Termenul de rezistenta la proteina C activata descrie incapacitatea proteinei C activate (APC) de a anticoagula plasma, iar aceasta conditie este asociata cu o predispozitie crescuta pentru tromboze venoase.

Mecanismul rezistentei la proteina C activata a devenit mai bine cunoscut o data cu identificarea in 1994 a mutatiei punctiforme G1691A de la nivelul genei care codifica factorul V al coagularii. Ca urmare a acestei mutatii este generat un factor V anormal (factorul V Leiden), caracterizat prin inlocuirea argininei din pozitia 506 cu glutamina  si modificarea consecutiva a situsului de legare a APC. Ulterior a fost identificat si un alt defect cauzat de mutatia G1691A si anume incapacitatea factorului V Leiden de a actiona ca un cofactor in procesul de degradare a FVIII activat de catre APC.

APC inactiveaza FVa prin clivarea a 3 legaturi de la nivelul lantului greu (amino-terminal): Arg506, Arg306, Arg679. Clivarea de la nivelul Arg506 este necesara pentru expunerea eficienta a celorlalte 2 situsuri de clivare, iar absenta sa determina rezistenta la APC.

Factorul V Leiden reprezinta principala cauza de APCR, fiind prezent la aproximativ 90% dintre pacienti. In absenta factorului V Leiden, APCR constituie un factor de risc independent pentru tromboza venoasa, riscul corelandu-se direct proportional cu gradul rezistentei. Printre conditiile asociate cu APCR in absenta factorului V Leiden se numara: nivelul crescut de FVIII, sarcina, administrarea de contraceptive orale, terapia hormonala de substitutie, prezenta anticoagulantului lupic.

APCR in absenta factorului V Leiden este mult mai frecventa la femei decat la barbati ceea ce indica o  predispozitie mai mare pentru tromboze post-operatorii la persoanele de sex feminin. Pe de alta parte, cea mai mica incidenta a APCR este intalnita la indivizii cu grupa sangvina O, deoarece acestia prezinta un nivel relativ mai scazut de FVIII.

Factorul V Cambridge, o conditie rara generata de o mutatie care determina inlocuirea argininei din pozitia 306 cu treonina, este de asemenea asociat cu APCR. Pana in prezent nu a fost identificata nici o mutatie la nivelul celui de-al treilea situs de clivare al FVa (Arg679)¹.

Recomandari pentru determinarea APCR - test screening pentru factorul V Leiden si alte cauze de APCR³.

Pregatire pacient - se va evita recoltarea probei de pe catetere heparinizate².

Specimen recoltat - sange venos².

Recipient de recolta - vacutainer cu citrat Na 0.105 M (1/9), capac bleu/verde².

Cantitate recoltata - cat permite vacuumul².

Cauze de respingere a probei - proba in cantitate inadecvata (sub nivelul indicat pe vacutainer); specimen hemolizat; prezenta de coaguli in proba².

Prelucrare necesara dupa recoltare - centrifugare 15 min. la 2500 g pentru obtinerea plasmei(plasma trebuie sa fie foarte saraca in trombocite, T <10000/μL – dubla centrifugare), urmata imediat de separarea plasmei si congelarea acesteia; probele recoltate in afara laboratorului vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate¹.

Stabilitate proba – plasma separata este stabila 1 luna la -20°C¹.

Metoda – test de coagulare care actioneaza specific la nivelul complexului protrombinazei, prin utilizarea unui activator de protrombina dependent de FVa izolat dintr-un venin de sarpe; sunt eliminate astfel posibilele interferente exercitate de catre factorii situati in amonte in cascada coagularii precum si dependenta fata de ionii de calciu; intr-o prima etapa, plasma diluata a pacientului va fi incubata la 37°C cu un activator de factor V provenit din veninul de Daboia russeli, care converteste FV in FVa; coagularea va fi initiata in absenta calciului prin adaugarea unui activator de protrombina dependent de FVa izolat din veninul de Notechis scutatus; se efectueaza doua teste de coagulare cu si fara adaugarea de APC, dupa care se calculeaza raportul dintre cei doi timpi; adaugarea APC va alungi semnificativ timpul de coagulare la persoanele cu genotip salbatic, in timp ce pacientii cu factor V Leiden prezinta rezistenta la APC, astfel ca timpul lor de coagulare nu va fi influentat semnificativ de adaugarea acestui reactiv; reactivii contin un inhibitor de heparina ceea ce permite efectuarea testului la pacienti aflati sub heparinoterapie, avand concentratii ale heparinei ≤2UI/mL².

Valori de referinta - ≥2.5  (raport)².

Limite si interferente

Obtinerea unui rezultat pozitiv necesita efectuarea testului genetic care depisteaza mutatia factorului V Leiden si stabileste statusul homozigot/heterozigot.

In unele cazuri (la valori de granita ale raportului) testul poate esua in distingerea indivizilor heterozigoti pentru factorul V Leiden fata de normali.

Testul nu detecteaza rezistenta la proteina C activata de cauza dobandita.

Deficitul de fibrinogen, protrombina, FVIII, FX, ATIII, proteina C, proteina S (pana la 100%), cat si excesul de fibrinogen, factor VIII, sau ATIII (de pana la 5 ori normalul) nu influenteaza semnificativ valoarea raportului si sensibilitatea testului².

Prezenta anticoagulantului lupic nu exercita influenta asupra testului. In urma unor studii efectuate s-a constatat ca de asemenea sarcina, contraceptivele orale si anticoagulantele orale nu afecteaza performanta testului⁴.

Deficitul important de factor V in plasma (<50%) poate conduce la timpi de coagulare alungiti si astfel se poate pierde performanta discriminatorie. Prezenta aprotininei (care inhiba APC utilizata in test) sau a protaminei in plasma pacientului poate conduce la scaderea timpilor de coagulare si de asemenea la afectarea capacitatii discriminatorii. Inhibitorii directi ai trombinei (hirudin, argatroban) influenteaza timpii de coagulare si valoarea raportului. Din aceste motive, trebuie intrerupt tratamentul cu aprotinina, protamina sau inhibitori de trombina cu cel putin 24 ore inaintea recoltarii².

Bibliografie

1. Ian Jennings, Peter Cooper. Screening for Thrombophilia: A Laboratory Perspective. In British Journal of Biomedical Science, 2003.

2. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog

3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Activated Protein C Resistance www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

4. Reta Schöni, Peter Quehenberger, Jogin R Wu, Marianne Wilmer. Clinical evaluation of a new functional test for detection of activated protein C resistance (Pefakit® APC-R Factor V Leiden) at two centers in Europe and the USA. In Thrombosis Research 2007; 119(1): 17-26.

Antitrombina III  

Proteina C

Rezistenta la proteina C activata (APCR)  

Proteina S este o glicoproteina dependenta de vitamina K sintetizata in ficat, celule endoteliale si megakariocite. Aproximativ 60% din cantitatea circulanta de proteina S este legata de proteina de legare a fractiunii C4b a complementului (C4b-binding protein). Restul cantitatii de proteina se gaseste sub forma libera, capabila sa actioneze ca un cofactor non-enzimatic al proteinei C activate. Proteina S intensifica inactivarea factorilor Va si VIIIa la nivelul suprafetelor fosfolipidice si de asemenea exercita un rol in efectul fibrinolitic al proteinei C activate. Studiile recente indica o posibila implicare a fractiunii legate a proteinei S in activitatea anticoagulanta independenta de proteina C activata^1;2.

Deficitul de proteina S se asociaza cu tromboza venoasa recurenta, cu sau fara embolism pulmonar, survenita la pacienti tineri^1;2;5.

Exista 3 tipuri de deficit de proteina S:

- tipul I: proteina S este normala functional, dar se gaseste intr-o cantitate insuficienta pentru a controla cascada coagularii (sunt scazute atat forma libera cat si cea legata, iar activitatea este redusa);

- tipul II: cantitate normala de proteina S, care este insa incapabila sa-si exercite functia (activitate redusa) ca urmare a unor defecte moleculare;

- tipul III: cantitate redusa de proteina S libera asociata cu o activitate scazuta, in prezenta unei cantitati normale de proteina S totala⁵.

Deficitul dobandit de proteina S poate fi intalnit in sarcina, administrarea contraceptivelor orale, afectiuni hepatice, nefropatie diabetica, tromboza venelor cerebrale, purpura trombotica trombocitopenica precum si in alte afectiuni autoimune si inflamatorii in care se inregistreaza o crestere a proteinei de legare a fractiunii C4b si concomitent o scadere a fractiunii libere¹.

Recomandari pentru determinarea proteinei S

• investigarea unor complicatii tromboembolice neexplicabile, in special la pacienti <50 ani si cu istoric familial pozitiv de evenimente trombotice;

• inaintea administrarii contraceptivelor orale la paciente cu  episoade trombotice in antecedente sau cu istoric familial pozitiv³.

Pregatire pacient - à jeun; daca pacientul se afla sub terapie cu anticoagulante orale, acestea vor fi intrerupte cu 2 saptamani inaintea recoltarii; de asemenea, tratamentul cu heparina va fi intrerupt cu 2 zile inaintea recoltarii^3;4.

Specimen recoltat - sange venos³. 

Recipient de recoltare - vacutainer cu citrat de Na 0.105 M (1/9) (capac bleu/verde)³.

Cantitatea recoltata - cat permite vacuumul³.

Cauze de respingere a probei

-specimen hemolizat

-specimen coagulat

-vacutainer care nu este plin

-specimen contaminat cu heparina³

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa plasma prin centrifugare si se lucreaza imediat;  daca acest lucru nu este posibil, plasma se poate stoca la -20°C; probele de plasma recoltate in alte centre decat laboratorul Grozovici vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate³.

Stabilitate proba – plasma separata este stabila 4 ore la 18-25°C; 1 luna la -20C⁴; se va evita decongelarea/recongelarea³.

Metoda - test de coagulare care masoara activitatea proteinei S³. 

Valori de referinta -  65-145%³.

Interpretarea rezultatelor

Testul detecteaza toate cele 3 tipuri de deficit, dar nu permite diferentierea lor. De aceea, in cazul obtinerii unei activitati scazute a proteinei S se recomanda testarea antigenului proteinei S totale si proteinei S libere³.

Limite si interferente 

Nou-nascutii prezinta o activitate scazuta a proteinei S⁴.

Sarcina, folosirea contraceptivelor orale, tratamentul cu heparina sau proba contaminata cu heparina (recoltare de pe cateter heparinizat) se pot asocia de asemenea cu o reducere a activitatii proteinei S^1;4.

Prezenta inhibitorilor de trombina (hirudin sau argatroban), anticoagulantilor lupici sau altor anticorpi antifosfolipidici in plasma testata poate determina o supraestimare a activitatii proteinei S. Pe de alta parte, rezistenta la proteina C activata (datorata mutatiei factorului V Leiden) poate induce masurarea unei activitati scazute a proteinei S^3;4.

Bibliografie

1. Frances Fischbach. Blood Studies; Hematology and Coagulation. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 ed. 2009, 179-181.

2. Ian Jennings, Peter Cooper. Screening for Thrombophilia: A Laboratory Perspective. In British Journal of Biomedical Science, 2010. www.findarticles.com.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

4. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Protein S Functional www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

5. Protein S Deficiency. www.med.uiuc.edu/hematology.

Proteina C este o glicoproteina sintetizata in ficat (printr-un mecanism dependent de vitamina K), care circula in plasma si are rol in prevenirea trombozelor. Functia sa de anticoagulant se exercita prin inactivarea factorilor V si VIII. De asemenea, actioneaza ca un agent profibrinolitic¹.

Proteina C este activata de trombina; rata de activare este accelerata prin formarea unui complex intre trombina si trombomodulinul celulei endoteliale. Proteina C activata degradeaza factorii Va si VIIIa printr-un clivaj proteolitic selectiv, conducand la reducerea activitatii procoagulante a plasmei. Pentru inactivarea factorilor de coagulare este necesara prezenta unui cofactor-proteina S- alaturi de ionii de calciu si o suprafata membranara fosfolipidica. Proteina C activata este neutralizata de un inhibitor specific, de alfa2-antiplasmina si alfa2-macroglobulina^2;5.

Incidenta deficitului de proteina C in populatia generala este de aproximativ 0.2%. Deficitul de proteina C poate fi ereditar sau dobandit; in cazul deficitului ereditar severitatea manifestarilor clinice este dependenta de statusul homo/heterozigot. Astfel, deficitul heterozigot se asociaza cu episoade de tromboza venoasa profunda, complicate sau nu cu embolie pulmonara, survenite la pacienti tineri. Deficitul homozigot se manifesta imediat dupa nastere, prin fenomene tromboembolice masive si potential fatale (purpura fulminans neonatala)⁵.

Pe baza testelor functionale si imunologice, deficitul de proteina C poate fi subdivizat in 2 tipuri:

- tipul I (cantitativ), prezent in majoritatea cazurilor de deficit de proteina C, se caracterizeaza printr-o functionalite normala a proteinei C, care se gaseste insa  intr-o cantitate insuficienta pentru a controla cascada coagularii (reducere concomitenta a antigenului proteinei C si a gradului de activitate);

- tipul II (calitativ) se caracterizeaza printr-o cantitate normala de proteina C care este insa incapabila sa-si exercite functia (activitate redusa) ca urmare a unor defecte moleculare^2;3;5.

Deficitul dobandit de proteina C apare la pacientii cu afectiuni hepatice, coagulare intravasculara diseminata (CID), diabet insulino-dependent, hipertensiune esentiala, siclemie, procese maligne si in cursul terapiei cu anticoagulante orale sau L-asparaginaza¹.

Recomandari pentru determinarea proteinei C:

• investigarea unor complicatii tromboembolice neexplicabile, in special la pacienti <50 ani si cu istoric familial pozitiv de evenimente trombotice;

• inaintea administrarii contraceptivelor orale la paciente cu  episoade trombotice in antecedente sau cu istoric familial pozitiv³.

Pregatire pacient - à jeun; daca pacientul se afla sub terapie cu anticoagulante orale, acestea vor fi intrerupte cu 2 saptamani inaintea recoltarii; de asemenea, tratamentul cu heparina va fi intrerupt cu 2 zile inaintea recoltarii^3;4.

Specimen recoltat - sange venos³. 

Recipient de recoltare - vacutainer cu citrat de Na 0.105 M (1/9) (capac bleu/verde)³.

Cantitatea recoltata - cat permite vacuumul³.

Cauze de respingere a probei

-specimen hemolizat

-specimen coagulat

-vacutainer care nu este plin

-specimen contaminat cu heparina ³

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa plasma prin centrifugare si se lucreaza imediat; daca acest lucru nu este posibil, plasma se poate stoca la -20°C; probele de plasma recoltate in alte centre decat laboratorul Grozovici vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate³.

Stabilitate proba - plasma separata este stabila 4 ore la 18-25° C; 1 luna la -20C; se va evita decongelarea/recongelarea³.

Metoda - cromogena (test de activitate); pentru activarea directa a proteinei C din plasma se foloseste un extract de venin de sarpe (Agkistrodon contortrix contortrix)³. 

Valori de referinta – 70-130%³.

Interpretarea rezultatelor

Testul detecteaza ambele tipuri (I si II) de deficit, dar nu permite diferentierea lor. De aceea, in cazul obtinerii unei activitati scazute a proteinei C se recomanda testarea antigenului proteinei C³.

Scaderea activitatii proteinei C se asociaza cu:

• episoade trombotice severe in perioada neonatala;

• risc crescut de episoade trombotice venoase;

• necroze cutanate induse de warfarina (patognomonice pentru deficitul de proteina C);

• CID, in special la pacientii neoplazici;

• tromboflebita si embolism pulmonar, in special la adultii tineri¹.

Limite si interferente 

Nou-nascutii prezinta o activitate scazuta a proteinei C.

Sarcina, folosirea contraceptivelor orale, statusul postoperator si dozele mari de heparina se pot asocia de asemenea cu o reducere a activitatii proteinei C¹.

PIVKA -proteine induse de antagonistii de vitamina K- care apar in plasma pacientilor tratati cu anticoagulante orale pot interfera cu testul, conducand la o supraestimare a activitatii proteinei C^3;4.   Pe de alta parte, prezenta aprotininei in plasma testata poate determina o subestimare a activitatii proteinei C³.

Bibliografie

1. Frances Fischbach. Blood Studies; Hematology and Coagulation. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 ed. 2009, 178-179.

2. Ian Jennings, Peter Cooper. Screening for Thrombophilia: A Laboratory Perspective. In British Journal of Biomedical Science, 2010.

3. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

4. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Protein C Activity. (Chromogenic) www.labcorp.com . 2003. Ref Type: Internet Communication.

5. Protein C Deficiency. www.med.uiuc.edu/hematology.

Antitrombina III este un inhibitor potent al reactiilor din cascada coagularii. Desi numele „antitrombina” ar implica o actiune numai la nivelul trombinei, de fapt acest anticoagulant natural inhiba intr-o oarecare masura toate enzimele coagularii. Principalele enzime inhibate sunt: factor Xa, IXa si trombina (factor IIa); de asemenea antitrombina exercita actiuni inhibitorii asupra factorilor XIIa, XIa si a complexului factor VIIa si factor tisular⁵.

Antitrombina a fost descoperita in 1939 ca  o substanta prezenta in plasma ce actioneaza impreuna cu heparina pentru a preveni aparitia trombozelor. De fapt, actiunea de sine statatoare a antitrombinei III este relativ ineficienta, dar atunci cand se combina cu heparina viteza reactiei de inhibare a factorilor de coagulare este puternic accelerata, ceea ce face din complexul antitrombina-heparina un component vital al mecanismului anticoagulant si sta la baza indicatiilor terapeutice ale preparatelor de heparina.

Deficitul de antitrombina III a carui incidenta in populatie este raportata ca fiind cuprinsa intre 0.02% si 1% poate fi congenital sau dobandit si se asociaza cu un risc crescut de tromboembolism recurent^2;5.

Din punct de vedere al defectului implicat exista 2 tipuri principale de deficit de antitrombina III:

- tipul I (cantitativ) caracterizat printr-o cantitate inadecvata de antitrombina ce este normala din punct de vedere functional (sunt scazute atat activitatea cat si antigenul antitrombinei III);

-tipul II (calitativ) asociat cu o cantitate normala de antitrombina III, care insa nu este capabila sa-si exercite functia de inhibitor al coagularii (antigenul antitrombinei III este normal cantitativ dar activitatea este scazuta)^1;2;5.

Recomandari pentru determinarea antitrombinei III

• investigarea unor complicatii tromboembolice neexplicabile, in special la pacienti <50 ani si cu istoric familial pozitiv de evenimente trombotice³;

• investigarea unor episoade de tromboza venoasa cu localizari neobisnuite (ex. tromboza venelor mezenterice)¹.

Pregatire pacient - à jeun; daca pacientul se afla sub terapie cu anticoagulante orale, acestea vor fi intrerupte cu 2 saptamani inaintea recoltarii; de asemenea, tratamentul cu heparina va fi intrerupt cu 2 zile inaintea recoltarii^3;4.

Specimen recoltat - sange venos³. 

Recipient de recoltare - vacutainer cu citrat de Na 0.105 M (1/9) (capac bleu/verde)³.

Cantitatea recoltata - cat permite vacuumul³.

Cauze de respingere a probei

-specimen hemolizat;

-specimen coagulat;

-vacutainer care nu este plin;

-specimen contaminat cu heparina³.

Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa plasma prin centrifugare si se lucreaza imediat;  daca acest lucru nu este posibil, plasma se poate stoca la -20°C; probele de plasma recoltate in alte centre decat laboratorul Grozovici vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate³.

Stabilitate proba – plasma separata este stabila 8 ore la 18-25° C; 1 luna la -20C⁴; se va evita decongelarea/recongelarea³.

Metoda - cromogena ( test de activitate)³. 

Valori de referinta ³

Interpretarea rezultatelor

Testul detecteaza ambele tipuri (I si II) de deficit, dar nu permite diferentierea lor. De aceea, in cazul obtinerii unei activitati scazute a antitrombinei III se recomanda testarea fractiunii antigenice³.

Scaderea activitatii antitrombinei III se asociaza cu:

• deficit congenital (ereditar);

• transplant hepatic, ciroza, insuficienta hepatica;

• boala trombotica activa (tromboza venelor profunde);

• CID, afectiuni insotite de fibrinoliza;

• infarct miocardic acut;

• embolism pulmonar;

• carcinoame, traumatisme, inflamatii severe

• boli asociate cu pierderi de proteine;

• esec al tratamentului cu heparina.

Cresterea activitatii antitrombinei III se asociaza cu:

• hepatita acuta;

• transplant renal;

• inflamatii (VSH crescut);

• hiperglobulinemie;

• folosirea anticoagulantelor orale¹.

Limite si interferente 

Nou-nascutii prezinta o activitate scazuta a antitrombinei III⁴.

Folosirea contraceptivelor orale, statusul postoperator, imobilizarea prelungita la pat si tratamentul cu L-asparaginaza se pot asocia de asemenea cu o reducere a activitatii antitrombinei III.Rezultatele nu sunt concludente in ultimul trimestru de sarcina si imediat post-partum¹.

Prezenta inhibitorilor de trombina (hirudin sau argatroban) in plasma testata poate interfera cu testul⁴.

Bibliografie

1. Frances Fischbach. Blood Studies; Hematology and Coagulation. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 ed. 2009, 181-182.

2. Ian Jennings, Peter Cooper. Screening for Thrombophilia: A Laboratory Perspective. In British Journal of Biomedical Science, 2003.

3. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog

4. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. Antithrombin Activity www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication

5. Antithrombin Deficiency. www.med.uiuc.edu/hematology

Anticoagulantii de tip lupic sunt anticorpi indreptati impotriva complexelor fosfolipide-proteine. Acestia interfera in vitro cu testele de coagulare dependente de fosfolipide, determinand prelungirea lor (cel mai frecvent folosit fiind timpul de tromboplastina partiala activat aPTT)^2;3.

In vivo, prezenta anticogulantilor de tip lupic se asociaza cu un risc crescut de evenimente trombotice (trombofilie)³. Prevalenta trombozelor la pacientii cu anticoagulanti lupici este de 24-36%; predomina trombozele profunde ale membrelor si embolismul pulmonar. Pacientele cu avorturi spontane recurente prezinta anticoagulanti lupici in aproximativ 10% din cazuri. 

Datorita heterogenitatii intrinseci a anticoagulantilor lupici diagnosticul de laborator este adesea dificil. Testele folosite trebuie sa fie capabile sa distinga  anticorpii cu activitate de lupus anticoagulant de anticorpii anti-factori de coagulare, deficitul de factori si heparina, deoarece toate aceste patru conditii pot cauza prelungirea testului aPTT. In practica, plasmele cu deficit de factori de coagulare sunt usor de identificat, deoarece adaugarea plasmei normale normalizeaza in vitro timpul de coagulare. Cu toate acestea, testul aPTT izolat nu poate diferentia cu certitudine plasmele care contin anticoagulanti lupici de cele care contin anticorpi anti-factori de coagulare si/sau heparina¹.

In 2009 Societatea Internationala de Hemostaza si Tromboza a revizuit si modificat recomandarile privind detectarea anticoagulantului lupic (LA). Astfel, s-au imbunatatit criteriile de selectare a pacientilor la care se indica aceasta investigatie si de asemenea a fost elaborat un algoritm de testare in laborator.

Selectarea pacientilor

Testarea pentru detectarea LA trebuie sa fie limitata la pacientii care au o probabilitate semnificativa de a avea sindrom antifosfolipidic (APS) sau care prezinta o prelungire neexplicata a aPTT la un control de rutina.

Trombozele venoase profunde neprovocate sau trombozele arteriale fara explicatie aparute la pacienti tineri (<50 ani), trombozele cu localizare neobisnuita, pierderile de sarcina survenite tardiv, orice episod trombotic sau complicatie a sarcinii la persoane avand boli autoimune (lupus eritematos sistemic, artrita reumatoida, trombocitopenie autoimuna, anemie hemolitica autoimuna) indica o probabilitate mare de APS; subiectii asimptomatici depistati intamplator cu aPTT prelungit, pacientele cu avorturi spontane recurente survenite precoce in sarcina si persoanele tinere cu tromboze venoase profunde provocate au o probabilitate medie de APS, in timp ce trombozele venoase profunde sau tromboembolismul arterial survenite la varstnici se asociaza cu probabilitate redusa de APS.

Algoritmul de testare in laborator pentru detectarea LA optima

A) recoltarea probei: se recomanda ca recoltarea probelor sa fie efectuata inaintea initierii tratamentului anticoagulant sau la suficient timp dupa intreruperea acestuia; sangele va fi recoltat pe citrat de sodiu 0.105M (1/9); proba va fi dublu centrifugata; daca testul nu se efectueaza imediat, plasma separata va fi rapid congelata; inaintea efectuarii testului proba va fi decongelata prin imersia completa intr-o baie de apa la 37°Ctimp de 5 minute.

B) alegerea testelor: se recomanda efectuarea a doua teste screening bazate pe principii diferite (testul cu venin de vipera Russel diluat = dRVVT – testul cel mai robust pentru detectarea LA) si un test aPTT ce foloseste silica ca activator si are un continut scazut de fosfolipide (al doilea test ca sensibilitate dupa dRVVT); daca se obtine un rezultat pozitiv la unul din cele doua teste se trece la etapele de mai jos;

C) amestecul plasma normala + plasma de pacient („mixing test”): se efectueaza un amestec 1:1 de plasma normala + plasma de pacient, fara preincubare, timp de 30 minute; plasma normala poate fi obtinuta in house de la donatori sanatosi sau se poate utiliza plasma comerciala liofilizata sau congelata; rezultatul testului este sugestiv pentru LA daca timpul de coagulare al amestecului de plasma este mai mare decat valoarea cut-off stabilita pentru plasma normala; amestecul corecteaza timpii de coagulare in cazul deficitului de factorii plasmatici; ideal se va efectua si un timp de trombina pentru a identifica prezenta heparinei si inhibitorilor specifici ai factorilor coagularii; testul nu va putea fi efectuat daca plasma este incoagulabila.

D) testele de confirmare – utilizeaza reactivi cu un continut ridicat de fosfolipide (fosfolipide in bistrat sau in faza hexagonala); se testeaza proba pacientului cu reactivul ce are concentratie ridicata de fosfolipide (confirmare) si se compara rezultatul obtinut cu cel de la etapa de screening (in prezenta unui reactiv cu un continut scazut in fosfolipide); se calculeaza corectia procentuala [(screen – confirm) / screen] x 100, fie raportul LA (screen/confirm) si se interpreteaza in raport cu valorile cut-off stabilite pentru plasma normala.

E) raportarea rezultatelor – se va face cantitativ cu un comentariu care sa indice daca rezultatele sunt compatibile cu un rezultat pozitiv sau negativ⁴.

Pregatire pacient – ideal, proba trebuie sa fie recoltata inaintea initierii tratamentului anticoagulant¹.

Specimen recoltat - sange venos¹.

Recipient de recolta - vacutainer cu citrat Na 0.105 M (1/9), capac bleu/verde¹.

Cantitate recoltata - cat permite vacuumul¹.

Cauze de respingere a probei - proba in cantitate inadecvata (sub nivelul indicat pe vacutainer); specimen hemolizat; prezenta de coaguli in proba¹.

Prelucrare necesara dupa recoltare - centrifugare 15 min la 2500 g pentru obtinerea plasmei(plasma trebuie sa fie foarte saraca in trombocite, T <10000/μL – dubla centrifugare), urmata imediat de separarea plasmei si congelarea acesteia; probele recoltate in afara laboratorului vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate^1;2.

Stabilitate proba – plasma separata este stabila 4 ore la temperatura camerei;1 luna la -20°C¹.

Metode

Screening: dRVVT screen + aPTT-LA (aPTT sensibil pentru LA); daca rezultatul este negativ la ambele teste, LA va fi comunicat negativ; daca se obtine un rezultat pozitiv la unul sau ambele teste, se va recurge la „mixing test”  si la testele de confirmare.

Confirmare: daca aPTT-LA este pozitiv se va efectua testul de neutralizare cu fosfolipide in faza hexagonala; daca dRVVT screen este pozitiv se va efectua dRVVT confirm.

Valori de referinta - anticoagulant lupic negativ¹.

Mentiune: Pentru diagnosticul de sindrom antifosfolipidic sunt semnificative 2 rezultate pozitive obtinute la interval de 12 saptamani^1;2;3.

Limite si interferente

Rezultatele obtinute pe probe recoltate in cursul unui episod trombotic acut trebuie interpretate cu prudenta deoarece pacientii se afla sub tratment anticoagulant de atac, iar reactantii de faza acuta (de exemplu, FVIII) pot inregistra valori crescute⁴. La pacientii aflati in tratament cu preparate de heparina cu greutate moleculara mica (LMWH) testul se poate efectua numai din probele recoltate la 12 ore de la ultima doza administrata. Daca testul trebuie efectuat la pacienti sub anticoagulante orale se recomanda intreruperea acestora si administrarea de LMWH⁴.

Nivelurile de heparina >1 UI/mL pot produce interferente, nivelurile mai mici fiind contracarate de substantele neutralizante continute in reactivi¹.

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

2. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Lupus Anticoagulant Profile. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication

3. Lothar Thomas. Haemostasis. In Clinical Laboratory Diagnostics, 1998, 636-638.

4. V. Pengo, A. Tripodi, G. Reber, J.H. Rand, T.L. Ortel, M. Galli, P.G. de Groot. Official Communication of the SSC: Update of the Guidelines for Lupus Anticoagulant Detection. In Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2009, 7: 1737-1740.