Informatii generale

Anticorpii anti-trombocitari pot fi autoimuni (indreptati impotriva antigenelor trombocitare proprii) sau alloimuni (indreptati impotriva antigenelor trombocitare exogene, de ex. in cazul femeilor gravide sau transfuziilor). Autoanticorpii reactioneaza aproape intotdeauna cu determinanti monomorfi, trombocitele autologe reprezentand cel mai bun material pentru detectarea autoanticorpilor. Alloanticorpii reactioneaza cu determinanti antigenici polimorfi localizati pe suprafata trombocitelor; acestia nu reactioneaza cu trombocitele autologe.

Anticorpii antitrombocitari pot fi indreptati fata de un numar de tinte antigenice aflate pe membrana plasmatica trombocitara, acestea putand fi antigene HLA clasa I sau antigene apartinand glicoproteinelor trombocitare specifice: GPIIb/IIIa, GPIb/IX si GPIa/IIa.³ Complexul glicoproteic IIb/IIIa  detine un rol important in adezivitatea trombocitara, legand fibrinogenul, fibronectina, vitronectina si factorul von Willebrand. Glicoproteina Ib/IX este principalul receptor pentru factorul von Willebrand, iar glicoproteina Ia/IIa este implicata in adeziunea colagenului².

Localizarea moleculara a alloantigenelor trombocitare²

Cele mai frecvente sunt antigenele HPA-1a/b pana la HPA-5a/b, celelalte fiind prezente foarte rar in populatie.

Conditii clinice asociate cu prezenta anticorpilor anti-trombocitari

1 – Purpura trombocitopenica autoimuna (PTI) acuta si cronica – este o conditie caracterizata prin productia de autoanticorpi care distrug trombocitele proprii. Majoritatea anticorpilor recunosc glicoproteine membranare plachetare, in special GPIIb/IIIa, GPIb/IX si GPIa/IIa. Anticorpii care recunosc aceste tinte pot fi detectati cu o frecventa redusa si in plasma/serul pacientilor cu PTI, dar la acesti pacienti diagnosticul de certitudine consta in detectarea autoanticorpilor legati de trombocitele proprii, respectiv in depistarea anticorpilor intr-un eluat preparat din trombocitele autologe, testul avand o sensibilitate de 53% si o specificitate de 72% pentru diagnosticul de PTI, conform unui studiu recent³. Totusi testul nu poate fi efectuat cand trombocitopenia este severa (<10000/µL), autoanticorpii liberi putand fi detectati in aceste cazuri.

Un numar mic de pacienti pot prezenta autoanticorpi fata de determinantii functionali localizati mai ales pe GP IIb/IIIa, ceea ce se traduce prin afectare functionala importanta in prezenta unui numar normal de trombocite, iar la unii din acesti pacienti s-a observat tranzitia spre PTI clasic.

a)PTI acuta: trombocitopenia, adesea severa (<10000 trombocite/microlitru), debuteaza acut, la 10-14 zile dupa o infectie virala; este complet reversibila, afectand cel mai frecvent copii cu varsta sub 10 ani. Clinic se prezinta cel mai adesea cu petesii sau cu sangerari posttraumatice, hemoragia cerebrala este rar intalnita. PTI acuta poate apare ocazional si dupa vaccinare cu o incidenta de 1:25000 de copii/an. 

b)PTI cronic: cu debut la orice varsta; poate fi idiopatica sau secundara unor afectiuni cum ar fi bolile autoimmune (SLE) sau bolile maligne hematologice (leucemia limfatica cronica); sunt afectate mai frecvent femeile; se caracterizeaza prin trombocitopenie severa care rareori se remite spontan.

2 – Trombocitopenia alloimuna neonatala (NAIT): este echivalentul pentru trombocite a bolii hemolitice a nou-nascutului (HDN), fiind cea mai frecventa cauza de trombocitopenie severa la nou-nascutii la termen ce nu se asociaza cu sepsis, infectii sau boli hematologice maligne. Prevalenta este de 1:1000 – 1:2000 din totalul nou-nascutilor². Spre deosebire de HDN, NAIT afecteaza in mod egal atat primul nascut cat si nou-nascutii din sarcinile ulterioare¹. Similar incompatibilitatii prin Rh, trombocitele materne sunt lipsite de un anumit determinant antigenic (2–3 % din femeile gravide sunt HPA-1a negative), care insa este prezent la fat, fiind mostenit de la tata. Antigenele sunt prezente pe trombocite din saptamana 16 de gestatie⁵. NAIT este rezultatul alloimunizarii materne fata de antigenele trombocitare fetale². Ca urmare alloanticorpii materni (mai ales de tip IgG) traverseaza placenta determinand trombocitopenie si manifestari hemoragice la fat/nou-nascut in primele ore de viata, ce pot merge pana la hemoragie intracraniana (in 10-25% din cazuri). In 85-90% din cazuri alloimunizarea materna se face impotriva antigenului trombocitar HPA-1a (deteminant antigenic situat pe GP IIb/IIIa), mamele fiind homozigote pentru alela alternativa HPA-1b, urmat cu o fecventa mult mai mica de anti-HPA-5b (situat pe GP Ia/IIa) si de alloanticorpi fata de determinanti antigenici de pe GP Ib/IX^1,2. In serul femeilor gravide au fost gasiti si anticorpi anti-HLA, dar se pare ca acestia nu sunt semnificativi pentru NAIT².

Trombocitopenia dispare spontan in cateva saptamani, nu mai mult de 3 luni⁵. Numarul de trombocite materne se incadreaza in limite normale.

3 – Trombocitopenia nou-nascutului datorata autoanticorpilor materni se caracterizeaza prin prezenta trombocitopeniei atat la mama cat si la nou-nascut, mama prezentand PTI cronic.

4 – Purpura posttransfuzionala (PTP) – reactie transfuzionala extrem de rara, ce apare aproape exclusiv la  femei de varsta medie sau varstnice, la aproximativ o saptamana de la transfuzia de sange. Trombocitopenia poate fi severa, dar reversibila. Din motive care nu sunt clar intelese trombocitele proprii sunt distruse o data cu trombocitele transfuzate. Sensibilizarea antigenica s-a produs probabil prin expunerea la antigene plachetare exogene prin sarcini sau transfuzii anterioare³. Se caracterizeaza prin detectarea in titru mare de alloanticorpi anti-GP IIb/IIIa si prin prezenta alloanticorpilor in eluatul obtinut din trombocitele autologe.

5 – Trombocitopenie refractara la transfuzia de trombocite – se caracterizeaza prin reactie febrila posttransfuzionala si de cresterea  inadecvata (sub nivelul asteptat) a numarului de trombocite. Aceasta conditie este mai frecventa la pacienti tratati pentru boli hematopoietice maligne. In afara productiei de anticorpi anti-trombocitari, alte cauze posibile includ sepsisul, CID sau trombocitopenie indusa de medicamente. Trombocitopenia refractara mediata imun este mai frecvent cauzata de anticorpi fata de antigenele HLA³.  La acesti pacienti detectarea anticorpilor liberi in ser este utila pentru administrarea de concentrate trombocitare compatibile.

6 – Trombocitopenie indusa de medicamente – tip rar de trombocitopenie severa ce se asociaza cu doua tipuri de anticorpi: anticorpi dependenti de medicament si autoanticorpi. Anticorpii dependenti de medicament reactioneaza, ca si autoanticorpii, cu epitopi ai glicoproteinelor, in special GP IIb/IIIa sau GP Ib/IX, situati pe trombocitele autologe sau pe trombocitele provenite de la persoane sanatoase, dar numai atat timp cat este prezent medicamentul incriminat. In unele cazuri in serul pacientilor cu trombocitopenie imuna indusa medicamentos au fost detectati autoanticorpi a caror reactie cu trombocitele nu depinde de prezenta medicamentului (ex. in cazul preparatelor cu aur).

Medicamentele care se pot asocia cel mai frecvent cu trombocitopenie prin anticorpi dependenti de medicamente sunt urmatoarele: quinidina, trimethoprim-sulfamethoxazol (anticorpi specifici fata de metabolitii medicamentului), quinina, diclofenac, carbamazepina, rifampicina, ibuprofen, nomifensin, ranitidina, paracetamol, vancomicina.

7 – Trombocitopenia indusa de heparina – trombocitopenie asociata cu complicatii tromboembolice, ce apar in cursul tratamentului cu heparina. Prevalenta este de 0.5–2% din totalul pacientilor la care se administreza heparina nefractionata cu o durata mai mare de 5 zile. Se caracterizeaza prin prezenta de anticorpi ce reactioneaza cu epitopi ai complexului heparina–factor 4 plachetar (PF4)².

Recomandari pentru efectuarea anticorpilor anti-trombocitari

-Trombocitopenii care nu pot fi explicate prin afectarea trombocitopoiezei sau prin prezenta splenomegaliei.

-Diverse situatii clinice ce pot sugera prezenta trombocitopeniei indusa de anticorpi.

-Pacienti trombocitopenici ce necesita transfuzii cu concentrate trombocitare².

 Anticorpi anti-trombocitari liberi

Testul detecteaza anticorpii anti-HLA clasa I ca si anticorpii specifici anti-trombocitari fata de complexele GP IIb/IIIa (HPA-1a,1b,3a,3b,4a), GP Ib/IX (HPA-2a,2b), GP Ia/IIa (HPA-5a,5b) si GP IV⁴.

Indicatii : detectia prezentei de alloanticorpi in trombocitopenia alloimuna neonatala (NAIT) – testul trebuie efectuat atat la mama cat si la copil³; trombocitopeniile posttransfuzionale.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) ⁴.

Specimen recoltat - sange venos⁴.

Recipient de recoltare – vacutainer fara anticoagulant cu/sau fara gel separator⁴.

Cantitate necesara - cat permite vacuumul⁴.

Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare, se lucreaza cat mai repede posibil sau se refrigereaza ( 2-8ºC) nu mai mult de 5 zile sau se congeleaza la –20ºC. A se evita congelarea-decongelarea repetata⁴.

Stabilitate proba – serul separat este stabil 5 zile  la 2-8ºC, 2-3 ani la -20ºC⁴.

Cauze de respingere a probei – specimen contaminat bacterian, hemolizat, lipemic, icteric, nerespectarea conditiilor de stocare⁴.

Metoda – ELISA⁴.

Valori de referinta

Anti-HLA clasa I – negativ

Anti-HPA-1a, 3a, 4a – negativ

Anti-HPA-1b, 3b, 4a – negativ

Anti-HPA-5a – negativ

Anti-HPA-5b – negativ

Anti-GP-IV – negativ

Anti-HPA-2a, 2b – negativ⁴.

Limite si interferente

Prezenta in ser a complexelor imune sau a altor agregate de imunoglobuline pot duce la rezultate fals pozitive.

Anticorpii cu aviditate scazuta sau prezenti in titru scazut pot da rezultate fals negative.

Este posibil ca alloanticorpii cu specificitate pentru celelalte antigene trombocitare aflate pe GP IIb/IIIa (HPA-4b, HPA-6a, HPA-6b, HPA-7a, HPA-7b, HPA-8a, HPA-8b) sa fie reactivi cu acest test.

Anticorpii fata de antigenele HLA clasa I cu incidenta scazuta pot sa nu fie detectati⁴.

 Anticorpi anti-trombocitari legati

Testul detecteaza anticorpii anti-trombocitari (anti-GP IIb/IIIa GP Ib/IX, GPIa/IIa) intr-un eluat preparat din trombocitele pacientului (autologe) ⁴.

Indicatii - detectarea autoanticorpilor din purpura trombocitopenica autoimuna (PTI) ⁴.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) ⁴.

Specimen recoltat - sange venos⁴.

Recipient de recoltare – vacutainer cu EDTA⁴.

Cantitate necesara – pentru prepararea eluatului de trombocite este necesar un numar minim de trombocite de 10000/µL (de preferat 50000/µL), o cantitate suficienta de sange fiind obtinuta prin recoltarea a ~16 mL de sange⁴.

Stabilitate proba - 72 ore la 18-22°C (proba nu va refrigerata) ³. 

Cauze de respingere a probei – specimen contaminat bacterian, hemolizat, lipemic, icteric, nerespectarea conditiilor de stocare⁴.

Metoda – ELISA⁴.

Valori de referinta – Anticorpi antitrombocitari negativ.⁴

Limite si interferente  

In timp ce un rezultat pozitiv este util pentru sustinerea diagnosticului de PTI (valoare predictiva pozitiva 90%), rezultatele negative nu exclud neaparat aceasta conditie (valoare predictiva negativa 24%)³.

In cazul in care exista suspiciunea clinica de PTI, iar anticorpii anti-trombocitari legati sunt negativi, se recomanda determinarea prezentei de anticorpi anti-trombocitari liberi in serul pacientului⁴.

Bibliografie

1. Davoren A. Neonatal alloimune thrombocytopenia in the Irish population; a discrepancy between observed and expected cases. In Journal of Clinical Patholog, PubMed articles, April 2002.

2. Kiefel V. Platelet antibodies. In Lothar Thomas Clinical Laboratory Diagnostics, 1998, 854 – 858.

3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Platelet Autoantibody Panel, Whole Blood. Platelet Antibody Profile, Serum. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

5. Margotto Paulo R. Trombocitopenia neonatal in Assistencia ao Recem-Nasciado de Risco, ed.2, 2004.

Anticorpii anti-trombocitari pot fi autoimuni (indreptati impotriva antigenelor trombocitare proprii) sau alloimuni (indreptati impotriva antigenelor trombocitare exogene, de ex. in cazul femeilor gravide sau transfuziilor). Autoanticorpii reactioneaza aproape intotdeauna cu determinanti monomorfi, trombocitele autologe reprezentand cel mai bun material pentru detectarea autoanticorpilor. Alloanticorpii reactioneaza cu determinanti antigenici polimorfi localizati pe suprafata trombocitelor; acestia nu reactioneaza cu trombocitele autologe.

Anticorpii antitrombocitari pot fi indreptati fata de un numar de tinte antigenice aflate pe membrana plasmatica trombocitara, acestea putand fi antigene HLA clasa I sau antigene apartinand glicoproteinelor trombocitare specifice: GPIIb/IIIa, GPIb/IX si GPIa/IIa.³ Complexul glicoproteic IIb/IIIa  detine un rol important in adezivitatea trombocitara, legand fibrinogenul, fibronectina, vitronectina si factorul von Willebrand. Glicoproteina Ib/IX este principalul receptor pentru factorul von Willebrand, iar glicoproteina Ia/IIa este implicata in adeziunea colagenului².

Localizarea moleculara a alloantigenelor trombocitare²

Cele mai frecvente sunt antigenele HPA-1a/b pana la HPA-5a/b, celelalte fiind prezente foarte rar in populatie.

Conditii clinice asociate cu prezenta anticorpilor anti-trombocitari

1 – Purpura trombocitopenica autoimuna (PTI) acuta si cronica – este o conditie caracterizata prin productia de autoanticorpi care distrug trombocitele proprii. Majoritatea anticorpilor recunosc glicoproteine membranare plachetare, in special GPIIb/IIIa, GPIb/IX si GPIa/IIa. Anticorpii care recunosc aceste tinte pot fi detectati cu o frecventa redusa si in plasma/serul pacientilor cu PTI, dar la acesti pacienti diagnosticul de certitudine consta in detectarea autoanticorpilor legati de trombocitele proprii, respectiv in depistarea anticorpilor intr-un eluat preparat din trombocitele autologe, testul avand o sensibilitate de 53% si o specificitate de 72% pentru diagnosticul de PTI, conform unui studiu recent³. Totusi testul nu poate fi efectuat cand trombocitopenia este severa (<10000/µL), autoanticorpii liberi putand fi detectati in aceste cazuri.

Un numar mic de pacienti pot prezenta autoanticorpi fata de determinantii functionali localizati mai ales pe GP IIb/IIIa, ceea ce se traduce prin afectare functionala importanta in prezenta unui numar normal de trombocite, iar la unii din acesti pacienti s-a observat tranzitia spre PTI clasic.

a)PTI acuta: trombocitopenia, adesea severa (<10000 trombocite/microlitru), debuteaza acut, la 10-14 zile dupa o infectie virala; este complet reversibila, afectand cel mai frecvent copii cu varsta sub 10 ani. Clinic se prezinta cel mai adesea cu petesii sau cu sangerari posttraumatice, hemoragia cerebrala este rar intalnita. PTI acuta poate apare ocazional si dupa vaccinare cu o incidenta de 1:25000 de copii/an. 

b)PTI cronic: cu debut la orice varsta; poate fi idiopatica sau secundara unor afectiuni cum ar fi bolile autoimmune (SLE) sau bolile maligne hematologice (leucemia limfatica cronica); sunt afectate mai frecvent femeile; se caracterizeaza prin trombocitopenie severa care rareori se remite spontan.

2 – Trombocitopenia alloimuna neonatala (NAIT): este echivalentul pentru trombocite a bolii hemolitice a nou-nascutului (HDN), fiind cea mai frecventa cauza de trombocitopenie severa la nou-nascutii la termen ce nu se asociaza cu sepsis, infectii sau boli hematologice maligne. Prevalenta este de 1:1000 – 1:2000 din totalul nou-nascutilor². Spre deosebire de HDN, NAIT afecteaza in mod egal atat primul nascut cat si nou-nascutii din sarcinile ulterioare¹. Similar incompatibilitatii prin Rh, trombocitele materne sunt lipsite de un anumit determinant antigenic (2–3 % din femeile gravide sunt HPA-1a negative), care insa este prezent la fat, fiind mostenit de la tata. Antigenele sunt prezente pe trombocite din saptamana 16 de gestatie⁵. NAIT este rezultatul alloimunizarii materne fata de antigenele trombocitare fetale². Ca urmare alloanticorpii materni (mai ales de tip IgG) traverseaza placenta determinand trombocitopenie si manifestari hemoragice la fat/nou-nascut in primele ore de viata, ce pot merge pana la hemoragie intracraniana (in 10-25% din cazuri). In 85-90% din cazuri alloimunizarea materna se face impotriva antigenului trombocitar HPA-1a (deteminant antigenic situat pe GP IIb/IIIa), mamele fiind homozigote pentru alela alternativa HPA-1b, urmat cu o fecventa mult mai mica de anti-HPA-5b (situat pe GP Ia/IIa) si de alloanticorpi fata de determinanti antigenici de pe GP Ib/IX^1,2. In serul femeilor gravide au fost gasiti si anticorpi anti-HLA, dar se pare ca acestia nu sunt semnificativi pentru NAIT².

Trombocitopenia dispare spontan in cateva saptamani, nu mai mult de 3 luni⁵. Numarul de trombocite materne se incadreaza in limite normale.

3 – Trombocitopenia nou-nascutului datorata autoanticorpilor materni se caracterizeaza prin prezenta trombocitopeniei atat la mama cat si la nou-nascut, mama prezentand PTI cronic.

4 – Purpura posttransfuzionala (PTP) – reactie transfuzionala extrem de rara, ce apare aproape exclusiv la  femei de varsta medie sau varstnice, la aproximativ o saptamana de la transfuzia de sange. Trombocitopenia poate fi severa, dar reversibila. Din motive care nu sunt clar intelese trombocitele proprii sunt distruse o data cu trombocitele transfuzate. Sensibilizarea antigenica s-a produs probabil prin expunerea la antigene plachetare exogene prin sarcini sau transfuzii anterioare³. Se caracterizeaza prin detectarea in titru mare de alloanticorpi anti-GP IIb/IIIa si prin prezenta alloanticorpilor in eluatul obtinut din trombocitele autologe.

5 – Trombocitopenie refractara la transfuzia de trombocite – se caracterizeaza prin reactie febrila posttransfuzionala si de cresterea  inadecvata (sub nivelul asteptat) a numarului de trombocite. Aceasta conditie este mai frecventa la pacienti tratati pentru boli hematopoietice maligne. In afara productiei de anticorpi anti-trombocitari, alte cauze posibile includ sepsisul, CID sau trombocitopenie indusa de medicamente. Trombocitopenia refractara mediata imun este mai frecvent cauzata de anticorpi fata de antigenele HLA³.  La acesti pacienti detectarea anticorpilor liberi in ser este utila pentru administrarea de concentrate trombocitare compatibile.

6 – Trombocitopenie indusa de medicamente – tip rar de trombocitopenie severa ce se asociaza cu doua tipuri de anticorpi: anticorpi dependenti de medicament si autoanticorpi. Anticorpii dependenti de medicament reactioneaza, ca si autoanticorpii, cu epitopi ai glicoproteinelor, in special GP IIb/IIIa sau GP Ib/IX, situati pe trombocitele autologe sau pe trombocitele provenite de la persoane sanatoase, dar numai atat timp cat este prezent medicamentul incriminat. In unele cazuri in serul pacientilor cu trombocitopenie imuna indusa medicamentos au fost detectati autoanticorpi a caror reactie cu trombocitele nu depinde de prezenta medicamentului (ex. in cazul preparatelor cu aur).

Medicamentele care se pot asocia cel mai frecvent cu trombocitopenie prin anticorpi dependenti de medicamente sunt urmatoarele: quinidina, trimethoprim-sulfamethoxazol (anticorpi specifici fata de metabolitii medicamentului), quinina, diclofenac, carbamazepina, rifampicina, ibuprofen, nomifensin, ranitidina, paracetamol, vancomicina.

7 – Trombocitopenia indusa de heparina – trombocitopenie asociata cu complicatii tromboembolice, ce apar in cursul tratamentului cu heparina. Prevalenta este de 0.5–2% din totalul pacientilor la care se administreza heparina nefractionata cu o durata mai mare de 5 zile. Se caracterizeaza prin prezenta de anticorpi ce reactioneaza cu epitopi ai complexului heparina–factor 4 plachetar (PF4)².

Recomandari pentru efectuarea anticorpilor anti-trombocitari

-Trombocitopenii care nu pot fi explicate prin afectarea trombocitopoiezei sau prin prezenta splenomegaliei.

-Diverse situatii clinice ce pot sugera prezenta trombocitopeniei indusa de anticorpi.

-Pacienti trombocitopenici ce necesita transfuzii cu concentrate trombocitare².

Anticorpi anti-trombocitari liberi

Testul detecteaza anticorpii anti-HLA clasa I ca si anticorpii specifici anti-trombocitari fata de complexele GP IIb/IIIa (HPA-1a,1b,3a,3b,4a), GP Ib/IX (HPA-2a,2b), GP Ia/IIa (HPA-5a,5b) si GP IV⁴.

Indicatii : detectia prezentei de alloanticorpi in trombocitopenia alloimuna neonatala (NAIT) – testul trebuie efectuat atat la mama cat si la copil³; trombocitopeniile posttransfuzionale.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) ⁴.

Specimen recoltat - sange venos⁴.

Recipient de recoltare – vacutainer fara anticoagulant cu/sau fara gel separator⁴.

Cantitate necesara - cat permite vacuumul⁴.

Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare, se lucreaza cat mai repede posibil sau se refrigereaza ( 2-8ºC) nu mai mult de 5 zile sau se congeleaza la –20ºC. A se evita congelarea-decongelarea repetata⁴.

Stabilitate proba – serul separat este stabil 5 zile  la 2-8ºC, 2-3 ani la -20ºC⁴.

Cauze de respingere a probei – specimen contaminat bacterian, hemolizat, lipemic, icteric, nerespectarea conditiilor de stocare⁴.

Metoda – ELISA⁴.

Valori de referinta

Anti-HLA clasa I – negativ

Anti-HPA-1a, 3a, 4a – negativ

Anti-HPA-1b, 3b, 4a – negativ

Anti-HPA-5a – negativ

Anti-HPA-5b – negativ

Anti-GP-IV – negativ

Anti-HPA-2a, 2b – negativ⁴.

Limite si interferente

Prezenta in ser a complexelor imune sau a altor agregate de imunoglobuline pot duce la rezultate fals pozitive.

Anticorpii cu aviditate scazuta sau prezenti in titru scazut pot da rezultate fals negative.

Este posibil ca alloanticorpii cu specificitate pentru celelalte antigene trombocitare aflate pe GP IIb/IIIa (HPA-4b, HPA-6a, HPA-6b, HPA-7a, HPA-7b, HPA-8a, HPA-8b) sa fie reactivi cu acest test.

Anticorpii fata de antigenele HLA clasa I cu incidenta scazuta pot sa nu fie detectati⁴.

Anticorpi anti-trombocitari legati

Testul detecteaza anticorpii anti-trombocitari (anti-GP IIb/IIIa GP Ib/IX, GPIa/IIa) intr-un eluat preparat din trombocitele pacientului (autologe) ⁴.

Indicatii - detectarea autoanticorpilor din purpura trombocitopenica autoimuna (PTI) ⁴.

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) ⁴.

Specimen recoltat - sange venos⁴.

Recipient de recoltare – vacutainer cu EDTA⁴.

Cantitate necesara – pentru prepararea eluatului de trombocite este necesar un numar minim de trombocite de 10000/µL (de preferat 50000/µL), o cantitate suficienta de sange fiind obtinuta prin recoltarea a ~16 mL de sange⁴.

Stabilitate proba - 72 ore la 18-22°C (proba nu va refrigerata) ³. 

Cauze de respingere a probei – specimen contaminat bacterian, hemolizat, lipemic, icteric, nerespectarea conditiilor de stocare⁴.

Metoda – ELISA⁴.

Valori de referinta – Anticorpi antitrombocitari negativ.⁴

Limite si interferente  

In timp ce un rezultat pozitiv este util pentru sustinerea diagnosticului de PTI (valoare predictiva pozitiva 90%), rezultatele negative nu exclud neaparat aceasta conditie (valoare predictiva negativa 24%)³.

In cazul in care exista suspiciunea clinica de PTI, iar anticorpii anti-trombocitari legati sunt negativi, se recomanda determinarea prezentei de anticorpi anti-trombocitari liberi in serul pacientului⁴.

Bibliografie

1. Davoren A. Neonatal alloimune thrombocytopenia in the Irish population; a discrepancy between observed and expected cases. In Journal of Clinical Patholog, PubMed articles, April 2002.

2. Kiefel V. Platelet antibodies. In Lothar Thomas Clinical Laboratory Diagnostics, 1998, 854 – 858.

3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Platelet Autoantibody Panel, Whole Blood. Platelet Antibody Profile, Serum. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

5. Margotto Paulo R. Trombocitopenia neonatal in Assistencia ao Recem-Nasciado de Risco, ed.2, 2004.

Informatii generale

Demonstrarea prezentei de imunoglobuline sau a complementului pe suprafata hematiilor sustine diagnosticul de distructie eritrocitara mediata imun⁶.

Exista doua clase majore de anticorpi care reactioneaza cu eritrocitele. Anticorpii completi sau salini aglutineaza eritrocitele suspendate in solutie salina; acestia sunt de obicei de tip IgM (cel mai bun exemplu de aglutinare salina la temperatura camerei este cea utilizata in grupajul ABO). In vivo anticorpii IgM fixeaza complementul si produc hemoliza imediata intravasculara. Anticorpii care nu reactioneaza vizibil in mediu salin si produc reactii de aglutinare numai prin utilizarea de tehnici speciale sunt numiti aglutinine incomplete si sunt de obicei de tip IgG (cel mai bun exemplu sunt anticorpii anti-Rh, care, daca sunt prezenti in serul primitorului de sange incompatibil, produc o reactie hemolitica transfuzionala intarziata, extravasculara)³.

Pentru a certifica faptul ca hematiile unui pacient sunt invelite (sensibilizate) cu imunoglobuline, complement sau ambele, se adauga la o suspensie de eritrocite provenite de la pacient antiser cu reactivitate fata de moleculele de Ig si/sau complement umane, care va determina aglutinarea acestora. Initial testarea se face su antiseruri polispecifice, care contin anti-IgG, anti-C3d si ocazional si activitate anti-lant usor. Reactivii monospecifici diferentiaza in continuare intre IgG, C3d, existand si seruri monospecifice pentru C3b, C4b, C4d si lantul greu al IgG. Antiseruri specifice pentru IgM sau IgA sunt rar utilizate, deoarece IgM nu mai sunt gasite de obicei inca atasate pe suprafata celulara, iar IgA sunt foarte rar intalnite pe suprafata eritrocitelor⁶.

Utilizand sange recoltat pe EDTA sau pe citrat activarea in vitro a complementului de catre autoanticorpii la rece benigni este inhibata. Spalarea eritrocitelor indeparteaza globulinele solubile sau atasate nespecific, ceea ce permite detectia imunoglobulinelor si factorilor complementului specific legate de eritrocite in vivo⁴.

Recomandari pentru efectuarea testului Coombs direct

• investigarea reactiilor transfuzionale acute sau intarziate (demonstrarea fixarii pe suprafata eritrocitelor de la donator a aloanticorpilor prezenti in serul pacientului);

•  suspiciune de hemoliza autoimuna;

•  boala hemolitica a nou-nascutului;

•  hemoliza imuna indusa de medicamente;

• atunci cand martorul auto efectuat in cadrul grupajului sanguin, screening-ului prezentei de aloanticorpi si testelor de compatibilitate este pozitiv⁴.

Pregatire pacient  - nu este necesara o pregatire prealabila⁵.

Specimen recoltat - sange venos⁵.

Recipient de recoltare – vacutainer cu K3-EDTA⁵.

Cantitate recoltata - cat permite vacuumul⁵.

Cauze  de respingere a probei - specimen coagulat⁵.

Stabilitate proba - testul se efectueaza imediat, daca acest lucru nu este posibil, proba se pastreaza 48 ore la 2-8°C⁵.

Prelucrare necesara dupa recoltare - o parte din eritrocite se spala de trei-patru ori cu solutie salina normala, urmata de prepararea unei suspensii eritrocitare in ser fiziologic steril 5%^1;5.  

Metoda de determinare – hemaglutinare pe lama⁵.

NOTA: in laboratoarele Synevo se efectueaza testul Coombs cu antiglobulina umana polispecifica.

Valori de referinta – negativ.

Interpretarea rezultatelor

Test Coombs direct pozitiv se asociaza cu urmatoarele entitati^2;3;4;6:

Limite si interferente^4;6

• spalarea inadecvata a celulelor si concentratia mare de imunoglobuline in serul pacientului influenteaza testul.

In cazul obtinerii unui rezultat pozitiv trebuie luate in considerare urmatoarele posibilitati:

•  profilaxie antepartum la mama cu imunoglobuline anti-D;

•  prezenta de autoanticorpi la cald benigni, fara actiune hemolitica;

• modificari ale membranei eritrocitare induse de medicamente (ex.: cefalosporine) cu adsorbtia nespecifica de proteine;

•  adsorbtia nespecifica de globuline asociata cu hipergamaglobulinemia sau paraproteinemia;

• activarea in vitro a complementului de catre autoanticorpi la rece benigni (ca de exemplu in  sangele coagulat dupa racire);

•  poliaglutinare, daca sunt expuse criptoantigene (T), iar reactivul este contaminat cu anti-T.

Bibliografie

1. Curs de imuno-hematologie, Institutul de Hematologie, Buc., 1993.

2. Eder, A. Manno, C. Alloimmune Hemolytic Disease of the Fetus and Newborne. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, 11th Ed., 2003, 1183-1200.

3. Galel, S. Malone III, J. Viele, M. Transfusion Medicine. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, 11th Ed., 2003, 832-873.

4. Kretschmer, V. Sonneborn, H. Immunohematology. In Lothar Thomas. Clinical Laboratory Diagnostics –Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998, 877-934.

5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

6. Neff, A. Autoimmune hemolytic Anemias. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, 11th Ed., 2003, 1158-1177.

La om au fost identificate 26 sisteme de grup sanguin cu 228 antigene; un sistem de grup sanguin consta din unul sau mai multe antigene guvernate de o singura gena sau de un complex de doua sau mai multe gene strans legate intre ele. De asemenea au fost identificate si alte antigene care nu au fost atribuite sistemelor stabilite. Antigenele eritrocitare pot fi proteine, glicoproteine sau glicolipide. Majoritatea sunt sintetizate de eritrocit, totusi unele antigene, cum ar fi cele apartinand sistemului Lewis, sunt adsorbite din plasma pe membrana eritrocitara. Unele antigene sunt specifice eritrocitelor, in timp ce altele sunt intalnite si pe alte celule din organism. Cunoasterea grupelor sanguine este esentiala pentru terapia transfuzionala. Astfel indivizii care nu prezinta anumite antigene eritrocitare pot produce aloanticorpi atunci cand sunt expusi la sange care contine aceste antigene in transfuziile cu produse de sange sau in timpul sarcinii. Anticorpii care interactioneaza cu antigenele eritrocitare produc reactii transfuzionale hemolitice imediate sau intarziate si boala hemolitica a nou-nascutului⁴.

Sistemul de grup sanguin ABO reprezinta cel mai important sistem de grup sanguin deoarece: cand antigenele nu sunt exprimate pe suprafata eritrocitelor, anticorpii corespunzatori sunt intotdeauna prezenti in plasma, stimulii pentru productia de anticorpi fiind reprezentati de o varietate de factori de mediu, cum ar fi bacteriile (ex.: E. coli), care exprima pe suprafata structuri aproape identice carbohidratilor ABO; anticorpii formati reprezinta un amestec de IgM (predominant) si IgG, activi la 37ºC si capabili sa activeze complementul, iar densitatea mare de situsuri antigenice de pe membrana eritrocitara permite legarea unui numar mare de anticorpi ducand, in cazul transfuzarii de sange incompatibil in sistemul ABO, la reactii transfuzionale hemolitice acute^2;4.

Exista trei gene alele in sistemul ABO (A, B si O) cu transmitere mendeliana; A si B sunt alele codominante, iar O este o alela recesiva. Aceste trei gene determina patru fenotipuri: A, B, AB si O, indivizii cu fenotip A sau B putand fi heterozigoti (AO, respectiv BO) sau homozigoti (AA, respectiv BB). Antigenele sistemului ABO sunt localizate pe lanturi oligozaharidice care fac parte din glicosfingolipide. Genele sistemului ABO nu codifica direct antigenele, ci enzime care adauga zaharuri specifice la un substrat din membrana eritrocitara (substanta H): N-acetil-galactozamina pentru gena A si galactoza pentru gena B; alela O codifica o transferaza nonfunctionala, astfel ca nici un zahar specific nu este atasat membranei eritrocitare. Gena H codifica o fucozil-transferaza care adauga grupari de L-fucoza la galactoza terminala a lanturilor oligozaharidice, rezultand substanta H. O alela rara mostenita uneori in locusul H este h, care codifica o transferaza nonfunctionala. La homozigotii hh (fenotipul Bombay) substanta H nu este prezenta pe suprafata eritrocitelor, iar transferazele A si B, chiar daca sunt prezente, nu pot adauga zaharurile specifice care determina specificitatea antigenica A sau B. Relevanta clinica a fenotipului Bombay este capacitatea acestor indivizi de a forma nu numai anti-A si anti-B, dar si anti-H, ceea ce face dificila gasirea de sange compatibil pentru transfuzii, numai sangele de la un individ cu fenotip Bombay fiind compatibil, iar acesta este extrem de rar. Mutatii ale genelor A si B rezulta in substitutii de aminoacizi la nivelul transferazelor, care se traduc in expresia slaba a antigenelor A si B, clasificate ca subgrupe, cele mai comune fiind asociate cu gena A, A₁ si A₂. Subgrupele A si B sunt relevante clinic la donatorii de sange, deoarece, datorita expresiei slabe a antigenului, pot fi fenotipate ca apartinand grupului O si, transfuzate la un primitor cu grup O, pot duce la hemoliza intravasculara^2;4.

Toti indivizii imunocompetenti produc anticorpi naturali (izoaglutinine sau izohemolizine) fata de antigenele de grup ABO(H) lipsa. Anti-A si anti-B sunt de obicei detectabili la 3-6 luni dupa nastere, iar la varsta de 5 ani titrul anticorpilor atinge maximul si se mentine in toata perioada adulta. Titrul anticorpilor IgM poate scadea gradual cu varsta avansata. Anticorpii anti-A si anti-B sunt prezenti si la cei cu variante A sau B slabe. Nou-nascutii nu au de obicei o cantitate semnificativa de anti-A si anti-B in plasma, cu exceptia celor nascuti din mame aloimunizate, la care pot fi prezenti in circulatie anticorpi IgG de la mama care au traversat placenta. Anticorpii ABO nu reprezinta o cauza majora de boala hemolitica a nou-nascutului datorita inhibitiei anticorpilor de substantele A si/sau B solubile prezente in sange precum si antigenelor A sau B prezente pe alte celule in afara eritrocitelor; de asemenea afinitatea de legare a anticorpilor fata de molecule de zaharuri este mai slaba decat cea a anticorpilor fata de molecule proteice, cum ar fi antigenul D⁴. Hemoliza apare mai probabil daca mama este grup O, cu copil grup A².

Recomandari pentru determinarea grupului sanguin ABO²

• inaintea unei transfuzii;

• inaintea unei proceduri invazive sau chirurgicale potential asociate cu complicatii hemoragice care ar putea necesita transfuzii;

• monitorizarea imunohematologica antepartum si postnatala a mamei si copilului;

• la donatorii de sange;

• pentru compatibilitatea de grup ABO in transplantul de rinichi si inima.

Pregatire pacient  – nu este necesara o pregatire prealabila; sunt utile informatii asupra unor tratamente perfuzabile cu solutii macromoleculare efectuate premergator determinarii, transfuzii in ultimele 120 zile, boli infectioase cu germeni Gram negativi cu/fara septicemie, boli maligne (carcinom, limfom, mielom)³.

Specimen recoltat - a) sange capilar din pulpa degetului; b) sange venos³.

Recipient de recoltare – b) vacutainer fara aditivi sau gel activator (capac rosu sau incolor)³.

Cantitate recoltata - b) cat permite vacuumul³.

Cauze  de respingere a probei - specimen puternic hemolizat³.

Stabilitate proba - testul se efectueaza imediat, daca acest lucru nu este posibil, proba se pastreaza 48 ore la 2-8°C³.

Prelucrare necesara dupa recoltare - dupa coagularea completa la temperatura camerei se indeparteaza serul si cheagul. Din hematiile ramase se prepara o suspensie 10% in plasma proprie sau in ser fiziologic^1;3. Pentru metoda de aglutinare pe carduri se prepara o suspensie de 5% hematii in mediu special de suspensie.

Metoda de determinare – in laboratoarele Synevo se efectueaza metoda directa/globulara (Beth-Vincent) de determinare a grupului sanguin ABO utilizand seruri anti-A, anti-B si anti-AB, cu urmatoarele variante: 

- hemaglutinare pe placa³. Se utilizeaza doi martori: martor AB (hematiile pacientului cu ser AB) si martor auto (hematiile si serul propriu)¹.

- aglutinare si gel-filtrare pe carduri cu microtuburi ce contin un gel impregnat cu reactivul specific antigenului eritrocitar de determinat (anticorpi monoclonali murini sau umani) – test direct de grupaj ABO si de determinare a Ag RH1( D) si a Ag RH 1,2,3 ( DCE)³.

Limite si interferente

Rezultatul determinarii grupului de sange trebuie citit de doua persoane si trebuie eventual confirmat pe o a doua proba de sange^1;2.

Pentru metoda de aglutinare pe carduri o reactie pozitiva se valideaza numai daca microtubul de control este negativ. Reactia pozitiva se apreciaza in functie de marimea aglutinatelor de la + la ++++.

Erori de citire datorate greselilor de tehnica:

- sticlarie murdara; contaminare bacteriana;

- prezenta de microcheaguri (falsa aglutinare);

- nu se respecta: proportiile hematii/ser, ordinea de picurare a serurilor hemotest (aglutinari contradictorii), timpul de citire – citire tardiva: margini uscate (falsa aglutinare), citire precoce (lipsa aglutinarii sau aglutinare slaba).

Erori datorate hematiilor

False aglutinari

a) Prezenta rulourilor (pseudoaglutinarea): utilizarea de solutii macromoleculare (Dextran, HES), tulburari de coagulare, probe de sange incomplet coagulate, hiperfibrinogenemia, produsi de degradare a fibrinei, agenti fibrinolitici, disproteinemia, paraproteinemia, crioglobulinemia, cresterea reactantilor de faza acuta, medicamente (doze mari de heparina, sulfat de protamina), factori reumatoizi, cresterea colesterolului, bilirubinei, leucocitoza, enzime leucocitare². Martorul AB este pozitiv; spalarea hematiilor permite efectuarea corecta a probei globulare¹.

b) Autoaglutinarea

• Prezenta de aglutinine la rece (martorul auto este pozitiv). Proba de sange si reactivii se preincubeaza la 37ºC, iar testarea se efectueaza la cald².

• Hematii acoperite de aloanticorpi: nou-nascut din sarcina incompatibila (in sistemul Rh, ABO),

pacient transfuzat cu sange incompatibil.

• Determinarea grupului sanguin pe sange recoltat din cordonul ombilical: gelatina Wharton, substanta macromoleculara care inconjoara eritrocitele, da aspect de pseudoaglutinate. Pentru indepartarea ei este necesara spalarea hematiilor de cel putin 6 ori inaintea determinarii¹.

• Prezenta complexelor imune medicamentoase.

c) Poliaglutinarea

In septicemiile cu bacilli Gram negativi sunt expuse criptoantigene (T), prin actiunea enzimatica a agentilor bacteireni, recunoscute de anticorpi (anti-T) prezenti in majoritatea serurilor umane². Martorul AB este pozitiv¹.

Aglutinari absente sau slabe sau aspect de dubla populatie: aglutinarea nu este totala, cu prezenta de hematii libere (aglutinatele apar pe un fond roz)^1;2:

• sange vechi;

• antigene slabe: nou-nascuti, prematuri;

• subgrupe A sau B slabe;

• atenuarea antigelor (in leucemii, limfoame, boala Hodgkin);

• pacient cu grup A sau B transfuzat cu sange grup O, hemoragie materno-fetala;

• prezenta in cantitate mare de substanta A sau B in plasma (cancer de stomac, pancreas) care neutralizeaza anticorpii test (hematiile trebuie spalate pentru indepartarea acestora);

• prezenta unei chimere sau mozaic (exceptional, ex.: post-alotransplant medular).

Bibliografie

1. Curs de imuno-hematologie, Institutul de Hematologie, Buc., 1993.

2. Kretschmer, V. Sonneborn, H. Immunohematology. In Lothar Thomas. Clinical Laboratory Diagnostics –Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998: 877-934.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

4. Webert, K. Chan, H. Smith, J. Heddle, N. Kelton, J. Red Cell, Platelet and White Cell Antigens. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, 11th Ed., 2003: 792-824.

Antigenele sistemului de grup sanguin Rh sunt codificate de doua gene: RHD si RHCE localizate pe cromozomul 1. RHD codifica antigenul D, in timp ce RHCE codifica antigenele Cc si Ee. Antigenul d nu exista; totusi, prin conventie, d este utilizat pentru a conota absenta antigenului D. RHD si RHCE codifica polipeptide similare, care in membrana eritrocitara formeaza un complex cu glicoproteina asociata Rh. Functia antigenelor Rh nu este cunoscuta, desi pe baza fenotipului celulelor Rh nul este sugerat faptul ca antigenele Rh ar juca un rol structural in membrana eritrocitara. Structura antigenelor Rh sugereaza ca sunt proteine de transport, iar glicoproteina asociata Rh ar putea juca un rol in transportul amoniacului. Exista 45 antigene care au fost atribuite sistemului de grup sanguin Rh, dintre acestea cele mai comune si importante fiind D, C, c, E si e. Desi indivizii pot deveni aloimunizati la antigenele C, c, E si e prin transfuzii si sarcina, acestea sunt mult mai putin imunogenice decat D. Mai putin de 3% din indivizii expusi la antigenele C, c, E, e devin aloimunizati, astfel testarea pretransfuzionala nu se efectueaza de rutina pentru aceste antigene. Dupa antigenele A si B, antigenul D manifesta cea mai inalta imunogenicitate (de 20 ori mai mare decat alte antigene Rh majore); in urma transfuziei de eritrocite D-pozitive aproape 80% din primitorii D-negativi dezvolta anticorpi anti-D. In plus imunizarea anti-D promoveaza in continuare sinteza de anticorpi fata de alte antigene de grup sanguin din sau din afara sistemului Rh⁵. De asemenea antigenul D este implicat in 95% din cazurile de boala hemolitica a nou-nascutului¹.

Un individ este considerat Rh pozitiv daca eritrocitele sale exprima antigenul D, iar termenul Rh negativ se refera la absenta antigenului D. Absenta antigenului D este intalnita al 15-17% din indivizii populatiei albe si este mai putin frecventa in alte populatii. La populatia alba absenta antigenului D se datoreaza deletiei genei RHD, in timp ce la populatia asiatica si neagra se asociaza mai degraba cu inactivarea genei decat cu deletia sa⁵.

Unele eritrocite care exprima antigenul D necesita incubare prelungita cu reactivul anti-D pentru aparitia aglutinarii. Aceste eritrocite sunt considerate antigen D pozitive si sunt descrise ca D slab, anterior denumite D^u (in mai putin de 1% din cazuri). Se considera ca fenotipul D slab apare prin unul din urmatoarele trei mecanisme⁵:

a) mostenirea unei gene RHD care codifica o proteina D cu expesie antigenica slabita: este mai comuna la populatia neagra si se asociaza cu haplotipul Dce, iar la populatia alba se asociaza cu haplotipul DCe sau DcE.

b) interactiunea genei D cu alte gene: indivizii cu gena D in pozitie trans fata de gena C (ex.: Dce/Ce) prezinta o expresie slabita a genei D.

Indivizii cu fenotip D slab prin unul din aceste doua mecanisme nu formeaza aloanticorpi dupa expunerea la eritrocite D pozitive.

c) mostenirea unei gene care codifica un complex antigenic D caruia ii lipsesc unii epitopi, numit si D partial; acesti indivizi pot produce anti-D daca sunt transfuzati cu eritrocite D pozitive. Dintre acestia D^VI prezinta numarul cel mai mic de epitopi si aceste persoane prezinta cel mai mare risc de imunizare, dar semnificativ mai mic decat persoanele D negative³.

Donatorii cu D slab trebuie considerati Rh(D) pozitivi; este important ca acestia sa nu fie gresit etichetati ca Rh negativi, deoarece antigenul D slab poate induce un raspuns imun daca este transfuzat la un individ Rh negativ^1;3;5. Indivizii cu D slab pot fi transfuzati cu sange Rh pozitiv (exceptie D^VI), iar gravidele nu necesita profilaxie cu imunoglobulina anti-D^2;5. Daca se utilizeaza un reactiv monoclonal anti-D adecvat, majoritatea determinantilor antigenici incadrati anterior ca D^u nu trebuie sa mai fie deosebiti de D in conditii de rutina³.

Fenotipul Rh nul apare cand eritrocitele nu exprima antigene Rh, prin cel putin doua mecanisme posibile: mostenirea unei gene care codifica glicoproteina asociata Rh anormale, cu gene RHD si RHCE normale, sau mostenirea unei mutatii a genei RHCE asociata cu D negativ. Fenotipul Rh nul se asociaza cu anomalii structurale eritrocitare cu stomatocitoza si hemoliza. Acesti indivizi formeaza aloanticorpi care interactioneaza cu toate eritrocitele exceptandu-le pe cele Rhnul⁵.

Anticorpii anti-Rh apar prin aloimunizare, in urma transfuziilor incompatibile in sistemul Rh sau in sarcina. Extrem de rar pot aparea anticorpi naturali in sistemul Rh, fara stimuli antigenici cunoscuti (anti-E, anti-C^w), in majoritatea cazurilor irelevanti din punct de vedere clinic^1;3. De asemenea in anemiile hemolitice imune autoanticorpii au adesea activitate anti-Rh¹.

Majoritatea anticorpilor anti-Rh sunt IgG, in special IgG₁ si IgG₃ (aglutinine incomplete), desi unii pot fi IgM, si de obicei nu activeaza complementul⁵. Anticorpii aglutinanti de tip IgM sunt de obicei tranzitorii si apar la inceputul imunizarii¹. Cei mai comuni sunt anticorpii anti-D, care pot provoca boala hemolitica a nou-nascutului si reactii transfuzionale hemolitice severe. Frecventa acestora a scazut semnificativ o data cu profilaxia anti-D la gravidele Rh negativ cu fat Rh pozitiv. Anticorpii anti-C, c, E, e se asociaza cu boala hemolitica a nou-nascutului si reactii hemolitice transfuzionale usoare⁵.

Tiparea Rh a eritrocitelor se face cu seruri anti-D monoclonale care reactioneaza in mediu salin si care contin atat IgM umane (care nu detecteaza categoria D^VI)³, cat si anticorpi policlonali IgG, acestea din urma putand fi utilizate si in testul antiglobulinic pentru D slab². La prepararea serului anti-Rh se adauga albumina umana sau bovina care modifica constanta dielectrica a mediului si favorizeaza aglutinarea eritrocitelor Rh pozitive¹.

Recomandari pentru determinarea factorului Rh

• inaintea unei transfuzii;

• inaintea unei proceduri invazive sau chirurgicale potential asociate cu complicatii hemoragice care ar putea necesita transfuzii;

• monitorizarea imunohematologica antepartum si postnatala a mamei si copilului;

• la donatorii de sange.

In testarea de rutina a grupului sanguin nu se indica determinarea altor antigene Rh in afara factorului Rh D. Determinarea fenotipului Rh complet este indicata la donatorii de sange, trebuie luata in considerare in cazul transfuziilor la fetite si femei premenopauza, la pacienti transfuzati cronic si la primitorii cu anticorpi antieritrocitari iregulari³.

Pregatire pacient  – nu este necesara o pregatire prealabila; sunt utile informatii asupra unor tratamente perfuzabile cu solutii macromoleculare efectuate premergator determinarii, transfuzii in ultimele 120 zile⁴.

Specimen recoltat - a) sange capilar din pulpa degetului; b) sange venos⁴.

Recipient de recoltare – b) vacutainer fara aditivi sau gel activator (capac rosu sau incolor)⁴.

Cantitate recoltata - b) cat permite vacuumul⁴.

Cauze  de respingere a probei - specimen puternic hemolizat⁴.

Stabilitate proba - testul se efectueaza imediat, daca acest lucru nu este posibil, proba se pastreaza 48 ore la 2-8°C⁴.

Prelucrare necesara dupa recoltare - Dupa coagularea completa la temperatura camerei se indeparteaza serul si cheagul. Din hematiile ramase se prepara o suspensie 40% in plasma proprie sau in ser fiziologic. Pentru metoda de aglutinare pe carduri se prepara o suspensie de 5% hematii in mediu special de suspensie^1;4.

Metoda de determinare - hemaglutinare pe placa cu reactiv anti-D IgM monoclonal⁴. Determinarea trebuie efectuata cu doua tipuri diferite de anticorpi monoclonali, iar testarea trebuie sa includa martorul autolog (martor albuminos – se testeaza eritrocitele pacientului cu mediul in care sunt continuti Ac monoclonali), precum si hematii martor de grup O, Rh pozitiv si Rh negativ^1;3.                                      

  – aglutinare si gel-filtrare pe carduri cu microtuburi ce contin un gel impregnat cu reactivul specific antigenului eritrocitar de determinat (anticorpi monoclonali murini sau umani) – test direct de grupaj ABO si de determinare a Ag RH1( D) si a Ag RH 1,2,3 ( DCE)⁴.

Interpretarea rezultatelor 

Primitori de sange si nou-nascuti:

• Rh(D) pozitiv daca se obtin rezultate clar pozitive (>=2+) cu ambele seruri test anti-D, iar controlul auto este negativ;

• Rh(D) negativ daca se obtin rezultate clar negative cu ambele seruri test anti-D, indiferent de rezultatul controlului auto.

Este obligatorie testarea suplimentara daca se obtin rezultate slab pozitive (<=2+) sau discordante cu serurile test, iar controlul auto este negativ, precum si daca se obtin rezultate pozitive cu ambele seruri test, iar controlul auto este pozitiv³.

La donatori, daca testul initial pentru D este negativ, trebuie efectuat un al doilea test care detecteaza D slab (acest lucru nu este necesar la primitorii de sange, care trebuie transfuzati cu sange Rh negativ)^1;2. De asemenea determinarea prezentei D slab la femeia gravida elimina tratamentul inutil cu imunoglobulina anti-D. Inaintea etichetarii unui pacient ca D slab trebuie sa ne asiguram ca nu a fost recent transfuzat cu eritrocite Rh pozitive².

Pentru metoda pe carduri

Pentru metoda de aglutinare pe carduri o reactie pozitiva se valideaza numai daca microtubul de control este negativ. Reactia pozitiva se apreciaza in functie de marimea aglutinatelor de la + la ++++, astfel : – rezultat pozitiv ( ++++) ;  – rezultat slab pozitiv ( + pana la +++ ) ;  – rezultat negativ ( – )

Interpretarea rezultatului in microtubul RH1 (D)

Un rezultat pozitiv in microtubul RH1(D) indica prezenta antigenului RH1(D) pe suprafata hematiilor investigate. Cardurile ABO/RH folosite in laborator nu permit detectia tuturor antigenelor D slab imunogene si nici fenotipul RH1 partial categoria VI(D^VI)

Pentru aceste antigene particulare trebuie sa se execute  teste suplimentare.

Interpretarea rezultatului in microtubul RH1,2,3(DCE)

Un rezultat pozitiv in tubul RH1,2,3(DCE) indica prezenta antigenului RH1(D) si/sau RH2(C) si/sau RH3(E) la suprafata hematiilor de testat⁴. 

Limite si interferente

Reactii fals pozitive (martor albuminos pozitiv)¹

• hematii in fisicuri/rulouri (mielom, macroglobulinemie Waldenström) – se reface determinarea dupa spalarea hematiilor;

• poliaglutinarea;

• anemii hemolitice cu autoanticorpi la cald (prezenta de anticorpi IgG pe suprafata hematiilor) – se reface grupajul cu un reactiv din care se elimina albumina, care contine Ac anti-D aglutinanti capabili sa aglutineze hematiile in suspensie salina (anti-D salin).

Reactii fals negative

• anemia hemolitica a nou-nascutului (blocarea situsurilor antigenice D de catre anticorpii materni)¹;

• individ cu Rh D slab – posibila aglutinare slaba si tardiva; aceste cazuri se indruma catre un serviciu de specialitate, unde determinarea D slab se face cu ajutorul testului antiglobulinic indirect cu anti-D IgG (incompleti policlonali)^1;3.

Bibliografie

1. Curs de imuno-hematologie, Institutul de Hematologie, Buc., 1993.

2. Galel, S. Malone III, J. Viele, M. Transfusion Medicine. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, 11th Ed., 2003: 832-873

3. Kretschmer, V. Sonneborn, H. Immunohematology. In Lothar Thomas. Clinical Laboratory Diagnostics –Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998: 877-934.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

5. Webert, K. Chan, H. Smith, J. Heddle, N. Kelton, J. Red Cell, Platelet and White Cell Antigens. In Wintrobe’s Clinical Hematology. Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, 11th Ed., 2003: 792-824.