Heparina nefractionata (standard) si heparinele cu greutate moleculara mica (LMWH=low molecular weight heparin) sunt anticoagulante utilizate pentru tratamentul si profilaxia bolilor tromboembolice. Monitorizarea terapeutica este necesara datorita variabilitatii interindividuale a raspunsului la tratament⁴.

▪ Heparina nefractionata este un amestec heterogen de glicozaminoglicani care se leaga de antitrombina printr-o secventa pentazaharidica unica si catalizeaza inactivarea trombinei, FXa si a altor factori de coagulare. In plus heparina se leaga de celulele endoteliale, macrofage si o serie de proteine plasmatice, fenomen care contribuie la variabilitatea raspunsului anticoagulant la pacientii cu boala tromboembolica si la fenomenul de laborator al “rezistentei la heparina”. De asemenea cinetica complexa a clearance-ului heparinei duce la un raspuns anticoagulant nonlinear la dozele terapeutice de heparina, atat intensitatea, cat si durata efectului crescand disproportionat odata cu cresterea dozei².

Riscul hemoragic asociat tratamentului cu heparina creste cu doza si cu administrarea concomitenta de agenti fibrinolitici. De asemenea riscul hemoragic este asociat cu chirurgia recenta, traumatisme, proceduri invazive si defecte hemostatice concomitente. Investigatorii au raportat o relatie intre doza de heparina administrata si atat eficacitatea, cat si siguranta tratamentului. Deoarece raspunsul anticoagulant variaza de la pacient la pacient, practica standard este de a monitoriza tratamentul cu heparina si de a ajusta dozele pe baza rezultatelor testelor de coagulare conform unui protocol².

Tratamentul trombembolismului venos este situatia cea mai intalnita in care este monitorizat tratamentul cu heparina. Monitorizarea este recomandata pentru asigurarea ca nivelul heparinei este in intervalul terapeutic si, prezumtiv, minimizarea riscului de recurenta sau extensie a trombozei³.

Atunci cand se utilizeaza doze terapeutice de heparina, testul uzual pentru monitorizarea activitatii anticoagulante a heparinei este aPTT. Pentru monitorizarea dozelor mai mari de heparina utilizate in interventiile coranariene percutanate si by-pass-ul cardiopulmonar se utilizeaza timpul de coagulare activat (ACT, activated clotting time), aPTT fiind aproape incoagulabil in aceste situatii².

Pe baza unui studiu retrospectiv din 1972 care a sugerat ca un aPTT de 1.5-2.5 ori valoarea de control reduce riscul de trombembolism recurent, acest interval terapeutic pentru aPTT a devenit larg acceptat. Totusi relevanta clinica a acestui interval nu a fost validata in studii randomizate, iar, datorita sensibilitatii diferite a reactivilor de aPTT la heparina, folosirea unui raport fix al aPTT pentru toti reactivii nu este potrivita. Astfel, fiecare laborator trebuie sa-si stabileasca intervalul terapeutic al aPTT in functie de reactivul si coagulometrul folosite. CAP (College of American Pathologists) si ACCP (American College of Chest Physicians) recomanda ca intervalul terapeutic al aPTT sa fie stabilit prin masurarea directa a activitatii heparinei fie printr-un test de inhibitie a FXa, fie prin titrarea protaminei. In studiul respectiv care a stabilit intervalul terapeutic al aPTT, un raport de 1.5-2.5 a corespuns unui nivel de heparina de 0.2-0.4 U masurat prin titrare cu protamina si 0.3-0.7 U masurat printr-un test de activitate anti-FXa. Aceasta informatie limitata a constituit baza desemnarii intervalului terapeutic al heparinei ca fiind 0.3-0.7 anti-FXa U de heparina/mL. Pentru tratamentul trombozei venoase este rezonabil sa se stabileasca un interval pentru aPTT care sa corespunda unui nivel al heparinei de 0.3-0.7 U anti-FXa (sau 0.2-0.4 U prin titrare cu protamina)^2,3.

Unii autori sugereaza ca testul anti-FXa ar fi mai bun pentru monitorizarea tratamentului cu heparina, dar sunt putine date clinice care sa sustina acest lucru. Datele actuale sugereaza ca strategiile de dozare a heparinei pe baza greutatii ar fi mai importante decat monitorizarea de laborator in determinarea rezultatului tratamentului cu heparina³.

Exista anumite situatii care complica utilizarea aPTT pentru monitorizarea tratamentului cu heparina.

O prima categorie este reprezentata de factorii care modifica biodisponibilitatea heparinei: varsta inaintata, obezitatea, modificari ale proteinelor de legare a heparinei, boli hepatice, renale, “rezistenta la heparina” – termen utilizat pentru a descrie situatia in care pacientii necesita doze neobisnuit de mari de heparina pentru a obtine un aPTT terapeutic^1,2,4.

O alta categorie este reprezentata de factorii care altereaza raspunsul aPTT la heparina: nivelele crescute de FVIII si fibrinogen, nivelurile scazute de antitrombina, scaderea usoara a mai multor factori de coagulare (cum ar fi stadiul precoce al unei coagulopatii de consum, tratamentul cu anticoagulante orale)⁴.

 Ultima categorie este reprezentata de conditiile asociate cu un aPTT prelungit in absenta tratamentului cu heparina: prezenta lupusului anticoagulant, deficitul de factori de contact ai coagularii⁴.

In toate aceste cazuri testul pentru anti-FXa poate fi mai potrivit pentru monitorizarea tratamentului cu heparina.

▪ LMWH sunt derivate din heparina prin depolimerizare chimica sau enzimatica. Diferitele LMWH aprobate in Statele Unite, Canada si Europa includ: dalteparin (Fragmin), enoxaparin sodium (Lovenox/Clexane), nadroparin calcium (Fraxiparin), tinzaparin (Innohep). Ca si heparina, LMWH produc efectul anticoagulant major prin activarea antitrombinei. Acestea au activitate inhibitorie mai mare asupra FXa decat asupra trombinei si se leaga mai putin de celule si proteine decat heparina, avand proprietati farmacocinetice si farmacodinamice mai previzibile si un timp de injumatatire mai lung, putand fi administrate o data sau de doua ori pe zi fara monitorizare anticoagulanta.

Monitorizarea de rutina a tratamentului cu LMWH nu este recomandata, dar aceasta este necesara la pacientii cu insuficienta renala, LMWH fiind eliminate din organism in principal prin rinichi, iar in conditiile in care functia renala este alterata poate scadea clearance-ul LMWH, cu cresterea concentratiei sanguine si cresterea riscului de sangerare¹. De asemenea monitorizarea este indicata la gravide, obezi, pacienti foarte tineri, varstnici, la care farmacocinetica si volumul de distributie sunt diferite fata de restul adultilor sanatosi^1;3;4;6. Monitorizarea este de asemenea indicata cand nu se obtine raspunsul asteptat, de exemplu daca pacientul continua sa faca tromboze³.

aPTT nu trebuie utilizat pentru monitorizarea tratamentului cu LMWH deoarece acestea nu modifica aPTT semnificativ, testul recomandat fiind nivelul de anti-FXa.

Conform ghidurilor ACCP privind tratamentul cu anticoagulante parenterale monitorizarea nivelului de anti-FXa este recomandata numai la gravidele tratate cu doze terapeutice de LMWH. La pacientii obezi tratati profilactic sau terapeutic cu LMWH se recomanda dozarea acestora in functie de greutate. La pacientii cu insuficienta renala severa (clearance la creatinina <30 mL/min) care necesita anticoagulare terapeutica se sugereaza utilizarea heparinei nefractionate in locul LMWH, iar daca se utilizeaza LMWH se sugereaza administrarea a 50% din doza recomandata².

LMWH sunt sigure si eficiente atat pentru profilaxia, cat si pentru tratamentul trombembolismului venos in sarcina. O data cu progresia sarcinii cresc greutatea materna, clearance-ul renal si volumul de distributie al LMWH, putand necesita ajustarea dozelor. Pentru a asigura o anticoagulare eficienta in timpul sarcinii optiunile ar fi fie ajustarea dozei in functie de modificarea greutatii, fie monitorizarea activitatii anti-FXa si ajustarea dozei pentru atingerea nivelului terapeutic de 0.5-1 U/mL. In ceea ce priveste profilaxia trombembolismului venos in sarcina, recomandarile ACCP 2008 definesc dozele profilactice ale LMWH, precum si un regim cu doze intermediare, dar conceptul utilizarii unui nivel de anti-FXa tinta este controversat, ajustarea dozelor putand in fapt sa nu aiba impact asupra sigurantei si eficientei anticoagularii profilactice. Intr-un studiu retrospectiv pe 49 paciente care au primit tratament cu LMWH pentru profilaxia sau tratamentul trombembolismului venos in timpul sarcinii si care au fost monitorizate cu nivelul anti-FXa s-a gasit ca monitorizarea si ajustarea dozelor LMWH in timpul sarcinii pot fi necesare atat pentru regimurile terapeutice, cat si pentru cele cu doze intermediare. In grupul profilactic, cresterea semnificativa a necesarului de LMWH sugereaza ca monitorizarea mai frecventa a nivelului anti-FXa poate fi potrivita pentru mentinerea nivelului anticoagulant tinta. Totusi, in ciuda mentinerii nivelurilor adecvate de anti-FXa la gravidele cu risc crescut, mai pot surveni evenimente tromboembolice⁸.

Pentru monitorizarea heparinei nefractionate nivelul de anti-FXa trebuie determinat la 6 ore de la initierea terapiei sau modificarea dozei. Atunci cand este utilizat pentru monitorizarea LMWH, recoltarea se face la aproximativ 3-4 ore de la ultima doza (dupa atingerea starii de echilibru, tipic inaintea celei de a 3-a doze), atunci cand concentratia in sange a LMWH este de asteptat sa fie la nivelul cel mai inalt. Atunci cand medicul suspecteaza o rata anormala a clearance-ului LMWH, se poate recolta un test „random” (in orice moment) sau chiar inaintea urmatoarei doze, cand concentratia heparinei se asteapta sa fie la nivelul cel mai scazut^1;7.

Pregatire pacient - nu este necesara⁵.

Specimen recoltat - sange venos⁵.

Recipient de recoltare – vacutainer cu citrat de Na 0.105M (raport citrat de sodiu – sange=1/9).

Presiunea realizata de garou trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si cea a presiunii diastolice si nu trebuie sa depaseasca 1 minut. Daca punctia venoasa a esuat, o noua tentativa pe aceeasi vena nu se poate face decat dupa 10 minute⁵.

Cantitate recoltata - cat permite vacuumul; pentru a preveni coagularea partiala a probei se va asigura amestecul corect al sangelui cu anticoagulantul, prin 5-6 miscari blande de inversiune a tubului⁵.

Cauze de respingere a probei - vacutainer care nu este plin (cel putin 90%); proba de singe hemolizata sau coagulata; plasma care nu a ajuns congelata la laborator⁵.

Prelucrare necesara dupa recoltare - proba va fi centrifugata 15 minute la 2500g (dubla centrifugare pentru depletia trombocitelor⁶) urmata imediat de separarea plasmei si congelarea acesteia; probele recoltate in afara laboratorului vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate⁵.

Stabilitate proba – plasma separata este stabila 3 saptamani la – 20ºC; >1 an la –70ºC⁵.

Metoda – cromogena⁵.

Testul pentru heparina anti-FXa se bazeaza pe abilitatea heparinei de a inhiba activitatea FXa din reactiv, care contine de asemenea un exces de antitrombina, astfel incat heparina din proba sa fie agentul care limiteaza rata inhibitiei FXa. Heparina din proba inhiba transformarea enzimatica a substratului cromogen de catre FXa. Astfel, nivelul activitatii reziduale FXa  este invers proportional cu concentratia de heparina din plasma pacientului. Sunt create curbe standard utilizand concentratii diferite de heparina si LMWH si sunt utilizate pentru a calcula concentratia din plasma pacientului^4;5.

Exprimarea rezultatelor - in U/mL.

Valori de referinta

Intervalul terapeutic este in functie de preparatul administrat:

- pentru heparina standard: 0.3-0.7 U/mL

- pentru Fraxiparin: 0.5-1.2 U/mL (dupa 2-4 zile de la initierea terapiei si la 3 ore de la ultima doza);

- pentru Clexane multidoza:

  * scop profilactic: 0.1-0.4 U/mL

  * scop curativ: 0.4-1.1 U/mL (la 3-4 ore de la ultima doza)⁵.

Ghidul ACCP privind tratamentul trombembolismului venos cu diferite preparate LMWH recomanda urmatoarele intervale terapeutice:

-enoxaparin sau nadroparin administrat de doua ori pe zi: 0.6-1 U/mL;

-enoxaparin administrat o data pe zi: >1 U/mL;

-tinzaparin administrat o data pe zi: 0.85 U/mL;

-nadroparin administrat o data pe zi: 1.3 U/mL;

-dalteparin administrat o data pe zi: 1.05 U/mL².

Interpretarea rezultatelor

In general, daca concentratiile sunt in range-urile terapeutice, iar pacientul nu prezinta complicatii, doza este considerata potrivita.

Daca concentratia anti-FXa este crescuta, atunci pacientul poate primi o doza prea mare sau nu elimina medicamentul la o rata asteptata si poate prezenta risc de sangerare.

Daca concentratia anti-FXa este sub nivelul terapeutic, poate fi necesara cresterea dozei de heparina.

Daca un pacient nu ia heparina, concentratia de anti-FXa trebuie sa fie zero sau nedetectabila¹.

Limite si interferente

Rezultatele obtinute din laboratoare diferite pot sa nu fie comparabile, iar repetarea testarii ar trebui efectuata la acelasi laborator¹.

In timpul congelarii-decongelarii, plachetele reziduale elibereaza factorul plachetar 4 putand determina niveluri fals scazute de heparina⁶.

Niveluri foarte scazute ale ATIII endogene pot determina rezultate fals scazute⁶.

Foarte rar, anticorpii fata de FX si ATIII bovina pot interfera cu testul⁶.

Lipemia, icterul si hemoliza pot interfera cu detectia cromogena si duce la rezultate incorecte⁶.

Bibliografie

1. American Association for Clinical Chemistry. Heparin Anti-Xa. www.labtestonline.org. 2011. Ref Type: Internet Communication.

2. Hirsh J, Bauer K, Jacobson A, Donati M, Gould M, Sanana M, Weity J, “Parenteral Anticoagulants-American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines (8th Edition)”, Chest. 2008; 133:160S-198S.

3. Hoffman M, “Heparins: Clinical Use and Laboratory Monitoring”, Laboratory Medicine, 2010; 41(10): 621-626

4. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. “Heparin Anti-Xa”. www.labcorp.com. 2011. Ref Type: Internet Communication.

5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate, 2011. Ref Type: Catalog.

6. Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories. Reference Laboratory Services for Health Care Organizations. „Heparin Anti-Xa Assay, Plasma”. www.mayomedicallaboratories.com. 2011. Ref Type: Internet Communication.

7. Ronald Regan UCLA Medical Center. „Anticoagulant Management Program and Guidelines”. medres.med.ucla.edu. 2008. Ref Type: Internet Communication.

8. Shapiro N, Kominiarek M, Nutescu E, Chevalier A, Hibbard J, “Dosing and Monitoring of Low-molecular-weight Heparin in High-risc Pregnancy”, Pharmacotherapy. 2011; 31(7): 678-685.

Factorul IX (factorul antihemofilic B sau factorul Christmas) este o glicoproteina sintetizata in hepatocit in prezenta vitaminei K si compusa din doua fractiuni: FIX-C si FIX –C Ag^1;3;7.

FIX-C este responsabil de activitatea coagulanta si se sintetizeaza sub inductia genelor de pe cromozomii X. FIX-C Ag constituie elementul de suport proteic inactiv al fractiunii coagulante si detine proprietati antigenice⁸.

Din punct de vedere functional reprezinta o serin-proteaza in complexul intrinsec al tenazei, interactionand cu cofactorul sau FVIIIa in prezenta ionilor de calciu. Conform modelului actual al coagularii, acest complex intervine in etapa a doua (de propagare), fiind activatorul major al factorului X (de 50 ori mai activ decat complexul factor VIIa-factor tisular). Astfel, peste 90% din cantitatea totala de FXa este produsa de catre complexul tenazei. La randul sau, factorul IX este activat de catre complexul  VIIa-factor tisular in prima etapa a coagularii (de initiere). In etapa de propagare se genereaza o cantitate suplimentara de FIXa de catre FXIa, pentru a amplifica in continuare producerea de FXa si trombina².

Deficitul de FIX-C, denumit hemofilie B sau boala Christmas, este o afectiune cu transmitere genetica recesiva X-linkata (genele pentru FIX sunt situate pe cromozomul X)⁸. Sunt descrise numeroase mutatii, cele mai multe fiind punctiforme⁹. Majoritatea cazurilor de boala se dezvolta la baietii ale caror mame sunt purtatoare ale defectului genetic (heterozigote). Un subtip de hemofilie B – hemofilia B Leiden – se caracterizeaza printr-o expresie alterata a factorului IX, astfel incat in perioada copilariei nivelurile pot fi <1% si dupa pubertate pot creste treptat pana la 70%. Sunt descrise si cazuri de hemofilie B rezultate in urma unor mutatii spontane ale genei pentru FIX. Femeile purtatoare au un nivel de factor IX mai redus decat persoanele normale, insa suficient pentru a asigura hemostaza si de aceea sangerarile excesive sunt rar intalnite (numai dupa traumatisme si interventii chirurgicale majore). In schimb femeile cu sindrom Turner (cariotip X0) pot fi simptomatice, la fel ca si persoanele de sex feminin purtatoare care prezinta un grad crescut de lionizare (inactivarea unui cromozom X)⁶.

Tabloul clinic include manifestari hemoragice care debuteaza cel mai adesea la sfarsitul primului an de viata:

- sangerari externe, variate ca localizare dar reduse ca incidenta si gravitate, care apar dupa o perioada de latenta de cateva ore de la traumatismul cauzal;

- sangerari interne care sunt mult mai frecvente si cu indice de gravitate mult mai mare (hematoame profunde, intra si interviscerale, intracavitare: abdomen, pleura, pericard, articulatii, spatiu subarahnoidian).

Caracteristice bolii si cu incidenta crescuta sunt hemartrozele si hematoamele⁷.

In functie de severitatea sindromului hemoragipar sunt descrise 3 forme clinice de hemofilie B:

●  severa: hemoragiile apar spontan (nivel FIX <1%)

●  medie: hemoragiile apar dupa traumatisme minore (nivel de factor IX: 1-5%)

●  usoara: hemoragiile apar dupa traumatisme mari si interventii chirurgicale (nivel de factor IX: 5-25%).

Deficitul dobandit de factor IX apare in conditiile asociate cu deficit de vitamina K. Pacientii cu afectiuni hepatice grave pot prezenta o scadere generalizata a factorilor coagularii, inclusiv factorul IX.

Pacientii cu hemofilie B care primesc tratament substitutiv pot dezvolta inhibitori ai factorului IX in 3% din cazuri, ca urmare a producerii de aloanticorpi. Exista si cazuri rare de hemofilie B dobandita prin aparitia de autoanticorpi anti-FIX in cadrul unor afectiuni autoimune. Acesti pacienti prezinta manifestari clinice similare celor din forma congenitala⁶.

In cazul deficitului de factor IX testele de hemostaza prezinta urmatoarele modificari: timpul de tromboplastina partiala activat (APTT) este mult alungit si se corecteaza dupa administrarea de plasma normala, in timp ce timpul Quick, timpul de trombina si timpul de singerare sunt normale. Determinarea specifica a activitatii factorului IX – % din normal – stabileste diagnosticul de hemofilie B si forma clinica (severa/medie/usoara) ^1;4.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate)⁵.

Specimen recoltat - sange venos⁵.

Recipient de recoltare – vacutainer cu citrat de Na 0.105M (raport citrat de sodiu – sange=1/9). Presiunea realizata de garou trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si cea a presiunii diastolice si nu trebuie sa depaseasca 1 minut. Daca punctia venoasa a esuat, o noua tentativa pe aceeasi vena nu se poate face decat dupa 10 minute⁵.

Cantitate recoltata - cat permite vacuumul; pentru a preveni coagularea partiala a probei se va asigura amestecul corect al sangelui cu anticoagulantul, prin miscari de inversiune a tubului⁵.

Prelucrare necesara dupa recoltare - proba va fi centrifugata 15 minute la 2500g, urmata imediat de separarea plasmei si congelarea acesteia; probele recoltate in afara laboratorului vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate⁵.

Cauze de respingere a probei - vacutainer care nu este plin; proba de singe hemolizata sau coagulata; plasma care nu a ajuns congelata la laborator⁵.

Stabilitate proba - plasma separata este stabila 4 ore la temperatura camerei; 3 saptamani la  – 20ºC; > 1 an la – 70ºC⁵.

Metoda - coagulometrica (consta in masurarea timpului de coagulare a probei de investigat in prezenta cefalinei + activator si a unei plasme care contine in exces toti factorii plasmatici ai coagularii cu exceptia factorului IX⁵.

Valori de referinta

< 7 zile: 35-60%

8 zile – 1 an: 45-110%

> 1 – 10 ani: 60-100%

> 10 ani: 70-120%⁵.

Limite si intreferente

Determinarea activitatii factorului IX nu trebuie utilizata pentru depistarea femeilor purtatoare ale tarei hemofilice – pentru aceste cazuri sunt indicate teste genetice.

In prezenta inhibitorilor se pot obtine niveluri fals scazute ale factorului IX⁶.

Bibliografie

1. Daniela Badea. Veronica Sfredel. Homeostazia sangelui. Editura Medicala Universitara Craiova Ed. 2003, 217-233.

2. Denise O’ Shaughnessy, Michael Makris, David Lilicrap. Basic principles underlying coagulation system. In Practical Hemostasis and Thrombosis, Balckwell Publishing, 2008, 4-6.

3. Florica Enache. Maria Stuparu. Diagnosticul de laborator in hemostaza. Editura ALL, 1998, pag.155-167.

4. Jacques Wallach. Interpretarea testelor de diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, 7 ed., 2001, 639-641.

5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog

6. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Factor IX Activity.www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

7. Radu Paun. Tratat de medicina interna . Hematologie. Partea I. Ed.Medicala 1997, 353-404.

8. Radu Paun. Tratat de medicina interna . Hematologie. Partea II. Ed. Medicala 1999, 779-854.

9. Richard A. McPetersen, Matthew R. Pincus. Coagulation and Fibrinolysis. In Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 2007, 729-743.

Factorul XIII sau factorul stabilizator al fibrinei este o molecula tetramerica sintetizata la nivelul hepatocitelor si megacariocitelor. Este activat de trombina in prezenta ionilor de Ca. Din punct de vedere functional, FXIIIa este o transglutaminaza care introduce legaturi covalente incrucisate intre monomerii de fibrina. Cheagul rezultat prezinta o stabilitate mecanica crescuta si rezistenta la fibrinoliza. De asemenea, FXIIIa favorizeaza proliferarea fibroblastilor si vindecarea endoteliilor prin sinteza de colagen si este esential in mentinerea sarcinii^1;5.

Deficitul congenital de factor XIII se transmite autosomal recesiv si are o prevalenta redusa in populatie. Deficitul este suspectat in cazurile de sangerari excesive asociate cu valori normale ale timpului de tromboplastina partiala activat (APTT) si timpului de protrombina. Persoanele heterozigote sunt in general asimptomatice, desi au fost raportate cazuri de sangerari provocate. Homozigotii sunt intotdeauna simptomatici fiind descrise urmatoarele tipuri de manifestari hemoragice:

-hemoragii grave la nivelul bontului ombilical;

-echimoze si hematoame, hemoragii din plagi ale pielii ce apar in timpul mersului (nu sunt descrise insa hemartroze);

-hemoragii intracraniene prin traumatisme minore.

Accidentele hemoragice sunt de obicei provocate si apar tardiv (12-36h) de la traumatismul cauzal. Plagile operatorii sangereaza secundar, se vindeca greu si cu cicatrice vicioasa^2;3;5;6;7. Sunt descrise insa si cazuri de hemoragii cerebrale spontane letale⁸.

De asemenea, statusul homozigot este asociat cu avorturi spontane la femei si infertilitate la barbati. Tratamentul manifestarilor hemoragice include administrarea de plasma, crioprecipitat si concentrate de factor XIII. Datorita timpului lung de injumatatire a factorului XIII este posibil si un tratament profilactic administrat la 2-6 saptamani^2;3;5;6;7.

Forma dobandita  a deficitului de factor XIII poate sa apara in urmatoarele conditii clinice: mielom multiplu, intoxicatie cronica cu plumb, siclemie, vasculite, arsuri, purpura Hennoch, leucemie acuta, policitemie vera, radioterapie, boli hepatice, boli intestinale inflamatorii, afectiuni renale, CID si diverse neoplasme. Se pot dezvolta si autoanticorpi in asociere cu administrarea unor medicamente: izoniazida, penicilina si fenitoin^5;6;7.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate)⁴.

Specimen recoltat - sange venos⁴.

Recipient de recoltare – vacutainer cu citrat de Na 0.105M (raport citrat de sodiu – sange=1/9). Presiunea realizata de garou trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si cea a presiunii diastolice si nu trebuie sa depaseasca 1 minut. Daca punctia venoasa a esuat, o noua tentativa pe aceeasi vena nu se poate face decat dupa 10 minute⁴.

Cantitate recoltata - cat permite vacuumul; pentru a preveni coagularea partiala a probei se va asigura amestecul corect al sangelui cu anticoagulantul, prin miscari de inversiune a tubului⁴.

Prelucrare necesara dupa recoltare - proba va fi centrifugata 15 minute la 2500g, urmata imediat de separarea plasmei si congelarea acesteia; probele recoltate in afara laboratorului vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate³.

Cauze de respingere a probei - vacutainer care nu este plin; proba de singe hemolizata sau coagulata; plasma care nu a ajuns congelata la laborator⁴.

Stabilitate proba - plasma separata este stabila 4 ore la temperatura camerei; 3 saptamani la  – 20ºC; > 1 an la – 70ºC⁴.

Metoda -  test de solubilizare a cheagului (se determina cea mai mare dilutie a plasmei la care un cheag, obtinut prin adaugarea de trombina si calciu la un fibrinogen exogen fara factor XIII, ramane insolubil in prezenta acidului cloroacetic)⁴. 

Valori de referinta  - 80% -150%⁴.

Limite si interferente

O activitate fibrinolitica anormala poate determina o disolutie timpurie a cheagului care interfera cu testul; in acest caz proba de sange trebuie recoltata folosind un amestec de anticoagulant si inhibitor al fibrinolizei (ex: acid ε amino caproic)⁴.

Bibliografie

1. Daniela Badea. Veronica Sfredel. Homeostazia sangelui. Editura Medicala Universitara Craiova Ed. 2003, 217-233.

2. Florica Enache. Maria Stuparu. Diagnosticul de laborator in hemostaza. Editura ALL, 1998, pag.155-167.

3. Jacques Wallach. Interpretarea testelor de diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, 7 ed., 2001, pg.639-641

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog

5. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Factor XIII.www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

6. Radu Paun. Tratat de medicina interna . Hematologie. Partea I. Ed.Medicala 1997, 353-404.

7. Radu Paun. Tratat de medicina interna . Hematologie. Partea II. Ed. Medicala 1999, 779-854.

8. Richard A. McPetersen, Matthew R. Pincus. Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 2007, 729-743.

Factorul von Willebrand (FvW) este o glicoproteina de adeziune, cu multiple roluri in coagulare, care circula in plasma sub forma unui amestec heterogen de multimeri legati disulfidic. FvW este sintetizat in celulele endoteliale si megakariocite sub forma unei pre-pro-molecule, continand un peptid semnal de 22 aminoacizi, un propeptid de 741 aminoacizi si proteina matura de 2050 aminoacizi. FvW este neobisnuit de bogat in cisteina, implicata in formarea de legaturi disulfidice. Monomerii pro-FvW sunt asamblati la nivelul reticulului endoplasmic in dimeri prin legaturi disulfidice ale capetelor C-terminale, iar multimerizarea are loc in aparatul Golgi prin formarea de legaturi disulfidice ale capetelor N-terminale ale dimerilor adiacenti, proces ce pare a fi catalizat de o activitate disulfid-izomerazica localizata in propeptidul FvW⁴. Clivarea propeptidului are loc dupa asamblarea multimerilor, in special intracelular, dar poate avea loc si dupa secretie. Multimerii de FvW variaza in marime, de la dimerii de 600 000D la multimerii foarte mari de 20 milioane D. FvW este stocat  in α-granulele plachetare si in corpusculii Weibel-Palade din celulele endoteliale, acestea fiind formele cele mai mari si mai potente biologic. Rezervele endoteliale de FvW pot fi eliberate terapeutic prin administrarea de desmopresina.

Timpul de injumatatire al FvW plasmatic este de ~8-12 ore. Aproximativ 15% din FvW circulant este localizat in compartimentul plachetar, acesta fiind derivat in intregime din sinteza intramedulara, dar ambele pool-uri de FvW sunt necesare pentru hemostaza. Celulele endoteliale secreta multimeri mai mari decat cei care circula in plasma; acestia sunt degradati de catre o metaloproteaza specifica, ADAMTS13, rezultand in reducerea in marime a celor mai mari multimeri. Scaderea activitatii ADAMTS13, congenitala sau prin inhibitori dobanditi, joaca un rol central in patofiziologia purpurei trombotice trombocitopenice^3;4.

FvW are situsuri de legare pentru FVIII, heparina, colagen, glicoproteinele plachetare GPIb si GPIIb-IIIa, detinand multiple functii in hemostaza. FvW stabilizeaza FVIII protejandu-l  fata de inactivarea de catre PC activata, prelungindu-i astfel timpul de injumatatire in circulatie si localizandu-l eficient la locul injuriei vasculare^1;2;4. Fiecare monomer de FvW are un situs de legare pentru FVIII, totusi in vivo numai 1-2% din monomeri sunt ocupati de FVIII, astfel explicandu-se faptul ca prezenta multimerilor foarte mari nu este esentiala pentru functia de carrier a FVIII. In orice caz, o modificare in nivelul plasmatic al FvW se asociaza cu modificari concordante ale concentratiei plasmatice de FVIII².

FvW este o proteina structurala si parte a matricei subendoteliale. De asemenea joaca un rol important in atasarea plachetelor la suprafetele subendoteliale, in mod particular la forte de forfecare moderate-mari (functie explorata partial in vivo prin masurarea timpului de sangerare), actioneaza ca punte intre plachete si promoveaza agregarea plachetara. Initial are loc ancorarea plachetelor la locul injuriei vasculare prin interactiunea FvW cu GPIb, urmata de activarea plachetara si expunerea GPIIb-IIIa, care leaga fibrinogenul, FvW si alti liganzi^1;4. Ambele activitati de legare ale FvW sunt maxime la multimerii cu greutate moleculara mare. Interactiunea dintre GPIb si FvW poate fi explorata in vitro prin adaugarea antibioticului ristocetina².

Nomenclatura recomandata  de Societatea Internationala de Hemostaza si Tromboza pentru complexul FVIII-FvW este²: 

 Anomaliile functiei FvW determina boala von Willebrand (vWD), cea mai frecventa boala hemoragica mostenita, cu o prevalenta de aproximativ 1% in populatia generala, insa cu o prevalenta a bolii semnificative clinic de 1:1000⁴. Afectiunea este caracterizata prin hemoragii cutaneo-mucoase, transmitere autosomal dominanta si prelungirea timpului de sangerare. Boala nu este omogena, pe de o parte datorita functiilor fiziologice multiple jucate de FvW, iar pe de alta parte prin demonstrarea de modele genetice diferite. Aproximativ 60% din variatiile nivelului FvW plasmatic sunt atribuite unor factori genetici. Astfel, indivizii cu grup sanguin 0 au niveluri de FvW in medie cu 30% mai mici decat cei cu celelalte grupe sanguine. In plus, nivelul de FvW este sub control hormonal; de asemenea este influentat si de alti factori care complica expresia bolii. Variatii de pana la 20% au fost raportate cu ciclul menstrual, nivelurile cele mai scazute fiind inregistrate in faza foliculara precoce. De asemenea nivelul creste cu ~15% la fiecare decada de inaintare in varsta³. Clasificarea actuala a vWD identifica doua categorii majore^2;3;4:

• Deficiente cantitativeale FvW:
  • Tipul 1, varianta cea mai comuna (70-80% din cazurile simptomatice de vWD), caracterizata prin deficienta partiala a FvW, insotita de reducerea concordanta a activitatii FVIII si activitatii de cofactor la ristocetina, in general intre 20 si 50% din normal, in asociere cu o structura normala a multimerilor.
  • Tipul 3 se asociaza cu deficiente severe si nivele foarte scazute sau nedetectabile de FvW. Este o forma rara, cu transmitere autosomal recesiva si caracterizata prin diateza hemoragica severa.
• Anomalii calitative ale FvW (tipul 2, reprezentand 20-30% din cazuri), cu 4 subtipuri reflectand mecanisme patofiziologice diferite:
  • Tipul 2A se caracterizeaza  prin absenta multimerilor de greutate moleculara mare si intermediara din plasma, rezultand in alterarea interactiunii FvW cu plachetele si se asociaza cu nivele ale activitatii cofactorului la ristocetina disproportionat de scazute comparativ cu antigenul FvW.
  • Tipul 2B  se caracterizeaza prin afinitate crescuta a FvW pentru GPIb plachetara, sangerarea la acesti pacienti rezultand paradoxal ca urmare a clearance-ului multimerilor cu greutate moleculara mare si plachetelor din circulatie, asociind trombocitopenie.
  • In tipul 2M interactiunea FvW cu GPIb este deficitara rezultand din defecte ale domeniului FvW care leaga GPIb, cu scaderea functiei plachetar-dependente, in prezenta de multimeri normali la electroforeza pe gel.
  • In tipul 2N (Normandy) afinitatea scazuta a FvW pentru FVIII determina niveluri plasmatice scazute ale FVIII. Acest tip este suspectat in prezenta unei reduceri marcate a nivelului FVIII in comparatie cu FvW (pseudohemofilia).

Au fost raportate si alte subtipuri, incluzand tipul plachetar (pseudo-vWD) care rezulta din mutatii la nivelul GPIb plachetare. De asemenea exista forme dobandite foarte rare de vWD asociate cu prezenta de autoanticorpi, in asociere cu boli autoimune, proliferari clonale, hipotiroidism^4;6;7.

vWD se manifesta ca un defect hemostatic multifatetat, deficienta FVIII si hemostaza primara anormala contribuind la tendinta hemoragica si conducand la anomalii de laborator caracteristice si distincte³. Expresia  clinica este in general usoara in tipul 1, cu cresterea severitatii in tipul 2 si tipul 3. Multi din pacientii cu tipul 1 de vWD pot fi asimptomatici. In general severitatea sangerarii se coreleaza cu gradul reducerii activitatii FVIII, dar nu cu gradul prelungirii timpului de sangerare sau cu tipul grupului sanguin². In formele usoare de vWD tabloul clinic este dominat de sangerarile cutaneo-mucoase (epistaxis, echimoze, sangerari gingivale, menometroragii), iar in formele cele mai severe, in care FVIII este scazut, pot aparea hemartroze si hematoame intramusculare, hemoragiile posttraumatice si postchirurgicale, in primul rand dupa extractii dentare, constituind riscul principal, ca si in hemofilia usoara³. vWD poate fi inalt prevalenta la pacientele cu menoragie izolata². In tipul 1 simptomele pot scadea in severitate in timpul sarcinii, terapiei estrogenice sau cu inaintarea in varsta. Pe de alta parte, riscul de sangerare la femeile cu vWD este mare postpartum cand nivelul de FvW scade brusc de la nivelele crescute dezvoltate in timpul sarcinii³.

Recomandari pentru efectuarea testelor – diagnosticul deficitului/anormalitatii FvW, subtiparea vWD si diferentierea de hemofilia A (impreuna cu determinarea activitatii FVIII); monitorizarea eficacitatii terapeutice a tratamentului cu desmopresina sau concentrat de FvW (FvW:RCo) ⁷.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate)⁵. Se va evita tratamentul cu anticoagulante orale cu 2 saptamani inainte, iar cu heparina cu doua zile inaintea testarii ; nu se va recolta de pe un cateter heparinizat⁶. Testele trebuie efectuate la distanta de transfuzii, tratament substitutiv cu FvW, administrarea de desmopresina⁷.

Specimen recoltat - sange venos⁵.

Recipient de recoltare – vacutainer cu citrat de Na 0.105M (raport citrat de sodiu – sange=1/9). Presiunea realizata de garou trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si cea a presiunii diastolice si nu trebuie sa depaseasca 1 minut. Daca punctia venoasa a esuat, o noua tentativa pe aceeasi vena nu se poate face decat dupa 10 minute⁵.

Cantitate recoltata – se vor recolta 2 vacutainere cat permite vacuumul; pentru a preveni coagularea partiala a probei se va asigura amestecul corect al sangelui cu anticoagulantul, prin miscari de inversiune a tubului⁵.

Prelucrare necesara dupa recoltare - proba va fi centrifugata 15 minute la 2500g, urmata imediat de separarea plasmei si congelarea acesteia; probele recoltate in afara laboratorului vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate⁵.

Cauze de respingere a probei - vacutainer care nu este plin; proba de singe hemolizata sau coagulata; plasma care nu a ajuns congelata la laborator⁵.

Stabilitate proba - plasma separata este stabila 4 saptamani la  – 20ºC⁵. 

Metoda 

FvW:Ag – imunoturbidimetrica: masoara nivelul de FvW independent de compozitia multimerilor plasmatici (particule de latex invelite in anticorpi policlonali specifici anti-FvW aglutineaza in prezenta antigenului FvW, determinand cresterea densitatii optice, direct proportional cu concentratia FvW din plasma testata)⁵.

FvW:RCo – plasma pacientului este mixata cu plachete fixate in formol, in prezenta ristocetinei, iar extensia agregarii plachetare este detectata foto-optic si este proportionala cu activitatea FvW din plasma⁶.

Valori de referinta⁵

Interpretarea rezultatelor

vWD trebuie luata in considerare pentru diagnosticul diferential al oricarui pacient cu istoric personal si familial de sangerare si care are PT si aPTT normale. aPTT poate fi prelungit in formele severe de vWD cu nivele scazute de FVIII⁶. De asemenea numarul de trombocite este in general normal, insa la pacientii cu tipul 2B poate sa apara trombocitopenia. Timpul de sangerare este de obicei prelungit, dar poate fi normal in forme usoare de vWD.

In tabel sunt prezentate modificarile celor doua teste specifice pentru FvW impreuna cu activitatea FVIII in diferitele tipuri de vWD^2;6;7

In tipul 1 de vWD severitatea clinica se coreleaza cu FvW:RCo. Un nivel foarte scazut al FvW:Ag sugereaza tipul 3 de boala.

FvW:Ag, FvW:RCo si activitatea FVIII trebuie masurate pe aceeasi proba, un raport FvW:Ag : FvW:RCo <0.7 sugerand tipul 2, iar un raport FVIII:C : FvW:Ag <0.7 sugerand tipul 2N de vWD.

In hemofilie nivelul de FvW este normal²

Limite si intreferente

FvW este un reactant de faza acuta, iar la pacientii cu deficit congenital nivelul sau poate creste pana la valori normale intr-o serie de conditii clinice tranzitorii, cum ar fi: stres, inflamatie, infectii acute, efort fizic, postchirurgical, trimestrele II si III de sarcina, precum si in administrarea de estrogeni^3;4;6. De aceea, este preferabila evaluarea pacientului la distanta de aceste situatii. Pe de alta parte, este improbabil ca sarcina sau o reactie de faza acuta sa mascheze deficitele cantitative severe sau pe cele calitative.

Acidul valproic, hipotiroidismul si bolile cardiace valvulare pot scadea FvW³.

Obtinerea de nivele la limita inferioara a normalului atat pentru FvW:Ag cat si pentru FvW:RCo nu exclude diagnosticul de vWD (tipul 1), fiind necesara repetarea testarii⁷.

Aceste teste nu diferentiaza intre tipurile 2A versus 2B, respectiv 2M, sau tipul plachetar (pseudo-vWD), fiind necesare testarea agregarii plachetare induse de ristocetina si/sau analiza multimerilor FvW⁵. De asemenea teste genetice pot fi necesare pentru diferentierea unor tipuri 2B de tipul 2A.

Testul care determina activitatea cofactorului ristocetinei este diferit de cel care masoara agregarea plachetara indusa de ristocetina, care utilizeaza trombocitele si plasma proaspata ale pacientului si care este util in special pentru tipul 2B si tipul plachetar (pseudo-vWD) ³.

Prezenta factorului reumatoid, anticorpilor anti-albumina bovina sau anti-iepure pot duce la supraestimarea nivelului FvW:Ag.

Plasma tulbure poate duce la subestimarea nivelului de FvW:Ag⁵.

Bibliografie

1. Brummel-Ziedins K, Orfeo T, et al. “Blood Coagulation and Fibrinolysis”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 553-4.

2. Castaman G, Tosseto A, Rodeghiero F. „von Willebrand Disease”. In Practical Hemostasis and Thrombosis, O’Shaughnessy D, Makris M, Lillicrap D eds, Blackwell Publishing, 2008, 51-56.

3. Friedman K, Rodgers G. „Inherited Coagulation Disorders”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1386-92.

4. Johnsen J, Ginsburg D. „von Willebrand Disease”. In Williams Hematology, Lichtman M, Beutler E, Kipps T, Seligsohn U, Kaushansky K, Prchal J., 7th ed, McGraw-Hill Medical, 2006, 1929-37.

5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate, 2010. Ref Type: Catalog.

6. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. von Willebrand Profile. www.labcorp.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.

7. Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories. Reference Laboratory Services for Health Care Organizations. von Willebrand Disease, von Willebrand Factor Antigen, Ristocetin Cofactor, Plasma. www.mayomedicallaboratories.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.

Factorul von Willebrand (FvW) este o glicoproteina de adeziune, cu multiple roluri in coagulare, care circula in plasma sub forma unui amestec heterogen de multimeri legati disulfidic. FvW este sintetizat in celulele endoteliale si megakariocite sub forma unei pre-pro-molecule, continand un peptid semnal de 22 aminoacizi, un propeptid de 741 aminoacizi si proteina matura de 2050 aminoacizi. FvW este neobisnuit de bogat in cisteina, implicata in formarea de legaturi disulfidice. Monomerii pro-FvW sunt asamblati la nivelul reticulului endoplasmic in dimeri prin legaturi disulfidice ale capetelor C-terminale, iar multimerizarea are loc in aparatul Golgi prin formarea de legaturi disulfidice ale capetelor N-terminale ale dimerilor adiacenti, proces ce pare a fi catalizat de o activitate disulfid-izomerazica localizata in propeptidul FvW⁴. Clivarea propeptidului are loc dupa asamblarea multimerilor, in special intracelular, dar poate avea loc si dupa secretie. Multimerii de FvW variaza in marime, de la dimerii de 600 000D la multimerii foarte mari de 20 milioane D. FvW este stocat  in α-granulele plachetare si in corpusculii Weibel-Palade din celulele endoteliale, acestea fiind formele cele mai mari si mai potente biologic. Rezervele endoteliale de FvW pot fi eliberate terapeutic prin administrarea de desmopresina.

Timpul de injumatatire al FvW plasmatic este de ~8-12 ore. Aproximativ 15% din FvW circulant este localizat in compartimentul plachetar, acesta fiind derivat in intregime din sinteza intramedulara, dar ambele pool-uri de FvW sunt necesare pentru hemostaza. Celulele endoteliale secreta multimeri mai mari decat cei care circula in plasma; acestia sunt degradati de catre o metaloproteaza specifica, ADAMTS13, rezultand in reducerea in marime a celor mai mari multimeri. Scaderea activitatii ADAMTS13, congenitala sau prin inhibitori dobanditi, joaca un rol central in patofiziologia purpurei trombotice trombocitopenice^3;4.

FvW are situsuri de legare pentru FVIII, heparina, colagen, glicoproteinele plachetare GPIb si GPIIb-IIIa, detinand multiple functii in hemostaza. FvW stabilizeaza FVIII protejandu-l  fata de inactivarea de catre PC activata, prelungindu-i astfel timpul de injumatatire in circulatie si localizandu-l eficient la locul injuriei vasculare^1;2;4. Fiecare monomer de FvW are un situs de legare pentru FVIII, totusi in vivo numai 1-2% din monomeri sunt ocupati de FVIII, astfel explicandu-se faptul ca prezenta multimerilor foarte mari nu este esentiala pentru functia de carrier a FVIII. In orice caz, o modificare in nivelul plasmatic al FvW se asociaza cu modificari concordante ale concentratiei plasmatice de FVIII².

FvW este o proteina structurala si parte a matricei subendoteliale. De asemenea joaca un rol important in atasarea plachetelor la suprafetele subendoteliale, in mod particular la forte de forfecare moderate-mari (functie explorata partial in vivo prin masurarea timpului de sangerare), actioneaza ca punte intre plachete si promoveaza agregarea plachetara. Initial are loc ancorarea plachetelor la locul injuriei vasculare prin interactiunea FvW cu GPIb, urmata de activarea plachetara si expunerea GPIIb-IIIa, care leaga fibrinogenul, FvW si alti liganzi^1;4. Ambele activitati de legare ale FvW sunt maxime la multimerii cu greutate moleculara mare. Interactiunea dintre GPIb si FvW poate fi explorata in vitro prin adaugarea antibioticului ristocetina².

Nomenclatura recomandata  de Societatea Internationala de Hemostaza si Tromboza pentru complexul FVIII-FvW este²:

 Anomaliile functiei FvW determina boala von Willebrand (vWD), cea mai frecventa boala hemoragica mostenita, cu o prevalenta de aproximativ 1% in populatia generala, insa cu o prevalenta a bolii semnificative clinic de 1:1000⁴. Afectiunea este caracterizata prin hemoragii cutaneo-mucoase, transmitere autosomal dominanta si prelungirea timpului de sangerare. Boala nu este omogena, pe de o parte datorita functiilor fiziologice multiple jucate de FvW, iar pe de alta parte prin demonstrarea de modele genetice diferite. Aproximativ 60% din variatiile nivelului FvW plasmatic sunt atribuite unor factori genetici. Astfel, indivizii cu grup sanguin 0 au niveluri de FvW in medie cu 30% mai mici decat cei cu celelalte grupe sanguine. In plus, nivelul de FvW este sub control hormonal; de asemenea este influentat si de alti factori care complica expresia bolii. Variatii de pana la 20% au fost raportate cu ciclul menstrual, nivelurile cele mai scazute fiind inregistrate in faza foliculara precoce. De asemenea nivelul creste cu ~15% la fiecare decada de inaintare in varsta³. Clasificarea actuala a vWD identifica doua categorii majore^2;3;4:

• Deficiente cantitativeale FvW:
  • Tipul 1, varianta cea mai comuna (70-80% din cazurile simptomatice de vWD), caracterizata prin deficienta partiala a FvW, insotita de reducerea concordanta a activitatii FVIII si activitatii de cofactor la ristocetina, in general intre 20 si 50% din normal, in asociere cu o structura normala a multimerilor.
  • Tipul 3 se asociaza cu deficiente severe si nivele foarte scazute sau nedetectabile de FvW. Este o forma rara, cu transmitere autosomal recesiva si caracterizata prin diateza hemoragica severa.
• Anomalii calitative ale FvW (tipul 2, reprezentand 20-30% din cazuri), cu 4 subtipuri reflectand mecanisme patofiziologice diferite:
  • Tipul 2A se caracterizeaza  prin absenta multimerilor de greutate moleculara mare si intermediara din plasma, rezultand in alterarea interactiunii FvW cu plachetele si se asociaza cu nivele ale activitatii cofactorului la ristocetina disproportionat de scazute comparativ cu antigenul FvW.
  • Tipul 2B  se caracterizeaza prin afinitate crescuta a FvW pentru GPIb plachetara, sangerarea la acesti pacienti rezultand paradoxal ca urmare a clearance-ului multimerilor cu greutate moleculara mare si plachetelor din circulatie, asociind trombocitopenie.
  • In tipul 2M interactiunea FvW cu GPIb este deficitara rezultand din defecte ale domeniului FvW care leaga GPIb, cu scaderea functiei plachetar-dependente, in prezenta de multimeri normali la electroforeza pe gel.
  • In tipul 2N (Normandy) afinitatea scazuta a FvW pentru FVIII determina niveluri plasmatice scazute ale FVIII. Acest tip este suspectat in prezenta unei reduceri marcate a nivelului FVIII in comparatie cu FvW (pseudohemofilia).

Au fost raportate si alte subtipuri, incluzand tipul plachetar (pseudo-vWD) care rezulta din mutatii la nivelul GPIb plachetare. De asemenea exista forme dobandite foarte rare de vWD asociate cu prezenta de autoanticorpi, in asociere cu boli autoimune, proliferari clonale, hipotiroidism^4;6;7.

vWD se manifesta ca un defect hemostatic multifatetat, deficienta FVIII si hemostaza primara anormala contribuind la tendinta hemoragica si conducand la anomalii de laborator caracteristice si distincte³. Expresia  clinica este in general usoara in tipul 1, cu cresterea severitatii in tipul 2 si tipul 3. Multi din pacientii cu tipul 1 de vWD pot fi asimptomatici. In general severitatea sangerarii se coreleaza cu gradul reducerii activitatii FVIII, dar nu cu gradul prelungirii timpului de sangerare sau cu tipul grupului sanguin². In formele usoare de vWD tabloul clinic este dominat de sangerarile cutaneo-mucoase (epistaxis, echimoze, sangerari gingivale, menometroragii), iar in formele cele mai severe, in care FVIII este scazut, pot aparea hemartroze si hematoame intramusculare, hemoragiile posttraumatice si postchirurgicale, in primul rand dupa extractii dentare, constituind riscul principal, ca si in hemofilia usoara³. vWD poate fi inalt prevalenta la pacientele cu menoragie izolata². In tipul 1 simptomele pot scadea in severitate in timpul sarcinii, terapiei estrogenice sau cu inaintarea in varsta. Pe de alta parte, riscul de sangerare la femeile cu vWD este mare postpartum cand nivelul de FvW scade brusc de la nivelele crescute dezvoltate in timpul sarcinii³.

Recomandari pentru efectuarea testelor – diagnosticul deficitului/anormalitatii FvW, subtiparea vWD si diferentierea de hemofilia A (impreuna cu determinarea activitatii FVIII); monitorizarea eficacitatii terapeutice a tratamentului cu desmopresina sau concentrat de FvW (FvW:RCo) ⁷.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate)⁵. Se va evita tratamentul cu anticoagulante orale cu 2 saptamani inainte, iar cu heparina cu doua zile inaintea testarii ; nu se va recolta de pe un cateter heparinizat⁶. Testele trebuie efectuate la distanta de transfuzii, tratament substitutiv cu FvW, administrarea de desmopresina⁷.

Specimen recoltat - sange venos⁵.

Recipient de recoltare – vacutainer cu citrat de Na 0.105M (raport citrat de sodiu – sange=1/9). Presiunea realizata de garou trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si cea a presiunii diastolice si nu trebuie sa depaseasca 1 minut. Daca punctia venoasa a esuat, o noua tentativa pe aceeasi vena nu se poate face decat dupa 10 minute⁵.

Cantitate recoltata – se vor recolta 2 vacutainere cat permite vacuumul; pentru a preveni coagularea partiala a probei se va asigura amestecul corect al sangelui cu anticoagulantul, prin miscari de inversiune a tubului⁵.

Prelucrare necesara dupa recoltare - proba va fi centrifugata 15 minute la 2500g, urmata imediat de separarea plasmei si congelarea acesteia; probele recoltate in afara laboratorului vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate⁵.

Cauze de respingere a probei - vacutainer care nu este plin; proba de singe hemolizata sau coagulata; plasma care nu a ajuns congelata la laborator⁵.

Stabilitate proba - plasma separata este stabila 4 saptamani la  – 20ºC⁵. 

Metoda 

FvW:Ag – imunoturbidimetrica: masoara nivelul de FvW independent de compozitia multimerilor plasmatici (particule de latex invelite in anticorpi policlonali specifici anti-FvW aglutineaza in prezenta antigenului FvW, determinand cresterea densitatii optice, direct proportional cu concentratia FvW din plasma testata)⁵.

FvW:RCo – plasma pacientului este mixata cu plachete fixate in formol, in prezenta ristocetinei, iar extensia agregarii plachetare este detectata foto-optic si este proportionala cu activitatea FvW din plasma⁶.

Valori de referinta⁵

 Interpretarea rezultatelor

vWD trebuie luata in considerare pentru diagnosticul diferential al oricarui pacient cu istoric personal si familial de sangerare si care are PT si aPTT normale. aPTT poate fi prelungit in formele severe de vWD cu nivele scazute de FVIII⁶. De asemenea numarul de trombocite este in general normal, insa la pacientii cu tipul 2B poate sa apara trombocitopenia. Timpul de sangerare este de obicei prelungit, dar poate fi normal in forme usoare de vWD.

In tabel sunt prezentate modificarile celor doua teste specifice pentru FvW impreuna cu activitatea FVIII in diferitele tipuri de vWD^2;6;7

In tipul 1 de vWD severitatea clinica se coreleaza cu FvW:RCo. Un nivel foarte scazut al FvW:Ag sugereaza tipul 3 de boala.

FvW:Ag, FvW:RCo si activitatea FVIII trebuie masurate pe aceeasi proba, un raport FvW:Ag : FvW:RCo <0.7 sugerand tipul 2, iar un raport FVIII:C : FvW:Ag <0.7 sugerand tipul 2N de vWD.

In hemofilie nivelul de FvW este normal²

Limite si intreferente

FvW este un reactant de faza acuta, iar la pacientii cu deficit congenital nivelul sau poate creste pana la valori normale intr-o serie de conditii clinice tranzitorii, cum ar fi: stres, inflamatie, infectii acute, efort fizic, postchirurgical, trimestrele II si III de sarcina, precum si in administrarea de estrogeni^3;4;6. De aceea, este preferabila evaluarea pacientului la distanta de aceste situatii. Pe de alta parte, este improbabil ca sarcina sau o reactie de faza acuta sa mascheze deficitele cantitative severe sau pe cele calitative.

Acidul valproic, hipotiroidismul si bolile cardiace valvulare pot scadea FvW³.

Obtinerea de nivele la limita inferioara a normalului atat pentru FvW:Ag cat si pentru FvW:RCo nu exclude diagnosticul de vWD (tipul 1), fiind necesara repetarea testarii⁷.

Aceste teste nu diferentiaza intre tipurile 2A versus 2B, respectiv 2M, sau tipul plachetar (pseudo-vWD), fiind necesare testarea agregarii plachetare induse de ristocetina si/sau analiza multimerilor FvW⁵. De asemenea teste genetice pot fi necesare pentru diferentierea unor tipuri 2B de tipul 2A.

Testul care determina activitatea cofactorului ristocetinei este diferit de cel care masoara agregarea plachetara indusa de ristocetina, care utilizeaza trombocitele si plasma proaspata ale pacientului si care este util in special pentru tipul 2B si tipul plachetar (pseudo-vWD) ³.

Prezenta factorului reumatoid, anticorpilor anti-albumina bovina sau anti-iepure pot duce la supraestimarea nivelului FvW:Ag.

Plasma tulbure poate duce la subestimarea nivelului de FvW:Ag⁵.

Bibliografie

1. Brummel-Ziedins K, Orfeo T, et al. “Blood Coagulation and Fibrinolysis”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 553-4.

2. Castaman G, Tosseto A, Rodeghiero F. „von Willebrand Disease”. In Practical Hemostasis and Thrombosis, O’Shaughnessy D, Makris M, Lillicrap D eds, Blackwell Publishing, 2008, 51-56.

3. Friedman K, Rodgers G. „Inherited Coagulation Disorders”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1386-92.

4. Johnsen J, Ginsburg D. „von Willebrand Disease”. In Williams Hematology, Lichtman M, Beutler E, Kipps T, Seligsohn U, Kaushansky K, Prchal J., 7th ed, McGraw-Hill Medical, 2006, 1929-37.

5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate, 2010. Ref Type: Catalog.

6. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. von Willebrand Profile. www.labcorp.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.

7. Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories. Reference Laboratory Services for Health Care Organizations. von Willebrand Disease, von Willebrand Factor Antigen, Ristocetin Cofactor, Plasma. www.mayomedicallaboratories.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.

Plasminogenul este precursorul inactiv al plasminei, catalizatorul primar al degradarii fibrinei. Plasminogenul este sintetizat in ficat si este prezent in diferite tesuturi si fluide, incluzand saliva, secretia lacrimala, lichidul seminal, secretia prostatica. Timpul de injumatatire in circulatie este de ~2 zile, acesta putandu-se scurta dramatic in conditii asociate cu activarea sistemului fibrinolitic. Molecula de plasminogen este o glicoproteina formata dintr-un singur lant polipeptidic de 791 aminoacizi, cu o greutate moleculara relativa de 88kD, cu un continut carbohidrat de 2%. In functie de continutul de carbohidrat,  in plasma circula 2 variante majore de plasminogen in cantitati aproape egale, diferite functional. De asemenea exista o heterogenitate in secventa primara a plasminogenului, reflectand existenta a doua polimorfisme cu incidenta crescuta si a altor cateva cu incidenta scazuta in populatia umana. Plasminogenul secretat in sange are un acid glutamic la capatul N-terminal, fiind denumit Glu-plasminogen; in urma proteolizei de catre plasmina in unul din mai multe situsuri posibile rezulta o forma degradata de plasminogen, produsul cel mai frecvent fiind Lys-plasminogen. Situsul primar de formare a Lys-plasminogen este cheagul de fibrina, iar timpul sau de injumatatire este mai scurt (0.8 zile); aceasta forma modificata conformational a zimogenului leaga mai rapid fibrina, prezinta o aviditate de 2-3 ori mai mare pentru receptorii celulari si este activata de 10-20 ori mai rapid. Molecula de plasminogen contine 5 domenii kringle (K1-K5), de 78-80 aminoacizi, domeniile K1 si K4 continand situsurile care regleaza legarea plasminogenului la fibrina, α₂-antiplasmina, glicoproteine bogate in histidina, kininogeni, trombospondina si receptori celulari de suprafata; aceste situsuri leaga reziduuri de lizina de la nivelul moleculelor tinta.

Glu-plasminogenul este convertit de catre activatorii plasminogenului, u-PA sau t-PA, fie in plasma sau la nivelul cheagului de fibrina, in Glu-plasmina, care contine triada catalitica specifica serin proteazelor (His-Asp-Ser) si care degradeaza fibrinogenul, fibrina si alte molecule tinta. Glu-plasmina se poate autodigera, cel mai frecvent la Lys-plasmina. Plasmina este inhibata de catre α₂-antiplasmina care are o actiune mai eficienta in afara cheagului de fibrina^1;3.

A fost descrisa deficienta congenitala a plasminogenului, ce poate fi de tipul I sau hipoplasminogenemia, respectiv deficienta antigenului si activitatii, ori tipul II sau displasminogenemia, cu antigen normal si activitate redusa. Deficientele cantitative sunt mostenite ca o boala autosomal dominanta, in timp ce defectele calitative sunt de obicei mostenite autosomal recesiv. Displasminogenemia este mai comuna la japonezi, cu o singura mutatie prezenta in peste 90% din cazuri². Manifestarile clinice asociate cu deficienta homozigota sunt trombofilia si conjunctivita lemnoasa, dar comparativ cu alte conditii trombofilice riscul de tromboza nu este atat de mare^1;3;6. Ambele tipuri de deficienta au fost descrise la pacienti cu tromboza venoasa (in particular in Japonia), dar alte studii nu au putut determina faptul ca deficienta izolata de plasminogen este un factor de risc pentru tromboza venoasa. Riscul este agravat cand se combina cu alte cauze mostenie sau dobandite de trombofilie⁶. Deficienta severa de plasminogen cu nivele de 5-6% din normal este o entitate rara care se manifesta ca o boala pseudomembranoasa afectand membranele mucoase (de ex. conjunctivita lemnoasa la nivelul ochiului), dar surprinzator nu cu tromboza venoasa⁷. Semnificatia deficientei heterozigote ramane disputata^1;5;6.

Deficienta dobandita de plasminogen, care poate aparea in boli hepatice, sepsis, terapia trombolitica (cu t-PA, u-PA sau streptokinaza), CID/fibrinoliza sistemica, febra hemoragica argentiniana, leucemie, rezultand din scaderea sintezei sau cresterea catabolismului, a fost asociata cu ocluzii vasculare trombotice^3;6.

Recomandari pentru efectuarea testelor – evaluarea pacientilor cu istoric de tromboza si cu teste negative pentru factorii de risc trombotic comuni; evaluarea pacientilor cu conjunctivita lemnoasa; evaluarea fibrinolizei (in combinatie cu alte componente ale sistemului fibrinolitic: fibrinogen, PAI-1, D-dimeri); monitorizarea terapiei trombolitice^5;6.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate)⁴. Se va evita tratamentul cu anticoagulante orale cu 2 saptamani inainte, iar cu heparina cu doua zile inaintea testarii ; nu se va recolta de pe un cateter heparinizat⁵.

Specimen recoltat - sange venos⁴.

Recipient de recoltare – vacutainer cu citrat de Na 0.105M (raport citrat de sodiu – sange=1/9). Presiunea realizata de garou trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si cea a presiunii diastolice si nu trebuie sa depaseasca 1 minut. Daca punctia venoasa a esuat, o noua tentativa pe aceeasi vena nu se poate face decat dupa 10 minute⁴.

Cantitate recoltata - cat permite vacuumul; pentru a preveni coagularea partiala a probei se va asigura amestecul corect al sangelui cu anticoagulantul, prin miscari de inversiune a tubului⁴.

Prelucrare necesara dupa recoltare - proba va fi centrifugata 15 minute la 2500g, urmata imediat de separarea plasmei si congelarea acesteia; probele recoltate in afara laboratorului vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate⁴.

Cauze de respingere a probei - vacutainer care nu este plin; proba de singe hemolizata sau coagulata; plasma care nu a ajuns congelata la laborator⁴.

Stabilitate proba - plasma separata este stabila 4 saptamani la  – 20ºC.⁴ 

Metoda – test cromogenic (plasma pacientului este mixata cu un exces de streptokinaza in prezenta fibrinogenului cu formarea complexului plasminogen-streptokinaza care converteste un substrat cromogenic; activitatea enzimatica a complexului nu este inhibata de inhibitorii plasmatici).^5,6

Valori de referinta – 80.2-132.5%⁴.

Interpretarea rezultatelor

Acest test identifica ambele tipuri, I si II, de deficienta a plasminogenului.

Deficienta ereditara este foarte rara; o reducere a activitatii plasminogenului poate reprezenta o deficienta congenitala, daca poate fi exclusa deficienta dobandita, care este mult mai frecventa⁶.

Limite si intreferente

Nivelul de plasminogen este scazut la nastere, ~50% din nivelul de la adult, chiar mai mici la prematuri, si atinge nivelul de la adult la 6 luni^4;5. Valorile pot creste marcat in trimestrele II si III de sarcina⁵.

Bibliografie

1. Brummel-Ziedins K, Orfeo T, et al. “Blood Coagulation and Fibrinolysis”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 573-5.

2. Deitcher S, Rodgers G. „Thrombosis and Antithrombotic Therapy”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1476.

3. Hajjar K, Francis C. „Fibrinolysis and Thrombolysis”. In Williams Hematology, Lichtman M, Beutler E, Kipps T, Seligsohn U, Kaushansky K, Prchal J., 7th ed, McGraw-Hill Medical, 2006, 2089-97.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate, 2010. Ref Type: Catalog.

5. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Plasminogen Activity. www.labcorp.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.

6. Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories. Reference Laboratory Services for Health Care Organizations. Plasminogen Activity, Plasma. www.mayomedicallaboratories.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.

7. Seligsohn U, Griffin J. „Hereditary Thrombophilia”. In Williams Hematology, Lichtman M, Beutler E, Kipps T, Seligsohn U, Kaushansky K, Prchal J., 7th ed, McGraw-Hill Medical, 2006, 1990.

PAI-1 este inhibitorul fiziologic primar al activarii plasminogenului in sange, tintind t-PA (activatorul tisular al plasminogenului) si u-PA (urokinaza), jucand astfel un rol important in reglarea fibrinolizei. In afara functiei proteolitice acesta pare a avea un rol in remodelarea tisulara prin interferarea cu procesele de adeziune si migrare celulara dependente de vitronectina¹.

Situsurile potentiale de sinteza constitutiva a PAI-1 includ ficatul, splina, tesutul adipos, celulele endoteliale, macrofagele, megakariocitele¹. Eliberarea PAI-1 este stimulata de citokine, factori de crestere si lipoproteine in cadrul raspunsului inflamator global³. Fractiunea majora a PAI-1 in sange este prezenta in α-granulele plachetare, aparent sintetizata in megakariocite. Timpul de injumatatire al PAI-1 in sange este <10 minute, acesta circuland in asociere noncovalenta cu vitronectina, o componenta a plasmei si matrixului pericelular^1;3.

PAI-1 este o glicoproteina formata dintr-un singur lant polipeptidic de 379 aminoacizi, din care lipsesc complet reziduurile de cisteina, cu o GM relativa de 50kD si 13% continut carbohidrat. Este o serpina inhibitorie cu un situs reactiv format dintr-o legatura Arg-Met; interactiunea cu t-PA sau u-PA duce la formarea rapida a unui complex reversibil, iar clivarea situsului reactiv de catre proteaza determina o ampla modificare conformationala a inhibitorului si proteazei, cu inactivarea ambelor. PAI-1 se converteste spontan intr-o forma inactiva (latenta), in care situsul reactiv este inaccesibil proteazelor. O forma mutanta de PAI-1 eate stabilizata in conformatia activa ca urmare a unor substitutii in 4 situsuri ale genei PAI-1¹. Toate formele circulante de PAI-1 (activa, latenta, complexata cu t-PA sau u-PA) sunt detectate ca antigen PAI-1⁶.

Atat PAI-1 cat si t-PA se caracterizeaza prin rate de turnover crescute, cu PAI-1 functional mentinut la concentratii molare de cateva ori in exces fata de concentratiile t-PA functional. De asemenea 80% din antigenul t-PA din plasma este gasit complexat cu PAI-1, timpul de injumatatire al complexelor fiind de ~5 minute. Spre deosebire de t-PA, PAI-1 formeaza complexe numai cu varianta formata din 2 lanturi a urokinazei (tcu-PA),  si nu complexeaza cu forma cu un singur lant a acesteia (scu-PA). Conversia scu-PA in tcu-PA are loc la nivelul lizei cheagului de fibrina. Urokinaza este implicata in procese fiziologice si patologice implicand dezvoltarea embrionara, vindecarea ranilor, migrarea celulara, inflamatie, metastazarea celulelor tumorale. Studiile in vitro sugereaza rolul reglator al PAI-1 ca inhibitor al evenimentelor mediate de u-PA in afara vaselor.

Deficienta congenitala de PAI-1 este rara, cu indivizii homozigoti manifestand sangerare excesiva ca raspuns la traumatisme, fara alte anomalii de dezvoltare sau de alta natura¹.

La populatia normala concentratia plasmatica de PAI-1 variaza intr-un range de peste 15 ori (6-80 ng/mL) si prezinta variatii circadiene, cu nivelul de varf dimineata si niveluri scazute seara. Aceasta variabilitate se datoreaza pe de o parte polimorfismului genei PAI-1, iar pe de alta parte responsivitatii expresiei genei PAI-1 la o varietate larga de conditii fiziologice si agenti farmacologici¹. Niveluri crescute de PAI-1 au fost raportate in boli maligne, hepatice, postchirurgical, soc septic, trimestrele II si III de sarcina, obezitate, rezistenta la insulina, diabet, hipertensiune, boala coronariana^5;6. Tratamentul hipertensiunii arteriale cu inhibitori ai enzimei de conversie sau antagonisti ai receptorului angiotensinei II, tratamentul cu gemfibrozil, consumul modest de alcool si tratamentul hormonal substitutiv postmenopauza scad productia PAI-1².

Nivelurile crescute de PAI-1 au fost asociate cu tromboza venoasa si arteriala. Un studiu european a demonstrat o incidenta crescuta a evenimentelor vasculare asociate cu niveluri bazale mai mari ale antigenului PAI-1. Teoretic niveluri marcat crescute ale PAI-1 ar putea afecta incercarile de tromboliza farmacologica la pacientii cu tromboza arteriala si venoasa. Niveluri crescute de PAI-1 au fost gasite la 59% din pacientii tineri cu trombembolism arterial neexplicat. Acelasi defect a fost descoperit la pacientii cu tromboza venoasa recurenta. La pacientii cu interventii chirurgicale majore s-au decelat niveluri crescute de PAI-1 ca parte a raspunsului de faza acuta². Nivelurile crescute de PAI-1 par a fi un factor de risc independent pentru reocluzia vasculara la supravietuitorii tineri dupa infarctul miocardic.  De asemenea acestea au fost asociate cu tromboza venoasa profunda dupa chirurgia de inlocuire a soldului si la indivizii cu rezistenta la insulina. Pe de alta parte, PAI-1 fiind un reactant de faza acuta ar putea sa nu fie direct responsabil de tendinta protrombotica observata³. Antigenul PAI-1 a fost identificat ca un marker independent pentru aparitia bolii veno-ocluzive dupa transplantul medular si poate distinge boala veno-ocluziva de alte cauze de hiperbilirubinemie post-transplant medular, cum ar fi boala grefa contra gazda sau toxicitatea medicamentoasa. In plus antigenul PAI-1 si bilirubina sunt variabile independente pentru predictia bolii veno-ocluzive severe⁵.

Recomandari pentru efectuarea testului – identificarea deficitului/nivelului crescut ereditar de PAI-1; determinarea riscului de boala veno-ocluziva asociata cu transplantul medular; marker prognostic pentru aparitia/reaparitia trombozei; evaluarea fibrinolizei (in combinatie cu alte componente ale sistemului fibrinolitic: fibrinogen, plasminogen, D-dimeri).⁵

Pregatire pacient – pacientul trebuie sa fie linistit si colectarea se face dimineata pentru evitarea variatiilor diurne ale rezultatelor⁴.

Specimen recoltat - sange venos⁴.

Recipient de recoltare – vacutainer cu citrat de Na 0.105M (raport citrat de sodiu – sange=1/9). Presiunea realizata de garou trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si cea a presiunii diastolice si nu trebuie sa depaseasca 1 minut. Daca punctia venoasa a esuat, o noua tentativa pe aceeasi vena nu se poate face decat dupa 10 minute⁴.

Cantitate recoltata - cat permite vacuumul; pentru a preveni coagularea partiala a probei se va asigura amestecul corect al sangelui cu anticoagulantul, prin miscari de inversiune a tubului⁴.

Prelucrare necesara dupa recoltare - centrifugare 15 min. la 2500 g pentru obtinerea plasmei(plasma trebuie sa fie foarte saraca in trombocite, T <10000/μL – dubla centrifugare), urmata imediat de separarea plasmei si congelarea acesteia; probele recoltate in afara laboratorului vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate⁴.

Cauze de respingere a probei - vacutainer care nu este plin; proba de singe hemolizata sau coagulata; plasma care nu a ajuns congelata la laborator⁴.

Stabilitate proba - plasma separata este stabila 4 saptamani la – 20ºC⁴. 

Metoda – test imunoenzimatic (EIA) ⁴.

Valori de referinta – 4-43 ng/mL⁴.

Limite si intreferente

Colectarea si procesarea incorecta a probei poate duce la eliberarea si activarea PAI-1 din trombocite^5,6.

Prezenta anticorpilor monoclonali proveniti de la soarece poate duce la obtinerea de rezultate eronate⁵.

Bibliografie

1. Brummel-Ziedins K, Orfeo T, et al. “Blood Coagulation and Fibrinolysis”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 582-3.

2. Deitcher S, Rodgers G. „Thrombosis and Antithrombotic Therapy”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1476.

3. Hajjar K, Francis C. „Fibrinolysis and Thrombolysis”. In Williams Hematology, Lichtman M, Beutler E, Kipps T, Seligsohn U, Kaushansky K, Prchal J., 7th ed, McGraw-Hill Medical, 2006, 2094, 2097-98.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate, 2010. Ref Type: Catalog.

5. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Plasminogen Activator Inhibitor (PAI) Antigen. www.labcorp.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.

6. Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories. Reference Laboratory Services for Health Care Organizations. Plasminogen Activator Inhibitor, Plasma. www.mayomedicallaboratories.com. 2010. Ref Type: Internet Communication.

Factorul II sau protrombina este o glicoproteina care se gaseste in plasma normala si constituie impreuna cu  fibrinogenul factorul de baza al coagularii^2;5.

Din protrombina, sub actiunea protrombinazei, rezulta trombina, enzima cheie a coagularii. Cantitatea de protrombina consumata in aceasta reactie este direct proportionala cu cantitatea de trombina generata. Protrombina este produsa in ficat iar vitamina K detine un rol important in sinteza acesteia¹.

Deficitul de factor II poate fi constitutional (congenital) sau dobandit; la rindul sau deficitul congenital poate fi cantitativ (tip1 – hipoprotrombinemie) sau calitativ (tip 2 – disprotrombinemie). Genele implicate sunt situate pe o pereche de cromozomi somatici. Transmiterea defectului se face autozomal recesiv, fiind inregistrate multiple variante genetice (mutatii pe situsuri diferite). Heterozigotii sunt de obicei asimptomatici; la homozigoti boala debuteaza in copilarie cu hemoragii cutaneo-mucoase si hemoragii profunde de severitate variabila. Manifestarile clinice survin atunci cind activitatea factorului II este de 4-7%. Tratamentul manifestarilor hemoragice consta in administrarea de plasma si complex protrombinic activat^2;7.

Deficitul ereditar de protrombina este o afectiune foarte rara, fiind raportate in literatura aproximativ 100 cazuri.

Hipoprotrombinemia izolata dobandita  este rara, in schimb cea asociata cu deficienta altor factori din complexul protrombinic (VII, IX, X) este mult mai frecventa. Aceasta  se datoreaza deficitului de vitamina K si poate surveni in urmatoarele situatii:

- aport scazut de vitamina K: carenta alimentara;

- deficit de sinteza intestinala (distrugerea florei bacteriene intestinale sub tratament antibiotic);

- absorbtie intestinala scazuta: tranzit intestinal accelerat, sindroame de malabsorbtie (ex: boala celiaca), obstructie biliara, obstacol in circulatia porta;

- deficit de utilizare a vitaminei K: insuficienta hepatica grava, supradozare de anticoagulante orale^2;3;5.

In cazul deficitului de protrombina testele de hemostaza prezinta urmatoarele modificari: timpul de tromboplastina partiala activat (APTT) si timpul Quick sunt alungite, in timp ce timpul de trombina este normal.

Testul efectuat in laboratorul nostru masoara activitatea factorului II pe baza careia pot fi identificate  atat deficitul cantitativ cat si cel calitativ de protrombina^1;6.

Recomandari privind efectuarea testului - manifestari hemoragice severe: echimoze intinse, hematurii, epistaxis, gingivoragii, hemoragii digestive, hematoame profunde, hemartroze, menoragii, metroragii; prelungirea timpului Quick fara o motivatie  terapeutica sau clinica⁶. 

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate)⁴.

Specimen recoltat - sange venos⁴.

Recipient de recoltare – vacutainer cu citrat de Na 0.105M (raport citrat de sodiu – sange=1/9). Presiunea realizata de garou trebuie sa fie intre valoarea presiunii sistolice si cea a presiunii diastolice si nu trebuie sa depaseasca 1 minut. Daca punctia venoasa a esuat, o noua tentativa pe aceeasi vena nu se poate face decat dupa 10 minute⁴.

Cantitate recoltata - cat permite vacuumul; pentru a preveni coagularea partiala a probei se va asigura amestecul corect al sangelui cu anticoagulantul, prin miscari de inversiune a tubului⁴.

Prelucrare necesara dupa recoltare - proba va fi centrifugata 15 minute la 2500g, urmata imediat de separarea plasmei si congelarea acesteia; probele recoltate in afara laboratorului vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate³.

Cauze de respingere a probei - vacutainer care nu este plin; proba de singe hemolizata sau coagulata; plasma care nu a ajuns congelata la laborator⁴.

Stabilitate proba - plasma separata este stabila 4 ore la temperatura camerei; 3 saptamani la  - 20ºC; > 1 an la – 70ºC⁴.

Metoda - coagulometrica (consta in masurarea timpului de coagulare a probei de investigat in prezenta tromboplastinei si a unei plasme care contine in exces toti factorii plasmatici ai coagularii cu exceptia factorului II)⁴.

Valori de referinta - 80 – 130%⁴. 

Limite si intreferente

Inhibitorii de trombina (hirudin, argatroban) prezenti in proba de testat  pot duce la o subestimare a nivelului  factorului II.

Testul de activitate identifica ambele tipuri de deficit protrombinic dar nu poate face distinctie intre acestea, fiind necesara o determinare cantitativa imunologica suplimentara (normala in disprotrombinemie si scazuta in hipoprotrombinemie)⁴.

Bibliografie

1. Daniela Badea. Veronica Sfredel. Homeostazia sangelui. Editura Medicala Universitara Craiova Ed. 2003, 217-233.

2. Florica Enache. Maria Stuparu. Diagnosticul de laborator in hemostaza. Editura ALL, 1998, pag.155-167.

3. Jacques Wallach. Interpretarea testelor de diagnostic. Editura Stiintelor Medicale, Romania, 7 ed., 2001, pg.639-641

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog

5. Radu Paun. Tratat de medicina interna . Hematologie. Partea I. Ed.Medicala 1997, 353-404.

6. Radu Paun. Tratat de medicina interna . Hematologie. Partea II. Ed. Medicala 1999, 779-854.

7. Richard A. McPetersen, Matthew R. Pincus. Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 2007, 729-743.