Spermocultura (cu antibiograma dupa caz)

Spermograma 

Informatii generale

Flora normala a tractului genital feminin variaza in functie de pH-ul si concentratia de estrogeni a mucoasei, aflate in stransa corelatie cu varsta, astfel:

- prepubertar si postmenopauza flora este dominata de stafilococi si corinebacterii (aceeasi flora pe care o gasim pe suprafata epiteliului);

- la femeile active sexual flora microbiana se modifica, fiind alcatuita din Enterobacteriaceae, streptococi, stafilococi, bacterii anaerobe (lactobacili, bacili anaerobi nesporulati, coci anaerobi). Lactobacilii reprezinta flora microbiana vaginala normala la aceste femei.

Streptococul hemolitic grup B (Streptococcus agalactiae) este prezent in flora vaginala si poate fi transmis la nou – nascuti (cu aparitia de complicatii neonatale)¹.

Clasificarea infectiilor de tract genital feminin

Infectiile genitale feminine reprezinta o cauza frecventa de consult ginecologic. Ele pot evolua ca:

• infectii endogene, determinate de microorganisme din flora vaginala normala;

• infectii exogene, cauzate in special de microorganisme cu transmitere sexuala:

- bacterii (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis – serotipurile D-K, Treponema pallidum)

- virusuri (Herpes simplex – tip 2, Papillomavirus)

- protozoare (Trichomonas vaginalis).

O alta clasificare imparte infectiile de tract genital feminin in:

• infectii genitale joase – afecteaza vulva, vaginul si cervixul – apar, de obicei, ca urmare a unui contact sexual infectant sau ca urmare a unui dezechilibru al florei genitale normale.
• infectii genitale inalte – intereseaza uterul, trompele uterine, ovarele – apar frecvent ca extindere a infectiilor genitale joase. Se considera ca microorganismele existente in vagin si cervix patrund in cavitatea uterina si pot ajunge prin endometru la nivelul trompelor si al ovarelor^1;2.

Infectiile genitale joase

Infectiile vulvare pot fi bacteriene, virale, micotice sau parazitare si se pot manifesta fie izolat, fie asociate cu vaginite. Pot fi:

- infectii comune: foliculite, furuncule, piodermite;

- infectii specifice: Trichomonas vaginalis, infectii micotice, Treponema pallidum, Herpes simplex – tip 2, Papillomavirus (mai ales 6 si 11);

- mai rar Sarcoptes scabiae.

Bartholinita (inflamatia glandelor Bartholin, situate la jonctiunea dintre vulva si vagin), poate fi determinata de Neisseria gonorrhoeae, C. trachomatis sau prin exacerbarea florei genitale locale. Blocarea conductului glandular prin procesul inflamator poate determina un abces din care se pot izola germeni aerobi si anaerobi.

Vaginita (descrisa de cele mai multe ori ca vulvovaginita) poate fi:

- specifica: produsa de fungi, Trichomonas vaginalis, Treponema pallidum, Papilomavirus;

- nespecifica: – produsa prin multiplicarea florei vaginale normale;

- produsa de corpi straini – in cazul prezentei de dispozitive contraceptive sau, la fetite, prin introducerea accidentala a corpilor straini in vagin.

Staphylococcus aureus, prezent in vagin la 5-10% dintre femeile sanatoase, poate cauza scurgeri purulente si soc toxic in conditiile utilizarii de tampoane hiperabsorbante in perioada menstruala.

La fetite sunt posibile vulvovaginite cu N. gonorrhoeae, C. trachomatis sau Streptococcus pyogenes. In cazurile cu igiena precara sunt posibile cazuri de vulvovaginite cu Enterobius vermicularis, prin migrarea parazitului in vagin.

Vaginoza – sindrom infectios neinflamator – consta in inlocuirea florei lactobacilare normale cu specii bacteriene anaerobe (Bacteroides spp, Prevotella spp, Porphyromonas spp, Peptostreptococcus spp, Mobiluncus spp) asociate cu Gardnerella vaginalis. Aceste specii bacteriene fac parte din flora normala a vaginului, dar in cazul vaginozelor multiplicarea lor este de pana la 1000 ori mai mare. Desi infectia evolueaza cu precadare in perioada de activitate sexuala, ea poate aparea si la adolescente si preadolescente.

Cervicita

Exocolul uterin poate fi afectat de:

-T. vaginalis, Candida albicans – infectii ce evolueaza ca cervico-vaginite;

-Papillomavirus (mai ales tipurile 16 si 18) – implicat in etiologia neoplaziilor cervicale intraepiteliale;

-Herpes simplex tip 2 – evolueaza cu leziuni ulcerative endo si exocervicale.

Endocolul uterin poate fi sediul infectiilor cu:

-N. gonorrhoeae – poate evolua asimptomatic la aproximativ 30% dintre femeile infectate. Contaminarea mucoasei uretrale si rectale poate determina localizari concomitente la aceste nivele, cu manifestari clinice de uretrita sau proctita;

-C. trachomatis (serotipurile D-K) – nu determina vaginita. Deseori, pacientele au infectie cu etiologie dubla (gonococ cu Chlamydia). In laboratoarele Synevo se poate diagnostica infectia cu C.trachomatis prin depistarea antigenului in secretia recoltata de la nivelul endocolului. Nu se recomanda recoltarea din fundul de sac posterior (pot aparea rezultate fals negative)^1,2,3.

Diagnosticul infectiilor genitale joase

Recoltarea produselor patologice se efectueaza in cabinetele de ginecologie, cu instrumentar adecvat, de obicei din fundul de sac vaginal posterior.

In momentul recoltarii este bine a se efectua (chiar in cabinetul de consultatie) doua teste rapide care pot orienta diagnosticul:

-determinarea pH-ului secretiei vaginale cu ajutorul hartiei indicator (un pH>5 poate indica infectie cu T. vaginalis sau prezenta vaginozei);

-testul aminelor volatile (“whiff test”) – prin adaugarea catorva picaturi de solutie KOH 10% peste secretia vaginala recoltata pe valva. Degajarea unui miros dezagreabil de peste alterat conduce la suspiciunea de vaginoza².

In cadrul laboratoarelor Synevo, secretia vaginala se recolteaza pe doua tampoane si doua lame de microscopie:

-un tampon se introduce in recipientul Vagicult (un mediu special de imbogatire si depistare a Trichomonas vaginalis si levurilor) din care se va efectua preparat proaspat intre lama si lamela. Examinarea se face cu obiectiv de 10x si 40x si permite evidentierea parazitului T. vaginalis, a levurilor – inmugurite si hife – si a reactiei inflamatorii (intensa in trichomoniaza, discreta in candidoza si absenta in vaginoza);

-cel de-al doilea tampon recoltat pe mediu de transport (Amies sau Stuart) va fi utilizat pentru insamantare pe medii de cultura;

-lamele de microscopie vor fi colorate Gram (pentru aprecierea florei vaginale) si Giemsa (pentru aprecierea reactiei inflamatorii)³.

In conditii normale, pe frotiul colorat Gram se observa bacili Gram pozitivi, drepti sau usor incurbati cu laturile paralele, cu grosimea si lungimea variabile pana la polimorfism, uneori filamentosi, care reprezinta flora lactobacilara (bacili Döderlein, vezi figura 21.5.5.1)². In vaginoze, flora lactobacilara este inlocuita cu bacili Gram variabili (G. vaginalis, Bacteroides spp.) si bacili Gram negativi incurbati (Mobiluncus) – vezi figura 21.5.5.2. Vaginoza se caracterizeaza prin prezenta de  “clue cells” – celule vaginale superficiale ce prezinta pe suprafata lor abundenta flora bacteriana (vezi figura 21.5.5.3). Prezenta formatiunilor rotund-ovalare Gram pozitive este sugestiva pentru candidoza vaginala (vezi figura 21.5.5.4^1;2.

Fig. 21.5.5.1:  Lactobacillus spp. (coloratie Gram, x1000, imagine din colectia proprie a laboratorului) 

Aspect normal al unui prelevat vaginal: prezenta a numeroase celule epiteliale pavimentoase, polimorfonucleare putine, bacili Doderlein 

Fig. 21.5.5.2:   Mobiluncus spp. si Gardnerella vaginalis (coloratie Gram, x1000, imagine din colectia proprie a laboratorului)

Fig. 21.5.5.3:  Frotiu sugestiv pentru vaginoza bacteriana:  (coloratie Gram, x1000, imagine din colectia proprie a laboratorului)

Fig. 21.5.5.4 Levuri prezente in secretia vaginala (coloratie Gram, x1000, imagine din colectia proprie a laboratorului)

Vizualizarea cocilor Gram negativi “in diplo” cu aspect de boabe de cafea localizati predominant intraleucocitar indica foarte probabil infectia cu Neisseria  gonorrhoeae (vezi figura 21.5.5.5).

Trichomonas vaginalis se observa cel mai bine pe preparatul nativ. Are forma rotund-ovalara cu dimensiuni de 7-23/5-15 μm. Prezinta in mod normal 4 flageli anteriori si unul posterior care ii confera o motilitate rapida. De asemenea se mai pot observa membrana ondulanta si un axostil care se misca in lungul celulei. Parazitul mai poate vizualizat si pe frotiul Gram (vezi figura 21.5.5.6).

Fig. 21.5.5.5  Neisseria  gonorrhoeae (coloratie Gram, x1000, imagine din colectia proprie a laboratorului)

Fig. 21.5.5.6 Trichomonas vaginalis (coloratie Gram, x1000, imagine din colectia proprie a laboratorului)

Insamantarea secretiei recoltata pe tamponul cu mediu de transport se face pe mediul agar Columbia cu 5% sange de berbec si un mediu lactozat cu incubare in atmosfera obisnuita 18 – 24 de ore la 35–37ºC. Microorganismele izolate se identifica pana la nivel de specie si se efectueaza . antibiograma doar la germenii a caror prezenta a fost regasita si pe frotiul colorat Gram, alaturi de reactia inflamatorie. Se urmareste, de asemenea, prezenta Streptococcus agalactiae la femeile gravide in ultimul trimestru de sarcina³.

Daca exista suspiciunea de infectie cu N. gonorrhoeae, incubarea se face in atmosfera cu 5% CO₂.

In cazul suspiciunii de candidoza, proba se va insamanta pe mediul Sabouraud cu Cloramfenicol³. Candida albicans este normal prezenta in vaginul a 15 – 20% din femei, ajungand la 30% in trimestrul al III-lea de sarcina. Prin urmare, este semnificativa pentru o infectie cu Candida spp. colonizarea masiva a vaginului². Dupa izolarea in cultura a levurilor se va trece la identificarea si efectuarea antifungigramei³.

La fetite, recoltarea se va face de la nivelul orificiului de deschidere a vaginului sau se poate recolta endovaginal, daca exista instrumentar adecvat; se urmareste in special diagnosticarea vulvo-vaginitelor cu S. pyogenes si N. gonorrhoeae².

Diagnosticul bartolinitei se face prin colectarea exsudatului purulent cu ajutorul a doua tampoane: unul pentru microscopie si unul pentru insamantare pe medii de cultura. Incubarea trebuie facuta atat in conditii de aerobioza cat si anaerobioza; se urmareste in special prezenta N. gonorrhoeae. In cazul unui puroi “steril” se suspicioneaza infectia cu C. trachomatis sau Ureaplasma urealyticum^1,2.

Infectiile genitale inalte

In functie de localizare:

- la nivelul mucoasei uterine: endometrite;

- daca inflamatia cuprinde si muschiul uterin: endomiometrite.

Infectia acuta survine: – postpartum sau postabortum (vaginoza fiind factor de risc) si dupa explorari sau interventii endouterine (histerosalpingografie, implantare de sterilet).

Etiologia lor este variata, fiind implicate bacterii aerobe si anaerobe ce fac parte din flora endogena vaginala: Streptococ grup B, enterococi, Enterobacteriaceae, Gardnerella vaginalis, bacili Gram negativi anaerobi, Mycoplasma hominis, Clostridium perfringens (in avort septic provocat), Streptococcus pyogenes etc².

In 10 – 20% din cazuri, endometritele acute pot evolua cu bacteriemie.

Endometritele cronice (asociate cu endocervicite si salpingite) pot fi determinate de C. trachomatis (prin propagare ascendenta) sau Mycobacterium tuberculosis (pe cale hematogena).

Inflamatia epiteliului endotubar sau a trompei in general (salpingita) poate fi produsa de:

- M. tuberculosis, N. gonorrhoeae, C.trachomatis – prin propagare intracanaliculara;

- flora aero – anaeroba vaginala (in endometrite postabortum sau postpartum);

- inflamatia mezosalpinxului si a peritoneului ce acopera ligamentul larg: anexita.

Deoarece localizarea anatomica precisa a infectiei este greu de stabilit, se utilizeaza denumirea de boala inflamatorie pelvina (diagnostic laparoscopic)².

Diagnosticul infectiilor genitale inalte

Recoltarea produsului patologic se realizeaza prin introducerea unui cateter sau a unei sonde sterile in cavitatea uterina, la care se adapteaza o seringa sterila si se aspira lichid endometrial; apoi se ataseaza la seringa un ac steril, se protejeaza varful acului cu un tampon de vata steril, se indeparteaza bulele de aer, se obtureaza varful acului cu un dop de cauciuc si se trimite la laborator in cel mai scurt timp.

In endometritele postpartum sau postabortum se efectueaza si hemoculturi pe medii aerobe si anaerobe.

In boala inflamatorie pelvina la care se suspecteaza infectia cu C. trachomatis se poate recurge la examen serologic.

Pentru diagnosticul bacteriologic al tuberculozei genitale se recolteaza sange menstrual sau mucoasa uterina chiuretata in perioada premenstruala². In cadrul laboratoarelor Synevo nu se prelucreaza produse patologice pentru depistare BK.

Probele primite la laborator:

• se examineaza microscopic pe frotiuri colorate Gram si Giemsa;

• se insamanteaza pe medii de cultura: agar Columbia cu 5% sange de berbec (o placa pentru incubare aeroba si una pentru incubare anaeroba) si agar Mac Conkey^2,3.

Speciile bacteriene izolate se identifica pana la nivel de specie si se efectueaza antibiograma. Testarea sensibilitatii la antibiotice nu se efectueaza in cazul germenilor anaerobi³.

Bibliografie

1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Genital tract infections. In Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. Mosby, USA, 11 ed. 2002, 939-953.

2. Dumitru Buiuc. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului genital feminin. In Tratat de Microbiologie Clinica. Dumitru Buiuc, Marian Negut, Medicala, Romania,1 ed. 1999, 304-318, 672 – 675.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

Informatii generale

Uretra masculina reprezinta calea ascendenta de acces a infectiei spre tractul urinar inferior si tractul genital. Tractul genital masculin, alcatuit din prostata, canale ejaculatoare, vezicule seminale, canale deferente, epididim, testicule este, in mod normal, steril. Aceasta conditie este asigurata prin actiunea mecanica a mictiunii si ejacularii, si mai ales prin actiunea antibacteriana a unui polipeptid (care contine zinc) eliminat prin secretia prostatica².

Clasificarea infectiilor de tract genital masculin

In functie de localizare, infectiile genitale masculine se clasifica in: uretrite, prostatite, epididimite si orhite.

Uretritele

In functie de etiologie se impart in:

• uretrite gonococice – cu mai multe forme clinice: in peste 70% din cazuri au evolutie acuta, cu disurie marcata si scurgere uretrala frecvent purulenta, iar in aproximativ 5–10% din cazuri infectia evolueaza inaparent. Netratata, gonoreea se cronicizeaza si pot aparea complicatii (prin propagare canaliculara si limfatica la prostata si epididim) si sechele (stricturi uretrale). Infectia se poate generaliza pe cale sangvina si pot aparea interesari articulare (localizare metastatica)². Uretritele gonococice pot aparea si in cazul infectiilor duble (de exemplu, gonococ + C. trachomatis sau U. urealyticum), in care perioada de incubatie a celeilalte infectii este mai mare decat a celei gonococice. Pe de alta parte, pot aparea uretrite cu Cryptococcus neoformans, posibil favorizate de terapia cu tetracicline a gonoreei. Exista si cazuri de reinfectii gonococice, eventual consecutive unui esec terapeutic in cazul tulpinilor de N. gonorrhoeae secretoare de beta-lactamaza².
• uretrite non-gonococice – evolueaza cu disurie mai putin intensa si se insotesc doar in aproximativ 38% din cazuri de scurgere uretrala, care este arareori purulenta. Etiologia este dominata de C. trachomatis (50%), urmata de Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Trichomonas vaginalis, virus Herpes simplex. Bacilii Gram negativi pot fi implicati ca agenti etiologici la pacientii cu stricturi uretrale sau la cei cu fimoza. In cazuri rare sifilisul poate debuta cu sancru uretral².

Prostatite

Evolueaza cu reactie inflamatorie in secretia prostatica, bacteriurii si piurii intermitente. Apar, de obicei, pe cale ascendenta, pornind de la o uretrita.

Clasificare:

1. prostatite bacteriene:

-acute: cel mai frecvent determinate de N. gonorrhoeae;

-cronice: mai frecvent – C. trachomatis, Enterobacteriaceae, pseudomonade, enterococi; mai rar Staphylococcus saprophyticus, Trichomonas vaginalis. Pot aparea localizari metastatice in infectii sistemice (tuberculoza sau micoze – blastomicoza, coccidioidomicoza, criptococoza, histoplasmoza)

2. prostatite non-bacteriene: rar Candida spp.

Prostatodinia reprezinta un sindrom caracterizat prin simptomatologie asemanatoare prostatitei, dar fara reactie inflamatorie in secretia prostatica^1,2.

Epididimite

Apar tot ca infectii ascendente, ca urmare a unei prostatite sau uretrite. Ca factor favorizant amintim traumatismele locale (instrumentatie urologica), mai ales in conditii de bacteriurie.

Din punct de vedere etiologic se descriu:

-epididimite bacteriene nespecifice: cel mai frecvent cauzate de Enterobacteriaceae, urmate de pseudomonade si ocazional coci Gram pozitivi;

-epididimite cu transmitere sexuala: produse de C. trachomatis, N. Gonorrhoeae;

-epididimite in boli sistemice: apar rar in tuberculoza, blastomicoza.

Complicatii posibile:

-extinderea infectiei: orhiepididimita, hidrocel, infarct testicular, abcese scrotale cu posibila fistulizare;

-cronicizare;

-supuratii, ce necesita interventii chirurgicale^1,2.

Orhite determinate de:

-virusuri: virusul urlian si virusul Coxsackie B, ce infecteaza testiculele uni- sau bilateral, pe cale hematogena;

-bacterii: infectia apare prin contiguitate de la o epididimita^1,2.

Diagnosticul uretritelor

Prelevarea probei trebuie efectuata la cel putin 2 ore de la ultima mictiune cu ajutorul unui tampon steril. La pacientii cu secretie discreta se recomanda reducerea ingestiei de lichide incepand din ziua premergatoare recoltarii, iar prelevarea se efectueaza inainte de mictiunea matinala.

Cand proba nu poate fi prelevata de la nivelul meatului urinar, se recolteaza intrauretral cu tamponul sau cu ansa de platina. Examinarea necesita recoltarea a 2 tampoane (pentru microscopie si cultura). Se insereaza bland tamponul pe uretra cca 2 cm, se roteste si se retrage usor. Recoltarea celui de-al doilea tampon se va efectua prin inserarea lui mai profund decat primul cu cca 1 cm. De corectitudinea recoltarii depinde evidentierea C. trachomatis (care se multiplica intracelular) si mycoplasmelor (care adera de uroepiteliu)^2;3.

In cazul suspiciunii de infectie cu Trichomonas vaginalis recoltarea se efectueaza inainte de mictiunea matinala; tamponul se imerseaza in 1 ml solutie salina izotona incalzita la 37ºC pentru examen microscopic direct^2;3. In laboratoarele Synevo se utilizeaza mediul Vagicult.

Pentru examen microscopic colorat se efectueaza 2 frotiuri: unul colorat Gram (pentru aprecierea morfologiei si tinctorialitatii bacteriene) si cel de-al doilea colorat Giemsa (pentru aprecierea reactiei inflamatorii).

Insamantarea se realizeaza pe agar Columbia cu 5% sange de berbec, agar chocolate (ambele incubate 24 – 48 de ore, in atmosfera cu 5% CO₂) si geloza lactozata (cu incubare 24 de ore in atmosfera obisnuita) in functie de suspiciunea clinica³.

Germenii izolati se identifica pana la nivel de specie si se efectueaza antibiograma, tinand cont de corelarea culturii cu examenul microscopic.

Pentru evidentierea C. trachomatis si Mycoplasma spp. consultati capitolele respective. Mycoplasmele izolate in cantitate > de 10000 unitati au semnificatie clinica, in cantitati mai mici, se considera portaj².

Bibliografie

1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Genital tract infections. In Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. Mosby, USA, 11 ed. 2002, 939-953.

2. Dumitru Buiuc. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului genital masculin. In Tratat de Microbiologie Clinica. Dumitru Buiuc, Marian Negut, Medicala, Romania,1 ed. 1999, 295 – 304.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate, 2010. Ref Type: Catalog.

Informatii generale

Fungii sunt microorganisme eucariote, uni sau pluricelulare, heterotrofe, care contin chitina in peretele celular.

Pentru clasificarea fungilor, criteriul morfologic este cel mai cunoscut si acceptat in micologia medicala. Acesta permite impartirea fungilor in trei tipuri principale⁶:

• filamentosi – microorganisme pluricelulare, cu talul alcatuit din filamente tubulare ce pot fi septate, denumite hife;
• levuriformi – microorganisme unicelulare, de forma rotunda sau alungita ce se multiplica in principal prin burjeonare;
• dimorfici – o categorie aparte de microorganisme, care pot aparea sub 2 forme, in functie de conditiile de mediu: forma de levuri se gaseste in tesuturile organismelor parazitate sau la 37˚C in vitro, iar forma filamentoasa apare cand sunt cultivate la temperatura camerei sau la 30˚C, pe medii uzuale.

Infectiile fungice si in special cele determinate de levuri au crescut semnificativ in ultimii ani.

Semnificatia clinica a levurilor din prelevatele patologice: 

Limita dintre patogen si nepatogen poate fi este foarte greu de precizat, levuri considerate nepatogene cu 1-2 decenii in urma sunt astazi recunoscute ca agenti patogeni in cazul gazdelor imunocompromise.

Aparitia conflictului intre levuri si gazda este favorizata de o serie de factori endogeni sau exogeni, care fie induc gazdei o stare de imunosupresie, fie modifica cantitativ raportul existent intre levuri si celelalte categorii de microorganisme.

Factorii favorizanti endogeni sunt reprezentati de: varsta (nou nascuti prematuri, varsta a III-a), starile fiziologice particulare (graviditatea). Factorii favorizanti exogeni includ: corticoterapia, terapia imunosupresoare post-transplant, antibioticoterapia prelungita, intubatia endotraheala prelungita, dispozitivele protetice, radioterapia.

Levurile pot fi izolate din produsele patologice primite in laboratorul clinic in urmatoarele situatii: contaminarea probei prin manevre defectuoase in cursul prelevarii, colonizarea cu levuri a unor suprafete (tegument, mucoase) sau cavitati, infectia cu aceste microorganisme.

In cazul prelevatelor din situsuri normal sterile, prezenta levurilor indica infectie, daca s-au luat toate masurile de prevenire a contaminarii in timpul recoltarii.  In cazul probelor provenite din situsuri nesterile, cu microbiota proprie, coroborarea datelor clinice, epidemiologice si de laborator este absolut necesara pentru interpretarea semnificatiei clinice a levurilor^1;2;3.

In functie de situsul de  izolare, fungii cei mai frecvent intalniti sunt:

• Lichid cefalorahidian: Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum;.
• Sange: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida lusitanie, Candida krusei, Trichosporon spp., Coccidioides immitis, Malassezia furfur;
• Tract genitourinar: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Penicillium spp., Candida krusei, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Cladosporium spp., Aspergillus spp., Trochosporon spp., Alternaria spp.;
• Tract respirator: Candida spp., Aspergillus spp., Alternaria spp., Geotrichum candidum, Fusarium spp., Acremonium spp., Scopulariopsis spp., Trichosporon spp., Histoplasma capsulatum, Coccidioides imitis;
• Piele si fanere: Candida albicans, Acremonium spp., Alternaria spp., Aspergillus spp., Scopulariopsis spp., Geotrichum spp., Cladosporium spp.,  Trichophyton spp., Epidermophyton flocossum, Microsporum spp., Criptococcus neoformans^1;2;3;5. 

Recoltarea si transportul probelor - joaca un rol important in acuratetea diagnosticului, orice intarziere in procesarea probelor poate duce la scaderea sanselor de a  izola agentul etiologic.

Viabilitatea levurilor poate fi afectata de caldura excesiva sau de frig, fiind recomandat ca transportul probelor sa se faca la temperatura ambianta, iar procesarea lor in cel mai scurt timp (aproximativ 2 ore).

Desi aproape orice tesut sau fluid poate fi supus izolarii si identificarii fungice, cele mai importante specimene sunt reprezentate de: folicul pilos, tegument, raclat unghial, secretie genitala, exudat faringian, sputa, aspirat transtraheal si lichid pleural, tesuturi din plagi, lichid cefalorahidian, sange, urina si materii fecale^1;2;3.

Diagnostic de laborator

In cadrul laboratoarelor Synevo pentru infectiile fungice se efectueaza doua tipuri de analize: cultura si identificare fungi cu antifungigrama pentru fungi de tip levuriform si cultura si identificare fungi dermatofiti.

In cadrul examenului cultura si identificare fungi cu antifungigrama se urmareste izolarea in special a levurilor.

Diagnosticul complet consta in examen microscopic si cultura.

Examenul microscopic urmareste prezenta, forma si dimensiunile formatiunilor levurice: blastospori, pseudohife, hife, eventual artrospori. Detalii precum prezenta sau absenta capsulei, modul de inmugurire vor fi retinute ca aspecte importante pentru viitoarea identificare. La pacientii sub tratament antifungic este posibila evidentierea levurilor la examenul microscopic in absenta cresterii acestora pe mediile de cultura.

Cultivarea produselor patologice se face pe agar Sabouraud cu Chloramfenicol si Gentamicina, mediu care inhiba multiplicarea bacteriilor contaminante si permite o buna dezvoltare a levurilor.

Pe mediile de cultura levurile de interes medical se dezvolta in 48-72 de ore de incubare, in anumite suspiciuni diagnostice perioada de urmarire prelungindu-se pana la 7 zile.

Temperatura de incubare dupa insamantare este in concordanta cu zona anatomica de provenienta a probei: 36-37°C pentru prelevatele interne si profunde sau de 30°C pentru prelevatele superficiale (piele si fanere).

Dupa obtinerea primoculturii se verifica obligatoriu puritatea acesteia, deoarece contaminarea bacteriana compromite etapele ulterioare de identificare a speciei. In acest scop se efectueaza frotiuri colorate Gram care vor fi examinate la microscop cu obiectivul de imersie. In cazul prezentei bacteriilor se fac repicari in vederea purificarii culturii^1;3;5;6.

Identificarea culturilor si determinarea sensibilitatii la antifungice

Uzual, se face cu ajutorul unui sistem biochimic standardizat bazat pe fermentarea a 7 zaharuri si un test enzimatic. Cu ajutorul acestui sistem se pot identifica urmatoarele specii: Candida spp., Cryptococcus spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula.

Pentru determinarea sensibilitatii la antifungice se foloseste tot un sistem standardizat, ce permite testarea urmatoarelor antifungice: Amfotericina B, Nystatin, Flucytosine, Fluconazol, Ketoconazol, Miconazol, Econazol.

Pentru tulpinile ce nu pot fi identificate utilizand sistemul mentionat anterior, se foloseste un alt sistem biochimic bazat pe fermentarea a 13 zaharuri si 3 teste enzimatice, ce permite identificarea urmatoarelor specii: Candida spp., Cryptococcus spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Geotrichum spp., Prototheca wickerhamii.

Determinarea sensibilitatii la antifungice pentru aceste specii se face cu ajutorul unui sistem standardizat ce permite testarea la: Amfotericina B, Fluconazol, Ketoconazol, Miconazol, 5-Fluorocytosine, Itraconazol.

In cazul in care din produsele patologice se dezvolta fungi filamentosi, identificarea acestora se realizeaza pe baza aspectului macroscopic al culturii si morfologia microscopica a organelor de fructificare. Antifungigrama nu se efectueaza in cazul izolarii acestor specii de fungi⁴.

Bibliografie

1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld – Laboratory methods in basic mycology. In Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 12th ed., 2007, 629-716.

2. Deanna A. Sutton Specimen Collection, Transport and Processing: Mycology. Patrick R. Murray, Michael A. Pfaller, Robert H. Yolken, Ellen Jo Baron, James H. Iorgensen. In Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. 2007,1728-1737.

3. Koneman’s, Mycology. In Color atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 6th ed., 2006, 21: 1153-1247.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010 Ref. Type: Catalog

5. Malcolm D. Richardson & David Warnock. In Fungal infection, Diagnosis and Management, 3rd ed., 2003, 2,14-28.

6. Mihai Mares, Olimpia Bazgan, Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de fungi : Dumitru Buiuc, Marian Negut – Tratat de Microbiologie Clinica. Editia a II-a, Edit. Medicala 2008,38, 953-1030.

Uretra masculina reprezinta calea ascendenta de acces a infectiei spre tractul urinar inferior si tractul genital. Tractul genital masculin, alcatuit din prostata, canale ejaculatoare, vezicule seminale, canale deferente, epididim, testicule este, in mod normal, steril. Aceasta conditie este asigurata prin actiunea mecanica a mictiunii si ejacularii, si mai ales prin actiunea antibacteriana a unui polipeptid (care contine zinc) eliminat prin secretia prostatica².

Clasificarea infectiilor de tract genital masculin

In functie de localizare, infectiile genitale masculine se clasifica in: uretrite, prostatite, epididimite si orhite.

Uretritele

In functie de etiologie se impart in:

• uretrite gonococice – cu mai multe forme clinice: in peste 70% din cazuri au evolutie acuta, cu disurie marcata si scurgere uretrala frecvent purulenta, iar in aproximativ 5–10% din cazuri infectia evolueaza inaparent. Netratata, gonoreea se cronicizeaza si pot aparea complicatii (prin propagare canaliculara si limfatica la prostata si epididim) si sechele (stricturi uretrale). Infectia se poate generaliza pe cale sangvina si pot aparea interesari articulare (localizare metastatica)². Uretritele gonococice pot aparea si in cazul infectiilor duble (de exemplu, gonococ + C. trachomatis sau U. urealyticum), in care perioada de incubatie a celeilalte infectii este mai mare decat a celei gonococice. Pe de alta parte, pot aparea uretrite cu Cryptococcus neoformans, posibil favorizate de terapia cu tetracicline a gonoreei. Exista si cazuri de reinfectii gonococice, eventual consecutive unui esec terapeutic in cazul tulpinilor de N. gonorrhoeae secretoare de beta-lactamaza².
• uretrite non-gonococice – evolueaza cu disurie mai putin intensa si se insotesc doar in aproximativ 38% din cazuri de scurgere uretrala, care este arareori purulenta. Etiologia este dominata de C. trachomatis (50%), urmata de Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Trichomonas vaginalis, virus Herpes simplex. Bacilii Gram negativi pot fi implicati ca agenti etiologici la pacientii cu stricturi uretrale sau la cei cu fimoza. In cazuri rare sifilisul poate debuta cu sancru uretral².

Prostatite

Evolueaza cu reactie inflamatorie in secretia prostatica, bacteriurii si piurii intermitente. Apar, de obicei, pe cale ascendenta, pornind de la o uretrita.

Clasificare:

1. prostatite bacteriene:

-acute: cel mai frecvent determinate de N. gonorrhoeae;

-cronice: mai frecvent – C. trachomatis, Enterobacteriaceae, pseudomonade, enterococi; mai rar Staphylococcus saprophyticus, Trichomonas vaginalis. Pot aparea localizari metastatice in infectii sistemice (tuberculoza sau micoze – blastomicoza, coccidioidomicoza, criptococoza, histoplasmoza)

2. prostatite non-bacteriene: rar Candida spp.

Prostatodinia reprezinta un sindrom caracterizat prin simptomatologie asemanatoare prostatitei, dar fara reactie inflamatorie in secretia prostatica^1,2.

Epididimite

Apar tot ca infectii ascendente, ca urmare a unei prostatite sau uretrite. Ca factor favorizant amintim traumatismele locale (instrumentatie urologica), mai ales in conditii de bacteriurie.

Din punct de vedere etiologic se descriu:

-epididimite bacteriene nespecifice: cel mai frecvent cauzate de Enterobacteriaceae, urmate de pseudomonade si ocazional coci Gram pozitivi;

-epididimite cu transmitere sexuala: produse de C. trachomatis, N. Gonorrhoeae;

-epididimite in boli sistemice: apar rar in tuberculoza, blastomicoza.

Complicatii posibile:

-extinderea infectiei: orhiepididimita, hidrocel, infarct testicular, abcese scrotale cu posibila fistulizare;

-cronicizare;

-supuratii, ce necesita interventii chirurgicale^1,2.

Orhite determinate de:

-virusuri: virusul urlian si virusul Coxsackie B, ce infecteaza testiculele uni- sau bilateral, pe cale hematogena;

-bacterii: infectia apare prin contiguitate de la o epididimita^1,2.

Diagnosticul uretritelor

Prelevarea probei trebuie efectuata la cel putin 2 ore de la ultima mictiune cu ajutorul unui tampon steril. La pacientii cu secretie discreta se recomanda reducerea ingestiei de lichide incepand din ziua premergatoare recoltarii, iar prelevarea se efectueaza inainte de mictiunea matinala.

Cand proba nu poate fi prelevata de la nivelul meatului urinar, se recolteaza intrauretral cu tamponul sau cu ansa de platina. Examinarea necesita recoltarea a 2 tampoane (pentru microscopie si cultura). Se insereaza bland tamponul pe uretra cca 2 cm, se roteste si se retrage usor. Recoltarea celui de-al doilea tampon se va efectua prin inserarea lui mai profund decat primul cu cca 1 cm. De corectitudinea recoltarii depinde evidentierea C. trachomatis (care se multiplica intracelular) si mycoplasmelor (care adera de uroepiteliu)^2;3.

In cazul suspiciunii de infectie cu Trichomonas vaginalis recoltarea se efectueaza inainte de mictiunea matinala; tamponul se imerseaza in 1 ml solutie salina izotona incalzita la 37ºC pentru examen microscopic direct^2;3. In laboratoarele Synevo se utilizeaza mediul Vagicult.

Pentru examen microscopic colorat se efectueaza 2 frotiuri: unul colorat Gram (pentru aprecierea morfologiei si tinctorialitatii bacteriene) si cel de-al doilea colorat Giemsa (pentru aprecierea reactiei inflamatorii).

Insamantarea se realizeaza pe agar Columbia cu 5% sange de berbec, agar chocolate (ambele incubate 24 – 48 de ore, in atmosfera cu 5% CO₂) si geloza lactozata (cu incubare 24 de ore in atmosfera obisnuita) in functie de suspiciunea clinica³.

Germenii izolati se identifica pana la nivel de specie si se efectueaza antibiograma, tinand cont de corelarea culturii cu examenul microscopic.

Pentru evidentierea C. trachomatis si Mycoplasma spp. consultati capitolele respective. Mycoplasmele izolate in cantitate > de 10000 unitati au semnificatie clinica, in cantitati mai mici, se considera portaj².

Bibliografie

1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Genital tract infections. In Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. Mosby, USA, 11 ed. 2002, 939-953.

2. Dumitru Buiuc. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului genital masculin. In Tratat de Microbiologie Clinica. Dumitru Buiuc, Marian Negut, Medicala, Romania,1 ed. 1999, 295 – 304.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate, 2010. Ref Type: Catalog.

Fungii sunt microorganisme eucariote, uni sau pluricelulare, heterotrofe, care contin chitina in peretele celular.

Pentru clasificarea fungilor, criteriul morfologic este cel mai cunoscut si acceptat in micologia medicala. Acesta permite impartirea fungilor in trei tipuri principale⁶:

• filamentosi – microorganisme pluricelulare, cu talul alcatuit din filamente tubulare ce pot fi septate, denumite hife;
• levuriformi – microorganisme unicelulare, de forma rotunda sau alungita ce se multiplica in principal prin burjeonare;
• dimorfici – o categorie aparte de microorganisme, care pot aparea sub 2 forme, in functie de conditiile de mediu: forma de levuri se gaseste in tesuturile organismelor parazitate sau la 37˚C in vitro, iar forma filamentoasa apare cand sunt cultivate la temperatura camerei sau la 30˚C, pe medii uzuale.

Infectiile fungice si in special cele determinate de levuri au crescut semnificativ in ultimii ani.

Semnificatia clinica a levurilor din prelevatele patologice: 

Limita dintre patogen si nepatogen poate fi este foarte greu de precizat, levuri considerate nepatogene cu 1-2 decenii in urma sunt astazi recunoscute ca agenti patogeni in cazul gazdelor imunocompromise.

Aparitia conflictului intre levuri si gazda este favorizata de o serie de factori endogeni sau exogeni, care fie induc gazdei o stare de imunosupresie, fie modifica cantitativ raportul existent intre levuri si celelalte categorii de microorganisme.

Factorii favorizanti endogeni sunt reprezentati de: varsta (nou nascuti prematuri, varsta a III-a), starile fiziologice particulare (graviditatea). Factorii favorizanti exogeni includ: corticoterapia, terapia imunosupresoare post-transplant, antibioticoterapia prelungita, intubatia endotraheala prelungita, dispozitivele protetice, radioterapia.

Levurile pot fi izolate din produsele patologice primite in laboratorul clinic in urmatoarele situatii: contaminarea probei prin manevre defectuoase in cursul prelevarii, colonizarea cu levuri a unor suprafete (tegument, mucoase) sau cavitati, infectia cu aceste microorganisme.

In cazul prelevatelor din situsuri normal sterile, prezenta levurilor indica infectie, daca s-au luat toate masurile de prevenire a contaminarii in timpul recoltarii.  In cazul probelor provenite din situsuri nesterile, cu microbiota proprie, coroborarea datelor clinice, epidemiologice si de laborator este absolut necesara pentru interpretarea semnificatiei clinice a levurilor^1;2;3.

In functie de situsul de  izolare, fungii cei mai frecvent intalniti sunt:

• Lichid cefalorahidian: Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum;.
• Sange: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida lusitanie, Candida krusei, Trichosporon spp., Coccidioides immitis, Malassezia furfur;
• Tract genitourinar: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Penicillium spp., Candida krusei, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Cladosporium spp., Aspergillus spp., Trochosporon spp., Alternaria spp.;
• Tract respirator: Candida spp., Aspergillus spp., Alternaria spp., Geotrichum candidum, Fusarium spp., Acremonium spp., Scopulariopsis spp., Trichosporon spp., Histoplasma capsulatum, Coccidioides imitis;
• Piele si fanere: Candida albicans, Acremonium spp., Alternaria spp., Aspergillus spp., Scopulariopsis spp., Geotrichum spp., Cladosporium spp.,  Trichophyton spp., Epidermophyton flocossum, Microsporum spp., Criptococcus neoformans^1;2;3;5. 

Recoltarea si transportul probelor - joaca un rol important in acuratetea diagnosticului, orice intarziere in procesarea probelor poate duce la scaderea sanselor de a  izola agentul etiologic.

Viabilitatea levurilor poate fi afectata de caldura excesiva sau de frig, fiind recomandat ca transportul probelor sa se faca la temperatura ambianta, iar procesarea lor in cel mai scurt timp (aproximativ 2 ore).

Desi aproape orice tesut sau fluid poate fi supus izolarii si identificarii fungice, cele mai importante specimene sunt reprezentate de: folicul pilos, tegument, raclat unghial, secretie genitala, exudat faringian, sputa, aspirat transtraheal si lichid pleural, tesuturi din plagi, lichid cefalorahidian, sange, urina si materii fecale^1;2;3.

Diagnostic de laborator

In cadrul laboratoarelor Synevo pentru infectiile fungice se efectueaza doua tipuri de analize: cultura si identificare fungi cu antifungigrama pentru fungi de tip levuriform si cultura si identificare fungi dermatofiti.

In cadrul examenului cultura si identificare fungi cu antifungigrama se urmareste izolarea in special a levurilor.

Diagnosticul complet consta in examen microscopic si cultura.

Examenul microscopic urmareste prezenta, forma si dimensiunile formatiunilor levurice: blastospori, pseudohife, hife, eventual artrospori. Detalii precum prezenta sau absenta capsulei, modul de inmugurire vor fi retinute ca aspecte importante pentru viitoarea identificare. La pacientii sub tratament antifungic este posibila evidentierea levurilor la examenul microscopic in absenta cresterii acestora pe mediile de cultura.

Cultivarea produselor patologice se face pe agar Sabouraud cu Chloramfenicol si Gentamicina, mediu care inhiba multiplicarea bacteriilor contaminante si permite o buna dezvoltare a levurilor.

Pe mediile de cultura levurile de interes medical se dezvolta in 48-72 de ore de incubare, in anumite suspiciuni diagnostice perioada de urmarire prelungindu-se pana la 7 zile.

Temperatura de incubare dupa insamantare este in concordanta cu zona anatomica de provenienta a probei: 36-37°C pentru prelevatele interne si profunde sau de 30°C pentru prelevatele superficiale (piele si fanere).

Dupa obtinerea primoculturii se verifica obligatoriu puritatea acesteia, deoarece contaminarea bacteriana compromite etapele ulterioare de identificare a speciei. In acest scop se efectueaza frotiuri colorate Gram care vor fi examinate la microscop cu obiectivul de imersie. In cazul prezentei bacteriilor se fac repicari in vederea purificarii culturii^1;3;5;6.

Identificarea culturilor si determinarea sensibilitatii la antifungice

Uzual, se face cu ajutorul unui sistem biochimic standardizat bazat pe fermentarea a 7 zaharuri si un test enzimatic. Cu ajutorul acestui sistem se pot identifica urmatoarele specii: Candida spp., Cryptococcus spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula.

Pentru determinarea sensibilitatii la antifungice se foloseste tot un sistem standardizat, ce permite testarea urmatoarelor antifungice: Amfotericina B, Nystatin, Flucytosine, Fluconazol, Ketoconazol, Miconazol, Econazol.

Pentru tulpinile ce nu pot fi identificate utilizand sistemul mentionat anterior, se foloseste un alt sistem biochimic bazat pe fermentarea a 13 zaharuri si 3 teste enzimatice, ce permite identificarea urmatoarelor specii: Candida spp., Cryptococcus spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Geotrichum spp., Prototheca wickerhamii.

Determinarea sensibilitatii la antifungice pentru aceste specii se face cu ajutorul unui sistem standardizat ce permite testarea la: Amfotericina B, Fluconazol, Ketoconazol, Miconazol, 5-Fluorocytosine, Itraconazol.

In cazul in care din produsele patologice se dezvolta fungi filamentosi, identificarea acestora se realizeaza pe baza aspectului macroscopic al culturii si morfologia microscopica a organelor de fructificare. Antifungigrama nu se efectueaza in cazul izolarii acestor specii de fungi⁴.

Bibliografie

1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld – Laboratory methods in basic mycology. In Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 12th ed., 2007, 629-716.

2. Deanna A. Sutton Specimen Collection, Transport and Processing: Mycology. Patrick R. Murray, Michael A. Pfaller, Robert H. Yolken, Ellen Jo Baron, James H. Iorgensen. In Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. 2007,1728-1737.

3. Koneman’s, Mycology. In Color atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 6th ed., 2006, 21: 1153-1247.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010 Ref. Type: Catalog

5. Malcolm D. Richardson & David Warnock. In Fungal infection, Diagnosis and Management, 3rd ed., 2003, 2,14-28.

6. Mihai Mares, Olimpia Bazgan, Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de fungi : Dumitru Buiuc, Marian Negut – Tratat de Microbiologie Clinica. Editia a II-a, Edit. Medicala 2008,38, 953-1030.

Hemocultura constituie una din metodele cele mai importante si delicate pentru laboratorul de microbiologie. Sangele, fiind in mod normal steril, izolarea si identificarea unei bacterii sau a unui fung in hemocultura are o semnificatie diagnostica considerabila¹³.

Bacteriemia este prezenta in sange a bacteriilor provenite dintr-un focar septic sau de pe o mucoasa lezata. Frecvent starea bacteriemica este lipsita de expresie clinica sau se insoteste numai de frison si febra la care se pot adauga simptome si semne proprii conditiei care a determinat descarcarea bacteriemica.

Septicemia este termenul clinic prin care se defineste o bacteriemie importanta cu evolutie clinica neregulata, imprevizibila si grava, acompaniata de frisoane, febra neregulata, toxemie, hipotensiune, prostratie, eruptii cutanate polimorfe si variate, metastaze septice tisulare sau viscerale. Gravitatea sindromului septicemic lasa pe al doilea plan simptomatologia focarului infectios primar, care trebuie insa intotdeauna cautat¹.

Germeni implicati in: 

In functie de poarta de intrare:

Principiul hemoculturii

Hemocultura este un test calitativ pentru detectarea microorganismelor prezente in sange. Sangele, prelevat in conditii de stricta asepsie, este insamantat in flaconul de hemocultura a carui compozitie favorizeaza dezvoltarea germenilor aerobi, anaerobi si microaerofili¹¹.

Principalii factori de imbogatire incorporati in mediu care favorizeaza dezvoltarea germenilor sunt:

• asociere de peptone, cazeina si gelatina pentru aportul de aminoacizi;
• extract de levuri pentru aportul de vitamine;
• hemine si NAD care permit dezvoltarea Haemophilus si favorizeaza cresterea unor germeni pretentiosi nutritiv cum sunt Actinobacillus spp, Cardiobacterium spp, Eikenella spp si alti anaerobi;
• vitamina B6, element indispensabil in dezvoltarea streptococului deficient intalnit in endocardite si a stafilococului;
• CO₂ element important pentru cresterea germenilor din speciile: Neisseria, Brucella, Haemophilus, Streptococcus , Campylobacter.

Multiplicarea bacteriilor depinde insa si de o serie de factori independenti de conditiile de cultivare: densitatea germenilor in sange, stadiul lor de multiplicare,  prezenta in sange a unor substante inhibitorii.

Bacteriemiile si fungemiile adultilor evolueaza in general cu un numar redus de microorganisme circulante (intre 1-30 UFC/mL sange). La nou-nascut, sugar si copilul mic concentratia depaseste 100 UFC/mL. In general, intre gravitatea infectiei, prognostic si concentratia bacteriilor din sange exista o relatie direct proportionala³.

Bacteriile captate in flaconul de hemocultura pot fi:

• intacte, libere in plasma, in faza de multiplicare activa si vor continua sa se divida rapid in bulionul de hemocultura, sau in faza de repaus si vor incepe sa se multiplice la sfarsitul fazei de latenta corespunzatoare adaptarii la mediul nutritiv al flaconului;
• mai mult sau mai putin lezate sau mascate de actiunea sistemului anticorp-complement, antibiotice, fagocitate de polimorfonucleare sau monocite si se vor dezvolta dupa autoliza leucocitelor daca raman viabile;
• bacterii in forme L (deficiente nutritional) a caror crestere necesita un mediu adaptat (hipertonic si bogat in factori de crestere)¹².

Cresterea bacteriilor in hemocultura poate fi intarziata sau impiedicata daca nu se utilizeaza un anticoagulant in mediul de cultura, deoarece microorganismele risca sa fie capturate in cheagul de fibrina. In acelasi timp, unele  anticoagulante pot fi toxice fata de anumiti agenti patogeni la fel ca antibioticele prezente in sange. Aceste obstacole pot fi inlaturate daca se utilizeaza polyanetholsulfonat de sodiu (SPS), un anticoagulant netoxic care favorizeaza proliferarea bacteriana prin neutralizarea activitatii bactericide a serului uman si inhibarea actiunii unor antibiotice (Streptomicina, Kanamicina, Gentamicina, Polymixina B). SPS-ul poate avea rol inhibitor asupra unor suse de Peptostreptococcus, Neisseria, efect neutralizat de prezenta gelatinei in mediul de cultura.

Sunt comercializate sisteme semiautomate sau automate computerizate pentru detectia rapida a bacteriilor in hemoculturi. Principiile pe care se bazeaza aceste sisteme sunt multiple. Le mentionam doar pe cele pe care le utilizam in cadrul laboratorului Synevo: detectia directa a producerii CO₂, prin:

-scanarea seriata a esantioanelor de gaz rezultat in urma cresterii bacteriene in flaconul de hemocultura, ca in sistemul BACTEC (BACTEC 9050);

-fortarea fluidului de cultura (sub presiunea CO₂ degajat) sa treaca intr-un compartiment semnal de unde poate fi examinat microscopic si subcultivat, ca in OXOID SIGNAL SYSTEM⁹.

Recomandari pentru determinare

Se face la  indicatia  medicului in anumite situatii clinice cum sunt:

• toate cazurile cu febra de origine neprecizata, mai ales daca se acompaniaza de semne clinice evocatoare de infectie;

• sepsis, soc septic;

• pacienti cu endocardita acuta;

• sindrom sugestiv pentru infectie sistemica cu germeni specifici (febra enterica, bruceloza, leptospiroza);

• infectii localizate severe (meningite, pneumonii, supuratii intraabdominale).

Hemocultura este in plus motivata la:

• bolnavii imunodeprimati (cancer, toxicomani);

• pacientul care este supus unei agresiuni medicale (cateter, dializa sau interventii chirurgicale) si prezinta o stare febrila;

• in anumite situatii particulare (femeie insarcinata, pacient cardiac, diabetic, cu insuficienta renala, insuficienta hepatica) cand pacientul prezinta febra de origine neprecizata⁸.

Pregatirea pacientului

Prelevarea se efectueaza inainte de tratament antimicrobian, conform evolutiei predictive a curbei febrile sau in momentul in care bolnavul semnaleaza aparitia frisonului. In cazul in care acest lucru nu este posibil, sangele va fi prelevat imediat inaintea administrarii unei noi doze de antibiotic. Se indica prelevarea a trei probe intermitente in decurs de 24 de ore; in urgente ritmul este la un interval de 30-60 de minute⁶.

Specimen recoltat – sange venos, de preferinta à jeun (pe nemancate), hiperlipemia putand impiedica evidentierea unei cresteri bacteriene in mediul lichid.

Zona de electie pentru punctie este reprezentata de venele plicii cotului. Procedura de prelevare respecta normele de asepsie si antisepsie necesare pentru a evita contaminarea probei cu bacterii rezidente in flora tegumentara. Dupa recoltarea sangelui, proba de 10 mL sange, recoltata in seringa se introduce in recipientul cu mediul de cultura Signal prin inteparea capacului de cauciuc al acestuia in conditii de stricta asepsie. Flaconul se agita bland pentru omogenizarea acestuia in masa mediului. Pentru sistemul BACTEC recoltarea se face in recipientul de hemocultura pe principiul sistemelor inchise cu vid.

Proba se eticheteaza si se transporta in cel mai scurt timp de la recoltare la laborator, la temperaturi cat mai apropiate de 37ºC (cutie izoterma)⁸.

Materiale necesare – seringa sterila de 10  mL; flacon cu mediu de cultura Signal⁸; flacon cu mediul de cultura (BACTEC PLUS AEROBIC/F si PLUS ANAEROBIC/F^4;10;14 , BACTEC PÈDS PLUS™/F⁵ potrivit pentru probele pediatrice si volume mici de sange) pentru sistemul BACTEC.

Cantitate recoltata – adult:10 mL; copil:3-5 mL (Signal ) si intre 3-10 mL la adult si 1-3mL la copil (BACTEC)⁸.

Cauze de respingere a probei

• probe neetichetate;

• probe incorect recoltate (nu s-au respectat regulile de antisepsie);

• transport necorespunzator⁸.

Prelucrare necesara dupa recoltare – Sistem Signal: se ataseaza camera de expansiune livrata in acelasi kit. Se incubeaza la 37ºC. Durata incubarii la termostat si urmarirea probei este in medie de 7 zile. Se impune incubare mai prelungita la pacientii cu endocardita subacuta, la probele prelevate sub antibioticoterapie (pana la 14 zile) sau cand urmarim microorganisme exigente⁸.

Sistem BACTEC: se scaneaza codul de bare de pe flacon la cititorul de cod de bare si se introduce flaconul in pozitia indicata. Odata ce usa este inchisa, procesul incepe automat. Aparatul are o capacitate de 50 flacoane. El monitorizeaza permanent flacoanele de hemocultura incubate la 35^oC. Flacoanele sunt agitate continuu pentru a favoriza cresterea bacteriana. Flacoanele pozitive sunt semnalizate  sonor si visual. Sistemul efectueaza automat controlul de calitate la fiecare 10 minute. Softul integrat administreaza datele despre probe².

Metoda de lucru

A. Pentru kit-ul Signal-Oxoid; acesta este compus din:

a) recipient cu mediu Signal; compozitia acestui mediu permite dezvoltarea germenilor aerobi, anaerobi si microaerofili, ceea ce provoaca o crestere a presiunii detectata prin indicatorul de crestere adaptat flaconului (camera de expansiune);

b) camera de expansiune pentru mediu; in cazul multiplicarii bacteriene si cresterii presiunii, o parte din amestecul sange/bulion trece in aceasta camera si indica activitate bacteriana (hemocultura pozitiva)⁴.

Pentru urmarirea probelor se  foloseste  metoda clasica:

• Examinarea macroscopica – vizuala – de doua ori pe zi, a flacoanelor de hemocultura pentru a cauta semnele cresterii bacteriene. Este posibil ca aspectul flaconului sa orienteze asupra bacteriei in cauza, de exemplu:

a) turbiditate – bacili Gram negativi aerobi, Staphylococcus spp, Bacteroides spp;

b) hemoliza – Streptococcus spp, Staphylococcus spp, Lysteria spp, Clostridium spp, Bacillus spp;

c) producere de gaz – bacili Gram negativi aerobi si anaerobi;

d) coaguli – Staphylococcus aureus.

• Examinarea microscopica a preparatului proaspat si a frotiului colorat Gram efectuate din flaconul de hemocultura.

Mentiune: constanta agitare a recipientelor in primele 24h de incubare imbunatateste cresterea marii majoritati a bacteriilor aerobe^9;15.

Interpretarea  culturilor in sistemul Signal

Absenta cresterii – mediul din recipientul Signal ramane limpede si nu trece de mansonul verde al camerei de expansiune. In primele 6-12 ore de incubare se pot face subculturi oarbe (inocularea pe geloza chocolat in atmosfera de CO₂ la 35ºC pentru alte 48h sau in bulion thyoglicolat cu resazurina) si frotiuri care se vor colora Gram (examinare microscopica).

Recipientele cu crestere absenta vor fi reincubate si urmarite in continuare.

Hemocultura pozitiva – daca in sangele de cercetat au existat germeni care s-au multiplicat in mediul de cultura (hemocultura pozitiva), mediul va trece in camera de expansiune si se va ridica deasupra mansonului verde al acesteia.

B. Pentru sistemul BACTEC principiul de lucru este urmatorul:

Prin activitatea metabolica microorganismele din flacon elibereaza CO₂, iar flacoanele continand un marker de activare care devine fluorescent in contactul cu CO₂ detecteaza prezenta acestuia. Fotodetectorul aparatului masoara nivelul de fluorescenta si trimite datele spre computer. Masuratoarea este interpretata de sistem in functie de parametrii de pozitivitate programati in prealabil. Computerul identifica flaconul pozitiv care este semnalat auditiv si vizual prin aprinderea unui beculet. Pe ecranul de afisaj al aparatului apare pozitia grafica a flaconului detectat pozitiv.

Fiind un sistem complet automat  flacoanele sunt monitorizate la fiecare 10 minute ceea ce permite detectarea imediata a flacoanelor pozitive .

Protocolul  de monitorizare este de 7 zile – dar dezvoltarea microorganismelor poate fi detectata dupa 8 ore^2;4;10;14.

C. Hemoculturile pozitive se prelucreaza astfel:

Sistemul Signal: Se preleveaza din zona inferioara a camerei de expansiune o cantitate mica de mediu. Accesul in camera de expansiune se face prin partea superioara a acesteia, printr-o manevra sterila. Aceasta manevra nu poate contamina continutul recipientului Signal.

Sistemul BACTEC: printr-un ac atasat flaconului se preleveaza o cantitate de mediu din care se executa frotiuri si se insamanteaza pe mediile de cultura².

Mediul prelevat se foloseste pentru:

a) intindere de frotiuri pe lame de microscopie; acestea se examineaza dupa colorare Gram. In raport cu rezultatul citirilor se fac repicari.

b) repicari pe medii solide si lichide in functie de bacteria evidentiata microscopic: geloza-sange/Columbia-sange, agar-chocolat, Levine/MacConkey, Sabouraud cu Cloramfenicol,  bulion thioglycolat  cu resazurina.

c) placile se incubeaza, in functie de bacteria evidentiata microscopic, la o temperatura de 35ºC-37ºC in conditii de aerobioza, in atmosfera cu 5-7% CO₂ sau in anaerobioza (GasPack +amestec reducator) pentru 48-72 de ore. Se examineaza coloniile izolate.

d) teste necesare pentru identificare: ID catalaza, trusa de identificare stafilococ, trusa de identificare streptococ, discuri de Optochin, factori X, V si XV, medii politrope pentru enterobacterii, reactia oxidazei, teste API ( API 20E , API 20NE, API NH, etc)  teste pentru identificarea levurilor. Identificarea  se poate face si  automat pe sistemul Vitek.

e) testarea sensibilitatii la antibiotice sau antifungice prin metoda difuzimetrica sau automata pe Vitek⁹.

 D.  Eliberarea  rezultatelor

a) rezultat partial prin frotiu colorat Gram – se consemneaza si se anunta telefonic;

b) rezultat definitiv dupa izolarea, identificarea bacteriei si efectuarea antibiogramei sau antifungigramei.

Interpretarea rezultatului final se face in functie de contextul clinic si de numarul flacoanelor pozitive in raport cu cele recoltate⁹.

Hemoculturi pozitive

Se iau in considerare:

•  mai multe hemoculturi pozitive cu un germen patogen;

•   mai multe hemoculturi pozitive cu un germen obisnuit comensal intr-un anumit context clinic;

•  1 hemocultura pozitiva cu germeni patogeni cunoscuti (Salmonella spp);

• 1 hemocultura pozitiva cu germeni potential patogeni in context clinic evocator cum ar fi: Streptococcus pneumoniae in pneumopatii, enterobacterii in infectii urinare, stafilococ coagulazo-negativ in infectii de cateter.

Se exclud:

•  1 hemocultura pozitiva cu un germen comensal fara context clinic: suprainfectie cu stafilococ coagulazo-negativ, corynebacterii, streptococ non-grupabil;

•  pe un teren imunologic deprimat se iau in considerare si aceste bacterii;

•  pe un teren imunologic normal se repeta hemocultura.

Hemoculturi negative

•  recoltarea probei s-a realizat dupa antibioticoterapie;

•  recoltarea s-a realizat tardiv in cursul bolii (apar anticorpii);

•  cantitate insuficienta de sange recoltat;

•  timp de observatie prea scurt;

•  mediu de cultura gresit ales.

Hemoculturi pozitive pentru mai multe specii bacteriene

In cazul in care s-au izolat mai multe specii bacteriene intr-un singur flacon sau din flacoane diferite ale aceluiasi pacient, acestea se tin in observatie in urmatoarele situatii :

•  bolnav imuno-deprimat;

•  bolnav comatos;

•  cateter mentinut timp indelungat.

Specii bacteriene izolate in functie de perioada de crestere

•  in primele 1-2 zile cresc: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus spp, enterobacterii;

•  dupa 3 zile cresc: bacilii Gram negativi non-fermentativi, bacteriile anaerobe;

•  la 4-5 zile: Haemophilus spp si stafilococul coagulazo-negativ;

•  la 6-7 zile: speciile de Candida;

•  la 9 zile: corynebacteriile⁹.

Limite si interferente

•  tratament antimicrobian aplicat inaintea prelevarii;

•  contaminarea sangelui cu flora exogena;

•  cantitate insuficienta de sange prelevat;

•  frecventa si momentul recoltarilor gresit stabilite;

•  mediu de incubare si repicare gresit alese;

•  timp de incubare necorespunzator^1;6;12.

Bibliografie

1. Akiyama H., Kanzaki H., Tada J., Arata J. Coagulase-negative staphylococci isolated from various skin lesions. In D Dermatol, 25: 563-8. 1998. Ref Type: Journal (Full).

2. Becton Dickinson and Co., Bactec 9050. Sisteme pentru microbiologie Becton Dickinson, Sparks, Maryland 21152 USA, 1997

3. Dumitru Buiuc. Hemocultura in diagnosticul infectiei. In Tratat de Microbiologie Clinica. Dumitru Buiuc, Marian Negut, Editura Medicala, Romania, 2 ed. 2008, 165-182.

4. Goldenbaum P., Stafford E., Talbot B. Laboratory Study of the Neutralization of Antimicrobials by Resin-Containing Blood Culture Medium, Sixth European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 1993, 28-31.

5. Hardy L., Crowther L., Goldenbaum P., Beaty S.. Sixth European Congress of Clinical MIcrobiology and Infectious Diseases, 1993, 28-31.

6. Joseph M.Civetta, Robert W.Taylor, Robert R. Kirby. Critical care. In Lippincott Raven ed. 1997; 28:405-412.

7. Koontz FP., Flint KK., Reynolds JK., Allen S. Multicenter Comparison of High Volume (10ml) nr BACTEC Plus and the Standard (5ml) nr. BACTEC System. In Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 1991, 14: 111-8.

8. Kumar P.J., Clark M.L. In Clinical Medicine. Bailliere Tindall, UK, 2 ed. 1990, 710-720.

9. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

10. Levievre H., Gimenez M., Vandenesch F. and al. Multicenter Clinical Comparison of Resin-Containing Bottles with Standard Aerobic and Anaerobic Bottles for Culture of Microorganisms from Blood. In Eur.J. Clin. Microbiol. Infect.Dis., 1997, 16:669-674.

11. Loulergue J., Avril J.L., Omwanga D. Hemocultures. In Etude des produits pathologiques. Maury- Imprimeur S.A ed. 1987, 41-45.

12. Philippona A., Paul C., Nevot P. L’hemoculture. In Rev.Prat , 33:1929-38. 1983. Ref Type: Journal (Full)

13. Reimer L.G, Wilson M.L., Weinstein M.P. Update on detection of bacteriemia and fungemia. In Clin. Microbiol. Rev., 10:445-465. 1997. Ref Type: Journal (Full).

14. Rohner P., Pepey Beatrice, Auckenthaler R., Advantage of Combining Resin with Lytic BACTEC Blood Culture Media. In J. Clin. Microbiol., 1997, 35(10): 2634-8

15. Weinstein M.P. Current blood culture methods and systems: clinical concepts, technology and interpretation of results. In Clin.Infect.Dis , 23:40-46. 1996. Ref Type: Journal (Full).