde, dupa care frotiurile se spala cu jet de apa de robinet. Frotiurile fixate se pot colora imediat sau se pot pastra cateva zile la temperatura camerei, pana la colorare³.

Stabilitate proba

-frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30ºC;

-frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei³.

Metoda - examinare microscopica³.

Interpretarea rezultatelor

Granulele de culoare galben-bruna indica prezenta activitatii peroxidazelor celulare.

Reactia este intensa  in celulele seriei granulocitare. Martorul pozitiv al reactiei este reprezentat de granulocitul matur – granule mari in citoplasma si peste nucleu. Este discutabil daca mieloblastul normal este peroxidazo-pozitiv in microscopia optica. Reactia este pozitiva incepand de la stadiul de promielocit; sunt prezente o multitudine de granule galben-brune in citoplasma, care uneori mascheaza alte caracteristici citoplasmatice.

Pentru stabilirea diagnosticului de leucemie acuta mieloblastica (LAM) cel putin 3% din blasti trebuie sa fie peroxidazo-pozitivi. Mieloblastii prezinta de obicei granulele mari, localizate si mai reduse numeric decat promielocitele normale. Corpii Auer, rezultati din coalescenta anormala a granulatiilor azurofile, sunt intens peroxidazo-pozitivi.

Monocitele dau o reactie negativa sau slab pozitiva. Monoblastii din leucemia acuta monocitara (LAM-M5) sunt de obicei negativi, in timp ce monoblastii din leucemia acuta mielomonocitara (LAM-M4) pot fi slab pozitivi.

Limfocitele si eritrocitele nu au activitate MPO in nici un stadiu de maturare.

In concluzie, reactia pozitiva in blasti indica leucemie mieloblastica sau mielomonocitara^1;4;5.

Limite si interferente 

Obtinerea unei reactii pozitive in blasti are valoare diagnostica pentru leucemia acuta mieloblastica, in timp ce reactia negativa este neconcludenta. Rezultatul trebuie coroborat cu alte teste citochimice¹.

Bibliografie

1. Dan Colita. Tratat de Medicina Interna-Hematologie, partea a II-a (sub redactia Radu Paun), ed 1999, 1014-1026.

2. Lothar Thomas. Hematology. In Clinical Laboratory Diagnostics, ed 1998, 520.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog;

4. Marsha C.Kinney, John N.Lukens. Classification and differentiation of the acute leukemias. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 2211-2220.

5. Shafer J, Canadian Society of Laboratory Technologist Congress, Winnipeg, Manitoba, June 16 to 20, 1996, Workshop Manual, p 167-176.

6. Sherrie L. Perkins. Cytochemical Stains. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 26-27.

Coloratiile citochimice ofera informatii in legatura cu linia celulara si diferentierea celulelor hematopoietice si joaca un rol important in evaluarea anomaliilor hematologice, in special in diagnosticul diferential si clasificarea bolilor maligne ale sangelui.

Un principiu de care trebuie tinut seama este faptul ca, o reactie pozitiva este intotdeauna valoroasa, in timp ce reactia negativa este neconcludenta. Pentru certitudine, in majoritate cazurilor reactiile citochimice se practica cu un martor pozitiv al reactiei^1;2.

- negativ ; +/- slab pozitiv ; + pozitiv ;+ + intens pozitiv.

Un diagnostic corect de laborator al LAM, cu subtipurile FAB si LAL necesita coroborarea datelor de microscopie optica – morfologie si coloratii citochimice – cu imunofenotiparea, eventual datele de microscopie electronica.

Informatii generale

In celulele sangvine reactia pozitiva este datorata in primul rand prezentei de glicogen citoplasmatic. Acumularea de glicogen se considera a fi un indicator al dereglarii metabolismului acestuia.

Multe din celulele sangvine prezinta o reactie PAS pozitiva in citoplasma. Intensitatea acestei reactii si tipul de colorare variaza cu tipul celular¹.

Principiul reactiei

Reactivul Schiff este o solutie incolora obtinuta prin reducerea fucsinei bazice. Acidul periodic oxideaza grupul glicol sau derivatii sai. Rezultatul este producerea de aldehide care reactioneaza cu reactivul Schiff pentru a produce o culoare purpurie^1;3.

Recomandari pentru determinarea PAS

- diagnosticul leucemiei acute limfoblastice (LAL) subtipurile L1 si L2;

- diagnosticul de sindrom mielodisplazic ori LAM-M6 prin evidentierea eritroblastilor PAS-pozitivi;

- diferentierea celulelor Gaucher si a histiocitelor cu granule „albastre ca marea” de alte tipuri de macrofage¹. 

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese)³.

Specimen recoltat

a) sange capilar si/sau aspirat medular – frotiuri

b) se recomanda recoltarea simultana de sange venos pentru hemograma³.

Cauze de respingerea probei 

-frotiuri nefixate in maxim 8 ore de la recoltare;

-frotiuri executate din sange recoltat pe EDTA³.

Recipient de recoltare

a) se executa frotiuri de sange capilar direct pe lame de microscopie;

b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemograma³.

Cantitate recoltata 

a) 3-5 frotiuri;

b) 2 mL³.

Prelucrare necesara dupa recoltare 

Este preferabil ca fixarea frotiurilor sa se faca in primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se poate face in primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 parti + formol 40% 1 parte. Fixarea se cronometreaza 30 secunde, dupa care frotiurile se spala cu jet de apa de robinet. Frotiurile fixate se pot colora imediat sau se pot pastra cateva zile la temperatura camerei, pana la colorare³.

Stabilitate proba

-frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30ºC;

-frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei³.

Metoda - examinare microscopica³.

Interpretarea rezultatelor

Glicogenul apare colorat in rosu purpuriu, sub forma de granule sau difuz.

Martorul pozitiv al reactiei este reprezentat de granulocitul matur.

Granulocitele contin glicogen sub forma difuza incepand cu stadiul de promielocit unde apare roz si creste pe masura maturatiei. Bazofilele sunt moderat-intens PAS pozitive, frecvent prezentand gramezi amorfe in jurul nucleului. In leucemia acuta mieloblastica (LAM) pot exista mieloblasti  care prezinta granule rosii, mici sau medii. In faza blastica a leucemiei granulocitare cronice (LGC) blastii sunt frecvent PAS pozitivi, similar limfoblastilor din leucemia acuta limfoblastica. Promielocitele  din leucemia acuta promielocitara (LAM-M3), in special forma hipergranulara,  sunt de obicei PAS pozitive.

In mod normal, un numar mic (mai putin de 15%) de limfocite mature  pot fi PAS pozitive cu urmatoarele aspecte :

             1+ rare granule rosii, mici sau medii;

             2+ numar moderat granule rosii, mici sau medii;

             3+ inele de granule rosii, grosolane sau gramezi  de material amorf de culoare rosie in citoplasma sau acoperind nucleul.

In leucemia limfatica cronica (LLC) netratata si faza leucemica a limfoamelor, numarul de celule limfoide pozitive este de obicei crescut in mod semnificativ, dar acest rezultat nu este concludent.

In leucemia acuta limfoblastica (LAL) un numar variabil de limfoblasti pot fi PAS pozitivi 1+,2+,3+. Aspectul PAS pozitiv 3+ prezinta specificitate inalta pentru limfoblastii leucemici. Limfoblastii sunt caracterizati printr-o mare variabilitate a activitatii glicogenice: sunt PAS pozitivi doar in ~ 50% din cazurile de LAL-L1 si L2, in timp ce in LAL-L3 sunt constant negativi.

Cresterea glicogenului in limfocitele patologice nu este specifica leucemiei, ci se datoreaza cresterii activitatii metabolice care are loc in cursul oricarui tip de proliferare limfoida¹.

Monocitele sunt negative sau slab pozitive(1+). Precursorii monocitelor in leucemia acuta monocitara (LAM-M5) sunt frecvent pozitivi si pot prezenta granule mari sau gramezi amorfe, similar limfoblastilor leucemici, dar de obicei limitate la citoplasma. In leucemia acuta mielomonocitara (LAM-M4) blastii, cand sunt PAS pozitivi, prezinta un aspect fin granular.

Precursorii eritroizi normali sunt PAS negativi. Proeritroblastii si eritroblastii bazofili din eritroleucemie (LAM-M6)  pot prezenta un aspect granular, cu granule grosolane dispuse in jurul nucleului. Un aspect difuz PAS pozitiv, poate fi prezent in eritroblastii maturi din LAM-M6 si sindromul mielodisplazic (SMD).

Megacarioblastii, megacariocitele si plachetele sunt PAS pozitive. Megacarioblastii din LAM-M7 prezinta un aspect difuz sau cu granule dispuse periferic^1;4;5.

Limite si interferente 

Reactia PAS are valoare mica in diferentierea LAL de alte tipuri de LA cu diagnostic dificil si incert, datorita heterogenitatii limfoblastilor¹.

Bibliografie

1. Dan Colita. Tratat de Medicina Interna-Hematologie, partea a II-a (sub redactia Radu Paun), ed 1999, 1014-1026.

2. Lothar Thomas. Hematology. In Clinical Laboratory Diagnostics, ed 1998, 520.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog;

4. Marsha C.Kinney, John N.Lukens. Classification and differentiation of the acute leukemias. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 2211-2220.

5. Shafer J, Canadian Society of Laboratory Technologist Congress, Winnipeg, Manitoba, June 16 to 20, 1996, Workshop Manual, p 167-176.

6. Sherrie L. Perkins. Cytochemical Stains. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 26-27.

Coloratiile citochimice ofera informatii in legatura cu linia celulara si diferentierea celulelor hematopoietice si joaca un rol important in evaluarea anomaliilor hematologice, in special in diagnosticul diferential si clasificarea bolilor maligne ale sangelui.

Un principiu de care trebuie tinut seama este faptul ca, o reactie pozitiva este intotdeauna valoroasa, in timp ce reactia negativa este neconcludenta. Pentru certitudine, in majoritate cazurilor reactiile citochimice se practica cu un martor pozitiv al reactiei^1;2.

-negativ ; +/- slab pozitiv ; + pozitiv ;+ + intens pozitiv.
Un diagnostic corect de laborator al LAM, cu subtipurile FAB si LAL necesita coroborarea datelor de microscopie optica – morfologie si coloratii citochimice – cu imunofenotiparea, eventual datele de microscopie electronica.

Informatii generale

Esterazele sunt enzime care hidrolizeaza esteri alfatici si aromatici si sunt utile pentru a distinge celulele seriei granulocitare de celulele seriei monocitare.

Naphthol AS-D cloracetat esteraza este prezenta in celulele liniei granulocitare si se gaseste in cantitate mica sau este absenta in monocite si precursorii monocitelor.

Esteraza nespecifica este, asa cum ii arata si numele, o enzima ubiquitara prezenta in mai multe tipuri de celule, printre care: monocite,celule T si megacariocite. Poate utiliza ca substraturi: alfa-naftil acetat, alfa-naftil butirat, naftol AS- D acetat⁴.

Principiul metodei

Ne vom referi la reactia alfa-naftil acetat esteraza (ANAE): alfa-naftil acetatul este hidrolizat de esteraze in alfa-naftol, care in prezenta unei sari de diazoniu formeaza un compus de culoare rosu-brun, insolubil in apa^1;3.

Recomandari pentru determinarea esterazelor nespecifice

- diagnosticul LA monocitare tipurile M4 si M5¹.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese)³.

Specimen recoltat

a) sange capilar si/sau aspirat medular – frotiuri

b) se recomanda recoltarea simultana de sange venos pentru hemograma³.

Cauze de respingerea probei

-frotiuri nefixate in maxim 8 ore de la recoltare;

-frotiuri executate din sange recoltat pe EDTA³.

Recipient de recoltare

a) se executa frotiuri de sange capilar direct pe lame de microscopie;

b) vacutainer cu EDTA K3 (capac mov), pentru hemograma³.

Cantitate recoltata

a) 3-5 frotiuri;

b) 2 mL³.

Prelucrare necesara dupa recoltare

Este preferabil ca fixarea frotiurilor sa se faca in primele 30 minute de la recoltare. Eventual, se poate face in primele 8 ore. Amestec fixator: alcool etilic 9 parti + formol 40% 1 parte. Fixarea se cronometreaza 30 secunde, dupa care frotiurile se spala cu jet de apa de robinet. Frotiurile fixate se pot colora imediat sau se pot pastra cateva zile la temperatura camerei, pana la colorare³.

Stabilitate proba

-frotiurile nefixate sunt stabile maxim 8 ore la 18-30ºC;

-frotiurile fixate sunt stabile 5 zile la temperatura camerei³.

Metoda - examinare microscopica³.

Interpretarea rezultatelor

In monocite, activitatea enzimatica a ANAE se evidentiaza prin aparitia unui compus rosu-brun, cu aspect difuz, moderat sau intens colorat (tip M –monocitar). In celulele T (inclusiv limfoblastii T) si megacarioblasti, aspectul este mai mult focal, in regiunea Golgi sau paranuclear. Aspectul colorarii este util, intr-o anumita masura, in diferentierea tipurilor de celule.

Etapa de inhibare cu NaF a fost adaugata pentru a face esteraza nespecifica „mai specifica”. Activitatea enzimei in celulele liniei monocitare este inhibata de NaF, in timp ce in restul celulelor activitatea persista.

Alfa-naftil acetat esteraza este obisnuit negativa in celulele de serie granulocitara. Celulele blastice din LAM-M0, M1 si M2 sunt de obicei negative. In LAM–M3 esteraza nespecifica este pozitiva in 20-30% din cazuri, fiind mai slaba ca intensitate decat in monocite; reactia este sensibila la inhibare cu NaF in aproximativ 1/3-1/2 din cazurile pozitive.

Celulele blastice monocitare din LAM-M4 au activitate ANAE intens pozitiva, difuza (tip M) in proportie de peste 20%, iar in cele din LAM-M5 in proportie de peste 80%, sensibila la NaF.

Megacarioblastii leucemici din LAM-M7 au pozitivitate focala distincta partial inhibata de NaF.   Eritroblastii din LAM-M6 au de obicei activitate ANAE pozitiva, neinhibata de NaF.

Celulele blastice din LAL sunt negative;  foarte rar pot aparea celule ANAE slab pozitive cu aspect granular, cu sensibilitate variabila la NaF^1;4.

Bibliografie

1. Dan Colita. Tratat de Medicina Interna-Hematologie, partea a II-a (sub redactia Radu Paun), ed 1999, 1014-1026.

2. Lothar Thomas. Hematology. In Clinical Laboratory Diagnostics, ed 1998, 520.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog;

4. Marsha C.Kinney, John N.Lukens. Classification and differentiation of the acute leukemias. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 2211-2220.

5. Shafer J, Canadian Society of Laboratory Technologist Congress, Winnipeg, Manitoba, June 16 to 20, 1996, Workshop Manual, p 167-176.

6. Sherrie L. Perkins. Cytochemical Stains. In Wintrobe’s Clinical Hematology, Philadelphia ed. 1999, 26-27.