Fungii sunt microorganisme eucariote, uni sau pluricelulare, heterotrofe, care contin chitina in peretele celular.

Pentru clasificarea fungilor, criteriul morfologic este cel mai cunoscut si acceptat in micologia medicala. Acesta permite impartirea fungilor in trei tipuri principale⁶:

• filamentosi – microorganisme pluricelulare, cu talul alcatuit din filamente tubulare ce pot fi septate, denumite hife;
• levuriformi – microorganisme unicelulare, de forma rotunda sau alungita ce se multiplica in principal prin burjeonare;
• dimorfici – o categorie aparte de microorganisme, care pot aparea sub 2 forme, in functie de conditiile de mediu: forma de levuri se gaseste in tesuturile organismelor parazitate sau la 37˚C in vitro, iar forma filamentoasa apare cand sunt cultivate la temperatura camerei sau la 30˚C, pe medii uzuale.

Infectiile fungice si in special cele determinate de levuri au crescut semnificativ in ultimii ani.

Semnificatia clinica a levurilor din prelevatele patologice: 

Limita dintre patogen si nepatogen poate fi este foarte greu de precizat, levuri considerate nepatogene cu 1-2 decenii in urma sunt astazi recunoscute ca agenti patogeni in cazul gazdelor imunocompromise.

Aparitia conflictului intre levuri si gazda este favorizata de o serie de factori endogeni sau exogeni, care fie induc gazdei o stare de imunosupresie, fie modifica cantitativ raportul existent intre levuri si celelalte categorii de microorganisme.

Factorii favorizanti endogeni sunt reprezentati de: varsta (nou nascuti prematuri, varsta a III-a), starile fiziologice particulare (graviditatea). Factorii favorizanti exogeni includ: corticoterapia, terapia imunosupresoare post-transplant, antibioticoterapia prelungita, intubatia endotraheala prelungita, dispozitivele protetice, radioterapia.

Levurile pot fi izolate din produsele patologice primite in laboratorul clinic in urmatoarele situatii: contaminarea probei prin manevre defectuoase in cursul prelevarii, colonizarea cu levuri a unor suprafete (tegument, mucoase) sau cavitati, infectia cu aceste microorganisme.

In cazul prelevatelor din situsuri normal sterile, prezenta levurilor indica infectie, daca s-au luat toate masurile de prevenire a contaminarii in timpul recoltarii.  In cazul probelor provenite din situsuri nesterile, cu microbiota proprie, coroborarea datelor clinice, epidemiologice si de laborator este absolut necesara pentru interpretarea semnificatiei clinice a levurilor^1;2;3.

In functie de situsul de  izolare, fungii cei mai frecvent intalniti sunt:

• Lichid cefalorahidian: Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum;.
• Sange: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida lusitanie, Candida krusei, Trichosporon spp., Coccidioides immitis, Malassezia furfur;
• Tract genitourinar: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Penicillium spp., Candida krusei, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Cladosporium spp., Aspergillus spp., Trochosporon spp., Alternaria spp.;
• Tract respirator: Candida spp., Aspergillus spp., Alternaria spp., Geotrichum candidum, Fusarium spp., Acremonium spp., Scopulariopsis spp., Trichosporon spp., Histoplasma capsulatum, Coccidioides imitis;
• Piele si fanere: Candida albicans, Acremonium spp., Alternaria spp., Aspergillus spp., Scopulariopsis spp., Geotrichum spp., Cladosporium spp.,  Trichophyton spp., Epidermophyton flocossum, Microsporum spp., Criptococcus neoformans^1;2;3;5. 

Recoltarea si transportul probelor - joaca un rol important in acuratetea diagnosticului, orice intarziere in procesarea probelor poate duce la scaderea sanselor de a  izola agentul etiologic.

Viabilitatea levurilor poate fi afectata de caldura excesiva sau de frig, fiind recomandat ca transportul probelor sa se faca la temperatura ambianta, iar procesarea lor in cel mai scurt timp (aproximativ 2 ore).

Desi aproape orice tesut sau fluid poate fi supus izolarii si identificarii fungice, cele mai importante specimene sunt reprezentate de: folicul pilos, tegument, raclat unghial, secretie genitala, exudat faringian, sputa, aspirat transtraheal si lichid pleural, tesuturi din plagi, lichid cefalorahidian, sange, urina si materii fecale^1;2;3.

Diagnostic de laborator

In cadrul laboratoarelor Synevo pentru infectiile fungice se efectueaza doua tipuri de analize: cultura si identificare fungi cu antifungigrama pentru fungi de tip levuriform si cultura si identificare fungi dermatofiti.

In cadrul examenului cultura si identificare fungi cu antifungigrama se urmareste izolarea in special a levurilor.

Diagnosticul complet consta in examen microscopic si cultura.

Examenul microscopic urmareste prezenta, forma si dimensiunile formatiunilor levurice: blastospori, pseudohife, hife, eventual artrospori. Detalii precum prezenta sau absenta capsulei, modul de inmugurire vor fi retinute ca aspecte importante pentru viitoarea identificare. La pacientii sub tratament antifungic este posibila evidentierea levurilor la examenul microscopic in absenta cresterii acestora pe mediile de cultura.

Cultivarea produselor patologice se face pe agar Sabouraud cu Chloramfenicol si Gentamicina, mediu care inhiba multiplicarea bacteriilor contaminante si permite o buna dezvoltare a levurilor.

Pe mediile de cultura levurile de interes medical se dezvolta in 48-72 de ore de incubare, in anumite suspiciuni diagnostice perioada de urmarire prelungindu-se pana la 7 zile.

Temperatura de incubare dupa insamantare este in concordanta cu zona anatomica de provenienta a probei: 36-37°C pentru prelevatele interne si profunde sau de 30°C pentru prelevatele superficiale (piele si fanere).

Dupa obtinerea primoculturii se verifica obligatoriu puritatea acesteia, deoarece contaminarea bacteriana compromite etapele ulterioare de identificare a speciei. In acest scop se efectueaza frotiuri colorate Gram care vor fi examinate la microscop cu obiectivul de imersie. In cazul prezentei bacteriilor se fac repicari in vederea purificarii culturii^1;3;5;6.

Identificarea culturilor si determinarea sensibilitatii la antifungice

Uzual, se face cu ajutorul unui sistem biochimic standardizat bazat pe fermentarea a 7 zaharuri si un test enzimatic. Cu ajutorul acestui sistem se pot identifica urmatoarele specii: Candida spp., Cryptococcus spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula.

Pentru determinarea sensibilitatii la antifungice se foloseste tot un sistem standardizat, ce permite testarea urmatoarelor antifungice: Amfotericina B, Nystatin, Flucytosine, Fluconazol, Ketoconazol, Miconazol, Econazol.

Pentru tulpinile ce nu pot fi identificate utilizand sistemul mentionat anterior, se foloseste un alt sistem biochimic bazat pe fermentarea a 13 zaharuri si 3 teste enzimatice, ce permite identificarea urmatoarelor specii: Candida spp., Cryptococcus spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Geotrichum spp., Prototheca wickerhamii.

Determinarea sensibilitatii la antifungice pentru aceste specii se face cu ajutorul unui sistem standardizat ce permite testarea la: Amfotericina B, Fluconazol, Ketoconazol, Miconazol, 5-Fluorocytosine, Itraconazol.

In cazul in care din produsele patologice se dezvolta fungi filamentosi, identificarea acestora se realizeaza pe baza aspectului macroscopic al culturii si morfologia microscopica a organelor de fructificare. Antifungigrama nu se efectueaza in cazul izolarii acestor specii de fungi⁴.

Bibliografie

1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld – Laboratory methods in basic mycology. In Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 12th ed., 2007, 629-716.

2. Deanna A. Sutton Specimen Collection, Transport and Processing: Mycology. Patrick R. Murray, Michael A. Pfaller, Robert H. Yolken, Ellen Jo Baron, James H. Iorgensen. In Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. 2007,1728-1737.

3. Koneman’s, Mycology. In Color atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 6th ed., 2006, 21: 1153-1247.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010 Ref. Type: Catalog

5. Malcolm D. Richardson & David Warnock. In Fungal infection, Diagnosis and Management, 3rd ed., 2003, 2,14-28.

6. Mihai Mares, Olimpia Bazgan, Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de fungi : Dumitru Buiuc, Marian Negut – Tratat de Microbiologie Clinica. Editia a II-a, Edit. Medicala 2008,38, 953-1030.

Dermatofitii produc infectii care afecteaza zonele superficiale ale corpului: epiderma si fanere (par, unghii).  Desi sunt considerate cel mai adesea “ boli banale’’, rata morbiditatii inalte si consecintele de ordin local si psihic pot fi foarte importante pentru pacient⁴.

Principalii agenti etiologici implicati in producerea dermatomicozelor apartin genurilor Epidermophyton, Microsporum si Tricophyton¹.

Potrivit originii lor, fungii dermatofiti sunt impartiti in 3 categorii⁴:

•    specii antropofile, care se transmit direct prin contact interuman sau indirect prin lenjerie sau obiecte contaminate;

•    specii zoofile, care se transmit la om prin contactul cu un animal infectat;

•    specii telurice, care se transmit prin contactul solului cu leziuni cutanate;

Fungii dermatofiti se individualizeaza prin cel putin doua caractere cu impact direct asupra identificarii lor in laboratorul clinic:

•  folosesc keratina ca element nutritiv (sursa de azot), ceea ce explica tropismul lor pentru epiderma, par si unghii; sunt de obicei incapabile sa penetreze tesutul subcutanat;

•  prezinta caractere morfologice particulare: hife in forma de candelabru, de coarne de cerb, uneori spiralate si macroconidii caracteristice, complet diferite de ale altor fungi².

Genul Tricophyton este capabil sa invadeze parul, epiderma si unghiile, in timp ce genul Microsporum doar parul si epiderma iar genul Epidermophyton afecteaza epiderma si unghiile. Principalele specii de dermatofiti izolate din probe clinice sunt in ordinea frecventei: Tricophyton rubrum, Tricophyton mentagrophytes, Epidermophyton flocossum, Tricophyton tonsurans, Microsporum canis si Tricophyton verrucosum¹.

Micozele cutanate sunt probabil cele mai frecvente infectii fungice la om si sunt de obicei denumite cu termenul latin tinea (“vierme inelar”). Macroscopic, leziunea are un aspect inelar, marginea sa  constituind  zona de infectie activa, progresiva; vindecarea se produce in zona centrala a inelului. Pentru a indica zona corpului afectata se folosesc de asemenea termeni latini: tinea corporis (corp), tinea cruris (zona inghinala), tinea capitis (scalp, par), tinea barbae (barba), tinea unguium (unghii)^3,4.

Deoarece tratamentul dermatomicozelor este indelungat, costisitor si cu potential toxic, este necesar ca mai intai sa se stabileasca cu certitudine diagnosticul pe baza examenului micologic. Acesta se impune cu necesitate deoarece exista numeroase afectiuni asociate cu leziuni dermatologice similare celor induse de dermatofiti:

- psoriazis;

- eczeme (vulgara, atopica sau de contact);

- intertrigouri de diverse etiologii;

- onicodistrofii in cadrul unor afectiuni: psoriazis, insuficienta venoasa cronica a membrelor inferioare, genodermatoze;

- streptococia scuamoasa a scalpului^1;2;3.

Metode de diagnostic 

• examen microscopic direct al produsului recoltat;

• cultura dermatofiti³.

Recoltarea probelor

Probele din care se solicita identificarea dermatofitilor sunt reprezentate de raclate epidermice, unghiale sau fire de par. Recoltarea probelor de la nivelul leziunilor se efectueaza prin raclarea unei portiuni de epiderma sau unghie, cat mai aproape de tesutul sanatos, cu ajutorul unui bisturiu sau lama de microscop; firele de par afectate sunt prelevate prin smulgere cu o penseta. Inainte de efectuarea examenului microscopic si a culturii probele vor fi introduse in recipiente sterile si transportate la laborator; in nici un caz nu vor fi mentinute la frigider^1;3.

Examenul microscopic

Microscopia directa examineaza scuamele sau firele de par in preparat umed montat intre lama si lamela cu solutie 20% KOH. Se lasa preparatul in repaus aproximativ 30 minute pentru dilacerare. Pentru clarificarea prelevatelor din unghii se va folosi o solutie de KOH mai concentrata (25%). Se examineaza initial cu obiectivul mic, dupa care se va folosi obiectivul mare pentru detalii morfologice. Se urmaresc:

-scuamele pentru prezenta fragmentelor de hife hialine septate, ramificate si a artroconidiilor;

-firele de par pentru a aprecia invazia ectotrix sau endotrix; marimea artroconidiilor orienteaza diagnosticul^2;3,4.

Parul infectat cu anumiti dermatofiti produce fluorescenta caracteristica la UV trecuta prin filtrul Wood, aceasta fluorescenta verde, vie, stralucitoare putand fi vizualizata doar intr-o camera obscura. Trebuie reamintit insa ca numai unii dintre dermatofitii capabili da a invada parul pot produce fenomenul fluorescentei (M. audouini, M. ferrugineum, M. canis). Deasemenea trebuie mentionat ca numai portiunile pe deplin invadate ale tijei dezvolta fluorescenta. In infectiile recente este posibil ca portiunea fluorescenta a parului sa nu fi parasit foliculul pentru a putea fi detectata. Din acest motiv simpla examinare in fluorescenta cu eliberarea unui rezultat negativ este incorecta⁴. 

Izolarea in cultura pura

Pentru insamantarea materialului patologic pe medii de cultura, perii parazitati, scuamele, materialul unghial sunt mai intai fragmentate si apoi inoculate pe suprafata mediilor in cel putin patru puncte si in doua tuburi pentru a avea suficiente sanse de a obtine o cultura pozitiva. Probele se insamanteaza pe doua medii lichide cu rol de imbogatire (Sabouraud lichid si BHI) si pe doua medii solide (Sabouraud cu Cloramfenicol + Gentamicina si Mycosel agar).

Incubarea se face la 30°C timp de 30 de zile inainte de a fi considerate negative. Majoritatea fungilor dermatofiti cresc dupa 7-14 zile de incubare.

Culturile pozitive necesita efectuarea de subculturi. Acestea ofera avantajul de a creste mult mai rapid, colonia are loc mult mai mult pentru dezvoltare si permite o apreciere a aspectului macroscopic avers/revers, necesar identificarii finale.

Diagnosticul micologic se face coreland timpul necesar dezvoltarii coloniei, aspectul macroscopic al culturii si morfologia microscopica a organelor de fructificare^3,4.

Comunicarea rezultatelor

Un examen micologic complet necesita corelarea rezultatului obtinut la examenul microscopic cu cel de la cultura dermatofiti. Este posibil ca examenul microscopic direct sa fie negativ in prezenta unei culturi pozitive, deoarece mediul de cultura favorizeaza dezvoltarea dermatofitilor.

Culturile vor fi urmarite o perioada de 30 zile pana la comunicarea unui rezultat negativ. In cazul unui rezultat pozitiv se va preciza genul caruia ii apartine dermatofitul izolat³.

Bibliografie

1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Mycology. In Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. Mosby, USA, 12 ed. 2007, 50: 629-716.

2. Dumitru Buiuc. Identificarea fungilor. In Tratat de Microbiologie Clinica. Dumitru Buiuc, Marian Negut, Ed. Medicala, Romania,1 ed. 1999, 319-337.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog

4. Violeta Cristea. Fungii dermatofiti – implicatii in patologie. In Revista Stetoscop, 2008, 80

Dermatofitii produc infectii care afecteaza zonele superficiale ale corpului: epiderma si fanere (par, unghii).  Desi sunt considerate cel mai adesea “ boli banale’’, rata morbiditatii inalte si consecintele de ordin local si psihic pot fi foarte importante pentru pacient⁴.

Principalii agenti etiologici implicati in producerea dermatomicozelor apartin genurilor Epidermophyton, Microsporum si Tricophyton¹.

Potrivit originii lor, fungii dermatofiti sunt impartiti in 3 categorii⁴:

•    specii antropofile, care se transmit direct prin contact interuman sau indirect prin lenjerie sau obiecte contaminate;

•    specii zoofile, care se transmit la om prin contactul cu un animal infectat;

•    specii telurice, care se transmit prin contactul solului cu leziuni cutanate;

Fungii dermatofiti se individualizeaza prin cel putin doua caractere cu impact direct asupra identificarii lor in laboratorul clinic:

•  folosesc keratina ca element nutritiv (sursa de azot), ceea ce explica tropismul lor pentru epiderma, par si unghii; sunt de obicei incapabile sa penetreze tesutul subcutanat;

•  prezinta caractere morfologice particulare: hife in forma de candelabru, de coarne de cerb, uneori spiralate si macroconidii caracteristice, complet diferite de ale altor fungi².

Genul Tricophyton este capabil sa invadeze parul, epiderma si unghiile, in timp ce genul Microsporum doar parul si epiderma iar genul Epidermophyton afecteaza epiderma si unghiile. Principalele specii de dermatofiti izolate din probe clinice sunt in ordinea frecventei: Tricophyton rubrum, Tricophyton mentagrophytes, Epidermophyton flocossum, Tricophyton tonsurans, Microsporum canis si Tricophyton verrucosum¹.

Micozele cutanate sunt probabil cele mai frecvente infectii fungice la om si sunt de obicei denumite cu termenul latin tinea (“vierme inelar”). Macroscopic, leziunea are un aspect inelar, marginea sa  constituind  zona de infectie activa, progresiva; vindecarea se produce in zona centrala a inelului. Pentru a indica zona corpului afectata se folosesc de asemenea termeni latini: tinea corporis (corp), tinea cruris (zona inghinala), tinea capitis (scalp, par), tinea barbae (barba), tinea unguium (unghii)^3,4.

Deoarece tratamentul dermatomicozelor este indelungat, costisitor si cu potential toxic, este necesar ca mai intai sa se stabileasca cu certitudine diagnosticul pe baza examenului micologic. Acesta se impune cu necesitate deoarece exista numeroase afectiuni asociate cu leziuni dermatologice similare celor induse de dermatofiti:

- psoriazis;

- eczeme (vulgara, atopica sau de contact);

- intertrigouri de diverse etiologii;

- onicodistrofii in cadrul unor afectiuni: psoriazis, insuficienta venoasa cronica a membrelor inferioare, genodermatoze;

- streptococia scuamoasa a scalpului^1;2;3.

Metode de diagnostic 

• examen microscopic direct al produsului recoltat;

• cultura dermatofiti³.

Recoltarea probelor

Probele din care se solicita identificarea dermatofitilor sunt reprezentate de raclate epidermice, unghiale sau fire de par. Recoltarea probelor de la nivelul leziunilor se efectueaza prin raclarea unei portiuni de epiderma sau unghie, cat mai aproape de tesutul sanatos, cu ajutorul unui bisturiu sau lama de microscop; firele de par afectate sunt prelevate prin smulgere cu o penseta. Inainte de efectuarea examenului microscopic si a culturii probele vor fi introduse in recipiente sterile si transportate la laborator; in nici un caz nu vor fi mentinute la frigider^1;3.

Examenul microscopic

Microscopia directa examineaza scuamele sau firele de par in preparat umed montat intre lama si lamela cu solutie 20% KOH. Se lasa preparatul in repaus aproximativ 30 minute pentru dilacerare. Pentru clarificarea prelevatelor din unghii se va folosi o solutie de KOH mai concentrata (25%). Se examineaza initial cu obiectivul mic, dupa care se va folosi obiectivul mare pentru detalii morfologice. Se urmaresc:

-scuamele pentru prezenta fragmentelor de hife hialine septate, ramificate si a artroconidiilor;

-firele de par pentru a aprecia invazia ectotrix sau endotrix; marimea artroconidiilor orienteaza diagnosticul^2;3,4.

Parul infectat cu anumiti dermatofiti produce fluorescenta caracteristica la UV trecuta prin filtrul Wood, aceasta fluorescenta verde, vie, stralucitoare putand fi vizualizata doar intr-o camera obscura. Trebuie reamintit insa ca numai unii dintre dermatofitii capabili da a invada parul pot produce fenomenul fluorescentei (M. audouini, M. ferrugineum, M. canis). Deasemenea trebuie mentionat ca numai portiunile pe deplin invadate ale tijei dezvolta fluorescenta. In infectiile recente este posibil ca portiunea fluorescenta a parului sa nu fi parasit foliculul pentru a putea fi detectata. Din acest motiv simpla examinare in fluorescenta cu eliberarea unui rezultat negativ este incorecta⁴. 

Izolarea in cultura pura

Pentru insamantarea materialului patologic pe medii de cultura, perii parazitati, scuamele, materialul unghial sunt mai intai fragmentate si apoi inoculate pe suprafata mediilor in cel putin patru puncte si in doua tuburi pentru a avea suficiente sanse de a obtine o cultura pozitiva. Probele se insamanteaza pe doua medii lichide cu rol de imbogatire (Sabouraud lichid si BHI) si pe doua medii solide (Sabouraud cu Cloramfenicol + Gentamicina si Mycosel agar).

Incubarea se face la 30°C timp de 30 de zile inainte de a fi considerate negative. Majoritatea fungilor dermatofiti cresc dupa 7-14 zile de incubare.

Culturile pozitive necesita efectuarea de subculturi. Acestea ofera avantajul de a creste mult mai rapid, colonia are loc mult mai mult pentru dezvoltare si permite o apreciere a aspectului macroscopic avers/revers, necesar identificarii finale.

Diagnosticul micologic se face coreland timpul necesar dezvoltarii coloniei, aspectul macroscopic al culturii si morfologia microscopica a organelor de fructificare^3,4.

Comunicarea rezultatelor

Un examen micologic complet necesita corelarea rezultatului obtinut la examenul microscopic cu cel de la cultura dermatofiti. Este posibil ca examenul microscopic direct sa fie negativ in prezenta unei culturi pozitive, deoarece mediul de cultura favorizeaza dezvoltarea dermatofitilor.

Culturile vor fi urmarite o perioada de 30 zile pana la comunicarea unui rezultat negativ. In cazul unui rezultat pozitiv se va preciza genul caruia ii apartine dermatofitul izolat³.

Bibliografie

1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Mycology. In Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. Mosby, USA, 12 ed. 2007, 50: 629-716.

2. Dumitru Buiuc. Identificarea fungilor. In Tratat de Microbiologie Clinica. Dumitru Buiuc, Marian Negut, Ed. Medicala, Romania,1 ed. 1999, 319-337.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog

4. Violeta Cristea. Fungii dermatofiti – implicatii in patologie. In Revista Stetoscop, 2008, 80