Informatii generale

Fungii sunt microorganisme eucariote, uni sau pluricelulare, heterotrofe, care contin chitina in peretele celular.

Pentru clasificarea fungilor, criteriul morfologic este cel mai cunoscut si acceptat in micologia medicala. Acesta permite impartirea fungilor in trei tipuri principale⁶:

• filamentosi – microorganisme pluricelulare, cu talul alcatuit din filamente tubulare ce pot fi septate, denumite hife;
• levuriformi – microorganisme unicelulare, de forma rotunda sau alungita ce se multiplica in principal prin burjeonare;
• dimorfici – o categorie aparte de microorganisme, care pot aparea sub 2 forme, in functie de conditiile de mediu: forma de levuri se gaseste in tesuturile organismelor parazitate sau la 37˚C in vitro, iar forma filamentoasa apare cand sunt cultivate la temperatura camerei sau la 30˚C, pe medii uzuale.

Infectiile fungice si in special cele determinate de levuri au crescut semnificativ in ultimii ani.

Semnificatia clinica a levurilor din prelevatele patologice: 

Limita dintre patogen si nepatogen poate fi este foarte greu de precizat, levuri considerate nepatogene cu 1-2 decenii in urma sunt astazi recunoscute ca agenti patogeni in cazul gazdelor imunocompromise.

Aparitia conflictului intre levuri si gazda este favorizata de o serie de factori endogeni sau exogeni, care fie induc gazdei o stare de imunosupresie, fie modifica cantitativ raportul existent intre levuri si celelalte categorii de microorganisme.

Factorii favorizanti endogeni sunt reprezentati de: varsta (nou nascuti prematuri, varsta a III-a), starile fiziologice particulare (graviditatea). Factorii favorizanti exogeni includ: corticoterapia, terapia imunosupresoare post-transplant, antibioticoterapia prelungita, intubatia endotraheala prelungita, dispozitivele protetice, radioterapia.

Levurile pot fi izolate din produsele patologice primite in laboratorul clinic in urmatoarele situatii: contaminarea probei prin manevre defectuoase in cursul prelevarii, colonizarea cu levuri a unor suprafete (tegument, mucoase) sau cavitati, infectia cu aceste microorganisme.

In cazul prelevatelor din situsuri normal sterile, prezenta levurilor indica infectie, daca s-au luat toate masurile de prevenire a contaminarii in timpul recoltarii.  In cazul probelor provenite din situsuri nesterile, cu microbiota proprie, coroborarea datelor clinice, epidemiologice si de laborator este absolut necesara pentru interpretarea semnificatiei clinice a levurilor^1;2;3.

In functie de situsul de  izolare, fungii cei mai frecvent intalniti sunt:

• Lichid cefalorahidian: Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum;.
• Sange: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida lusitanie, Candida krusei, Trichosporon spp., Coccidioides immitis, Malassezia furfur;
• Tract genitourinar: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Penicillium spp., Candida krusei, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Cladosporium spp., Aspergillus spp., Trochosporon spp., Alternaria spp.;
• Tract respirator: Candida spp., Aspergillus spp., Alternaria spp., Geotrichum candidum, Fusarium spp., Acremonium spp., Scopulariopsis spp., Trichosporon spp., Histoplasma capsulatum, Coccidioides imitis;
• Piele si fanere: Candida albicans, Acremonium spp., Alternaria spp., Aspergillus spp., Scopulariopsis spp., Geotrichum spp., Cladosporium spp.,  Trichophyton spp., Epidermophyton flocossum, Microsporum spp., Criptococcus neoformans^1;2;3;5. 

Recoltarea si transportul probelor - joaca un rol important in acuratetea diagnosticului, orice intarziere in procesarea probelor poate duce la scaderea sanselor de a  izola agentul etiologic.

Viabilitatea levurilor poate fi afectata de caldura excesiva sau de frig, fiind recomandat ca transportul probelor sa se faca la temperatura ambianta, iar procesarea lor in cel mai scurt timp (aproximativ 2 ore).

Desi aproape orice tesut sau fluid poate fi supus izolarii si identificarii fungice, cele mai importante specimene sunt reprezentate de: folicul pilos, tegument, raclat unghial, secretie genitala, exudat faringian, sputa, aspirat transtraheal si lichid pleural, tesuturi din plagi, lichid cefalorahidian, sange, urina si materii fecale^1;2;3.

Diagnostic de laborator

In cadrul laboratoarelor Synevo pentru infectiile fungice se efectueaza doua tipuri de analize: cultura si identificare fungi cu antifungigrama pentru fungi de tip levuriform si cultura si identificare fungi dermatofiti.

In cadrul examenului cultura si identificare fungi cu antifungigrama se urmareste izolarea in special a levurilor.

Diagnosticul complet consta in examen microscopic si cultura.

Examenul microscopic urmareste prezenta, forma si dimensiunile formatiunilor levurice: blastospori, pseudohife, hife, eventual artrospori. Detalii precum prezenta sau absenta capsulei, modul de inmugurire vor fi retinute ca aspecte importante pentru viitoarea identificare. La pacientii sub tratament antifungic este posibila evidentierea levurilor la examenul microscopic in absenta cresterii acestora pe mediile de cultura.

Cultivarea produselor patologice se face pe agar Sabouraud cu Chloramfenicol si Gentamicina, mediu care inhiba multiplicarea bacteriilor contaminante si permite o buna dezvoltare a levurilor.

Pe mediile de cultura levurile de interes medical se dezvolta in 48-72 de ore de incubare, in anumite suspiciuni diagnostice perioada de urmarire prelungindu-se pana la 7 zile.

Temperatura de incubare dupa insamantare este in concordanta cu zona anatomica de provenienta a probei: 36-37°C pentru prelevatele interne si profunde sau de 30°C pentru prelevatele superficiale (piele si fanere).

Dupa obtinerea primoculturii se verifica obligatoriu puritatea acesteia, deoarece contaminarea bacteriana compromite etapele ulterioare de identificare a speciei. In acest scop se efectueaza frotiuri colorate Gram care vor fi examinate la microscop cu obiectivul de imersie. In cazul prezentei bacteriilor se fac repicari in vederea purificarii culturii^1;3;5;6.

Identificarea culturilor si determinarea sensibilitatii la antifungice

Uzual, se face cu ajutorul unui sistem biochimic standardizat bazat pe fermentarea a 7 zaharuri si un test enzimatic. Cu ajutorul acestui sistem se pot identifica urmatoarele specii: Candida spp., Cryptococcus spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula.

Pentru determinarea sensibilitatii la antifungice se foloseste tot un sistem standardizat, ce permite testarea urmatoarelor antifungice: Amfotericina B, Nystatin, Flucytosine, Fluconazol, Ketoconazol, Miconazol, Econazol.

Pentru tulpinile ce nu pot fi identificate utilizand sistemul mentionat anterior, se foloseste un alt sistem biochimic bazat pe fermentarea a 13 zaharuri si 3 teste enzimatice, ce permite identificarea urmatoarelor specii: Candida spp., Cryptococcus spp., Trichosporon spp., Saccharomyces cerevisiae, Geotrichum spp., Prototheca wickerhamii.

Determinarea sensibilitatii la antifungice pentru aceste specii se face cu ajutorul unui sistem standardizat ce permite testarea la: Amfotericina B, Fluconazol, Ketoconazol, Miconazol, 5-Fluorocytosine, Itraconazol.

In cazul in care din produsele patologice se dezvolta fungi filamentosi, identificarea acestora se realizeaza pe baza aspectului macroscopic al culturii si morfologia microscopica a organelor de fructificare. Antifungigrama nu se efectueaza in cazul izolarii acestor specii de fungi⁴.

Bibliografie

1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld – Laboratory methods in basic mycology. In Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 12th ed., 2007, 629-716.

2. Deanna A. Sutton Specimen Collection, Transport and Processing: Mycology. Patrick R. Murray, Michael A. Pfaller, Robert H. Yolken, Ellen Jo Baron, James H. Iorgensen. In Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. 2007,1728-1737.

3. Koneman’s, Mycology. In Color atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 6th ed., 2006, 21: 1153-1247.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010 Ref. Type: Catalog

5. Malcolm D. Richardson & David Warnock. In Fungal infection, Diagnosis and Management, 3rd ed., 2003, 2,14-28.

6. Mihai Mares, Olimpia Bazgan, Diagnosticul de laborator al infectiilor produse de fungi : Dumitru Buiuc, Marian Negut – Tratat de Microbiologie Clinica. Editia a II-a, Edit. Medicala 2008,38, 953-1030.

Patologia infectioasa a urechii este dominata de otitele externe (infectii ale pavilionului si ale conductului auditiv extern, regiuni anatomice cu flora saprofita) si de otitele medii (infectii ale urechii medii).

Flora saprofita a urechii externe este reprezentata de microorganismele care se intalnesc pe tegument:

- specii bacteriene dominante: stafilococi coagulazo-negativi si corynebacterii;

- specii bacteriene mai rar intalnite: micrococi,  neiserii saprofite;

- genuri de fungi: Alternaria, Penicillium si Candida (non albicans)^3;5.

Otitele externe - au particularitati proprii infectiilor tegumentare, contaminarea putandu-se produce prin:

• intepari sau raniri cu diferite corpuri tari: scobitori, ace, creioane;

• erizipel determinat de Streptococcus pyogenes;

• patrunderea apei in conductul auditiv, cu macerarea consecutiva a tegumentelor de la acest nivel poate determina aparitia „otitei inotatorilor” produsa de Pseudomonas aeruginosa (la cei care inoata in apa dulce) sau de Vibrio alginolyticus (inotatorii din oceane)⁵;

• post antibioticoterapie locala indelungata pot aparea micoze auriculare determinate de Candida albicans sau  de fungi din genul Aspergillus.

Otitele medii  - au particularitati proprii anatomiei si fiziologiei locale, fiind mai frecvente la copiii in varsta de 3 luni pana la 3 ani. Urechea medie (ca si cea interna), regiune sterila din punct de vedere bacteriologic, se poate infecta fie prin invazia florei locale si de vecinatate, fie in cadrul unor boli sistemice, cu poarta de intrare respiratorie (rujeola, scarlatina)².

Un rol important in aparitia acestora il au afectiunile rinofaringelui care, prin congestia si edemul trompei lui Eustachio, blocheaza drenajul normal al cavitatii si eliminarea contaminantilor ocazionali proveniti din microbiota locala³.

• la copii, amigdalitele si faringitele determina aparitia otitelor medii prin propagarea inflamatiei si infectiei, care este favorizata de beanta si pozitia orizontala a trompei la aceasta varsta.

• vegetatiile adenoidiene determina aparitia otitelor atat pe cale mecanica, prin volumul lor, cat si pe cale inflamatorie, prin infectiile pe care le intretin.

Principalii agenti etiologici implicati in otitele medii sunt: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae si Moraxella catarrhalis⁵.

In otitele cronice, externe si medii, predomina germenii anaerobi: Peptostreptococcus spp., Bacteroides fragilis, Prevotella melaninogenica, Porphyromonas, frecvent insotiti de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa sau alti bacili Gram negativi^1;5.

Recoltarea si transportul probelor

In otitele externe produsul patologic este reprezentat de exsudatul leziunii tegumentare a pavilionului sau a conductului auditiv extern. Spre deosebire de acesta, prelevatul de electie pentru examenul bacteriologic al otitelor medii il reprezinta exsudatul aspirat prin timpanocenteza. In caz de perforare spontana a timpanului prelevatul se recolteaza pe un fin tampon steril^3;4;5.

Se recomanda recoltarea produsului patologic pe 2 tampoane:

• un tampon simplu din care se vor efectua doua frotiuri pentru examenul microscopic
• un tampon prevazut cu mediu de transport pentru efectuarea culturii.

In  spitale se poate recurge la insamantarea extemporanee cu lanteta de punctie, direct pe mediile de cultura.

Indiferent de modalitatea de prelevare, produsul patologic este imersat in mediu de transport si trimis imediat la laborator. Transportul probelor catre laborator se face in maximum 2 ore de la prelevare. Desi probele prelevate pe tampoane in tuburi ce contin mediu de transport pot fi pastrate pana la 24 h, este recomandat ca insamantarile pe mediile de cultura sa se faca imediat ce probele ajung la laborator, pentru o mai sigura recuperare a microorganismelor urmarite⁴.

Diagnostic de laborator

Examenul microscopic: se efectueaza doua frotiuri, unul cu coloratie Gram pentru determinarea morfologiei germenilor si unul cu coloratie Giemsa, pentru aprecierea reactiei inflamatorii^3;5.

Insamantarea pe medii de cultura: agar Columbia cu 5% sange de berbec, agar chocolate, agar Mac Conkey ⁵.

Insamantarea se face cu dispersie, pentru a permite o apreciere semicantitativa a cresterii. Se incubeaza aerob in atmosfera cu 5% CO₂, 24 h la 37°C, cu prelungire pana la 48 h daca la prima citire a placilor nu se observa coloniile caracteristice germenului urmarit. Coloniile caracteristice se repica in vederea obtinerii culturii pure pentru identificare si antibiograma⁴.

Medicul clinician poate orienta investigatiile suplimentar catre cultura de fungi si/sau cultura anaeroba, in functie de contextul clinic. In cazul germenilor anaerobi, rapiditatea prelevarii si transportul in conditii optime sunt esentiale in izolarea acestora.

Comunicarea si interpretarea rezultatelor- se face corelat cu examenul microscopic direct. 

In cazul otitelor externe microscopia este ingreunata din cauza numerosilor germeni contaminanti prezenti la nivelul leziunii tegumentare. Coexistenta pe frotiu a reactiei inflamatorii cu prezenta germenilor (in special intraleucocitari) ghideaza microbiologul spre germenul patogen.

In cazul otitelor interne la care produsul patologic a fost recoltat prin timpanocenteza culturile sunt, de obicei, monobacteriene, iar identificarea germenilor in vederea obtinerii antibiogramei este mult usurata.

Criterii pentru efectuarea antibiogramei

Necesitatea izolarii in cultura pura, urmata de identificarea la nivel de specie si efectuarea antibiogramei este impusa de cresterea, in ultima vreme, a numarului agentilor microbieni producatori de betalactamaza.

Tratamentul ghidat conform antibiogramei este un tratament tintit si in acelasi timp are avantajul de a nu determina rezistenta la antibiotice.

Mentiune: In laboratorul Synevo Bucuresti este disponibil, pentru cazurile de urgenta, un sistem automat de identificare bacteriana si de efectuare a antibiogramei, cu eliberarea rezultatului in 24 ore de la izolarea germenului in cultura pura⁴.

Bibliografie

1. Betty A.Forbes, Daniel F.Sahm, Alice S.Weissfeld. Infections of the Eyes, Ears, and Sinuses. In Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. Mosby, USA, 12th ed. 2007; 56: 832-841.

2. Dumitru Buiuc. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului respirator superior si cavitatilor conecte. In Tratat de Microbiologie Clinica. Dumitru Buiuc, Marian Negut, Editura Medicala, Romania, Editia a II-a. 2008; 12: 208-223.

3. J.Michael Miller, Harvey T.Holmes, Karen Krisher. General principles of Specimen Collection and Handling. In Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray, Ellen Jo Baron, James H. Jorgensen, Michael A.Pfaller, Robert H. Yolken, ASM PRESS, USA, 9th ed. 2007; 20: 291-333.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog

5. Lynne S. Garcia. Otitis Cultures. In Clinical Microbiology Procedures Handbook, American Society for Microbiology, 2007; 3.11.5.

Rinita este cauzata cel mai adesea de virusuri (rhinovirusuri, adenovirusuri, virusuri gripale, paragripale, Coxsackie A) si rareori de bacterii.

Exista microorganisme patogene care se gasesc la nivelul narinelor atat in stare de boala cat si in starea de purtator sanatos.

Examenul microbiologic al exsudatului nazofaringian este indicat pentru depistarea portajului de germeni patogeni in caile respiratorii superioare, depistare solicitata si indicata in scopuri epidemiologice (e.g., stabilirea sursei de infectie, carantinarea purtatorilor sanatosi, evaluarea lucratorilor din industria alimentara)^1;2;4;7.

Astfel, informatiile privind diagnosticul clinic si suspiciunea asupra florei implicate in infectie sunt utile personalului din laborator in alegerea mediilor de cultura folosite^3;4.

• Staphylococcus aureus – rata portajului nazal este de cca. 30% in colectivitatea generala, ajungand la 70% la personalul medical. In focarul epidemic prelevarea tamponului nazal trebuie repetata de 1-2 ori la interval de o saptamana pentru a diferentia portajul de durata de cel tranzitor².

• Streptococcus pyogenes – purtatorii nazali au potential epidemic mai mare decat cei faringieni².

• Streptococcus pneumoniae – rata portajului este de 40-60% din populatia generala^2;4.

• Haemophilus influenzae – la 25-80% dintre persoanele sanatoase se evidentiaza tulpini necapsulate, la 5-10% tulpini capsulate si la 1- 5% tulpini de tip b⁵.

• Moraxella catarrhalis – datorita colonizarii tractului respirator superior poate determina otita medie sau sinuzita prin contiguitate; rata portajului este variabila, fiind influentata atat de factorii de mediu cat si genetici⁷.

• Klebsiella rhinoscleromatis – determina aparitia rhinoscleromului, forma rara de infectie granulomatoasa cronica a submucoasei nasului si sinusurilor, faringelui si laringelui, rar a traheei^2;5.

• Klebsiella ozenae – poate fi izolata si ea de la nivelul tractului respirator superior. Este agentul etiologic al ozenei, afectiune cronica, caracterizata prin atrofia mucoasei nazale, abundenta secretie mucopurulenta, adesea cu miros fetid^2;5.

O serie de factori ce determina scaderea rezistentei atat locale (mucoasa nazala), cat si generale a organismului (infectii virale ce determina acumulari anormale de mucus si lezarea epiteliului respirator, alcoolismul, circulatia sangvina pulmonara anormala, malnutritia si toate afectiunile ce contribuie la scaderea importanta a imunitatii) favorizeaza infectia locala cu microorganismele amintite anterior si propagarea acesteia pe cale limfatica, cu dezvoltarea unor afectiuni grave: otita, meningita, pneumonie, endocardita, artrita septica⁷.

Recoltarea si transportul probelor

Produsul patologic de la acest nivel este usor de obtinut (metoda neinvaziva) dar are dezavantajul de a fi contaminat cu microbiota saprofita rezidenta.

Tehnica de recoltare

- se aseaza pacientul pe scaun cu fata spre sursa de lumina, gatul in usoara extensie si ceafa sprijinita de spatar sau perete;

- se introduce bland tamponul printr-o nara de-a lungul planseului nazal, pana atinge peretele posterior al nazofaringelui;

- se lasa tamponul pe loc cateva secunde, apoi se roteste usor si se retrage;

- se introduce tamponul in tubul protector prevazut cu mediu de transport (Amies sau Stuart), se eticheteaza si se trimite la laborator.

Recoltarea exsudatului nazofaringian in contextul suspiciunii de sinuzita nu este recomandata, in aceasta afectiune produsul patologic de electie fiind punctia sinusala⁴.

Se recomanda recoltarea produsului patologic pe 2 tampoane:

• un tampon simplu din care se va efectua extemporaneu un frotiu ce va fi colorat Giemsa pentru diagnosticul rinitei alergice.
• un tampon prevazut cu mediu de transport pentru efectuarea culturii.

Transportul probelor catre laborator se face in maximum 2 ore de la prelevare. Desi probele prelevate pe tampoane in tuburi ce contin mediu de transport pot fi pastrate pana la 24 h, este recomandat ca insamantarile pe mediile de cultura sa se faca imediat ce probele ajung la laborator, pentru o mai sigura recuperare a microorganismelor urmarite³.^.

Diagnostic de laborator

Proba se insamanteaza pe mediu agar Columbia cu 5% sange de berbec si, la cerere (cand medicul clinician solicita si flora) pe agar Chocolate; se incubeaza aerob in atmosfera cu 5% CO₂, 24 h la 37°C, cu prelungire pana la 48 h daca la prima citire a placilor nu se observa coloniile caracteristice germenului urmarit. Coloniile caracteristice se repica in vederea obtinerii culturii pure pentru identificare si antibiograma.

Examenul microscopic pentru diagnosticul rinitei alergice – se numara polimorfonuclearele eozinofile si se raporteaza procentual la 100 de elemente albe³.

Comunicarea si interpretarea rezultatelor

In laboratoarele Synevo se comunica prezenta urmatorilor germeni in exsudatul faringian:

• Staphylococcus aureus – portaj, cu recomandarea tratamentului local in functie de contextul clinico-epidemiologic;

• Streptococcus pyogenes – in orice cantitate;

• Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis – in functie de varsta pacientului;

• Moraxella catarrhalis – se efectueaza doar identificarea, antibiograma nefiind standardizata;

• Klebsiella rhinoscleromatis si Klebsiella ozenae – doar la cererea medicului clinician.

Bibliografie

1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld. Upper respiratory tract infections and other infections of the oral cavity and neck . In Diagnostic Microbiology, 12th ed, 2007, 54: 814–821.

2. Dumitru Buiuc. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului respirator superior si cavitatilor conecte. Dumitru Buiuc, Marian Negut in Tratat de Microbiologie Clinica, Edit. Medicala 2008, 12: 208–224.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2006. Ref Type: Catalog.

4. Lynne S. Garcia. Guidelines for Performance of Respiratory Tract Cultures. In Clinical Microbiology Procedures Handbook, American Society for Microbiology, 2007; 3.11.1.

5. Olga-Mihaela Dorobat. Familia Enterobacteriaceae. In Bacteriologie Medicala. Universitatea “Titu Maiorescu”, Romania ed. 2006; 17:276.

6. Olga Mihaela Dorobat. Bacteriologie Medicala, 2006, 12: 189, 19: 300- 303.

7. Richard B. Thomson, Jr. Specimen collection, transport and processing: Bacteriology. In: Patrick R. Murray et al. – “Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. , 2007 , 20: 291-333.

Angina Vincent este o infectie acuta necrotizanta a faringelui determinata de o combinatie de bacili fusiformi (Fusiformis fusiformis – bacil Gram negativ) si spirochete (Borrelia vincentii). Aceleasi microorganisme sunt implicate si in producerea gingivostomatitei.

Tabloul clinic include odinofagie unilaterala care creste in intensitate in decurs de cateva zile si poate fi asociata cu otalgie de aceeasi parte. Pacientul prezinta de obicei o halena fetida.

La examenul faringelui se constata prezenta unei ulceratii amigadaliene bine circumscrise a carei baza este cenusie si sangereaza rapid la atingere. Se poate asocia de asemenea si o limfadenopatie submandibulara.

Diagnosticul de angina Vincent se stabileste pe baza examenului frotiului efectuat din exsudatul faringian si colorat Gram care pune in evidenta prezenta bacililor Gram negativi fusiformi si a spirochetelor, in contextul unei reactii inflamatorii^1;2.

Recoltarea probei

- se aseaza pacientul pe scaun cu fata spre sursa de lumina, gatul in usoara extensie si ceafa sprijinita de spatar;

- se deprima baza limbii cu apasatorul si se preleva un tampon simplu, de la nivelul zonei ulcerate, din care se vor efectua extemporaneu doua frotiuri pentru examenul microscopic, in vederea diagnosticarii anginei Vincent.

Metoda – examen microscopic³.

Valori de referinta – absenti fusospirili pe lamele examinate³.

Bibliografie

1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld. Upper respiratory tract infections and other infections of the oral cavity and neck . In Diagnostic Microbiology, eleventh ed., 2002, 57: 900–902.

2. Dumitru Buiuc. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului respiratir superior si cavitatilor conecte. Dumitru Buiuc, Marian Negut . InTratat de Microbiologie Clinica, Edit. Medicala 1999, 12: 214–225.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

Tractul respirator superior cuprinde fosele nazale, nazofaringele (cu cavitatile conecte: sinusurile paranazale si urechea medie), orofaringele si laringofaringele. Datorita lipsei barierelor anatomice distincte intre segmentele cailor respiratorii superioare, infectia se poate propaga prin continuitate, cu frecvente complicatii prin afectarea urechii medii, a laringelui si chiar a cailor respiratorii inferioare^1;2;6.

Faringitele si tonsilitele sunt cele mai frecvente afectiuni ale tractului respirator superior pentru care pacientul se adreseaza medicului si implicit laboratorului.

In diagnosticul microbiologic, laboratorul trebuie sa aiba in vedere flora bacteriana care exista in mod normal in anumite situsuri anatomice. Aceasta flora normala, care se afla intr-o relatie de simbioza cu gazda, joaca un rol important in protectia acesteia fata de microorganismele patogene, putand preveni proliferarea si invazia acestora prin diferite mecanisme¹. Etajul supraglotic al tractului respirator gazduieste o flora bacteriana ce cuprinde peste 200 specii repartizate la nivelul crevaselor gingivale, placii dentare, mucoasei jugale si linguale, oro-faringelui, criptelor amigdaliene si nazofaringelui, bacteriile anaerobe dominandu-le pe cele aerobe in proportie de 5-10:1².

Etiologia faringitelor

Infectiile virale 

• Aproximativ 70% din faringite sunt de etiologie virala: rhinovirusuri, adenovirusuri, virusuri gripale, paragripale, Coxsackie A, virusul Epstein-Barr care determina mononucleoza infectioasa caracterizata prin angina severa, frecvent ulcerata, adenita cervicala si semne de afectare sistemica^1;2;6.

• Au evolutie auto-limitanta dar, prin lezarea epiteliului respirator si obturarea congestiva a orificiilor sinuzale sau a trompei lui Eustachio, favorizeaza suprainfectia cu bacterii din microbiota indigena.

Infectiile bacteriene

• Cel mai frecvent implicat este Streptococcus pyogenes (Streptococ β hemolitic grup A, PYR pozitiv). Streptococcus pyogenes  este unul dintre patogenii umani importanti, singurul rezervor cunoscut in natura fiind reprezentat de pielea si mucoasele umane; imprima gravitate faringitelor prin complicatiile infectioase (sinuzite, otite medii, mastoidite, adenite cervicale supurate, abces amigdalian, flegmon amigdalian, celulita difuza a planseului bucal – angina Ludwig) si post infectioase (reumatism articular acut, glomerulonefrita acuta, cardita reumatismala). Prezenta antigenelor Lancefield de grup A nu este specifica pentru Streptococcus pyogenes, acestea putand fi prezente si in cadrul grupului anginosus, din care fac parte Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus si Streptococcus intermedius. Testul PYR diferentiaza Streptococcus pyogenes care este responsabil de majoritatea faringitelor bacteriene de grupul anginosus care face parte din microbiota faringiana normala^1;4;5.

 Faringitele cu tulpini eritrotoxigene de Streptococcus pyogenes se insotesc de scarlatina^1;2.

• Abcesul periamigdalian apare mai frecvent la copiii peste 5 ani si adultii tineri, putand deveni o infectie grava prin afectarea tesuturilor adiacente, ca si prin erodarea arterei carotide. Organismele implicate sunt in principal: Streptococcus pyogenes, Arcanobacterium haemolyticum, Staphylococcus aureus, anaerobii (e.g. Fusobacterium spp.si Bacteroides)^1;2.

• Streptococii β hemolitici grup C si G pot determina faringite a caror evolutie poate fi grava.

• Arcanobacterium haemolyticum – poate cauza, mai frecvent la adultii tineri, faringita si abces periamigdalian. Faringitele, asemanatoare celor streptococice, se insotesc de eruptie scarlatiniforma si/sau adenita cervicala la circa 50% din pacienti. Intrucat face parte din flora comensala, doar cresterea predominanta in placa de izolare are semnificatie clinica^2;5.

• Chlamydia pneumoniae – cauza frecventa a faringitelor².

• Mycoplasma pneumoniae – determina pana la 10% din faringitele scolarilor².

• Neisseria gonorrhoeae – faringita gonococica apare dupa raporturi sexuale aberante si evolueaza benign. Investigatia de laborator se face doar la cerere expresa. Microscopia nu are valoare datorita numeroaselor neisserii nepretentioase din microbiota orofaringiana².

• Corynebacterium diphteriae – determina faringita sau angina pseudomembranoasa grava, insotita de toxemie. Complicatiile cele mai de temut sunt cele ce implica sistemul nervos central (orbire, coma).

• Asocierea fuso-spirochetozica – infectie mixta cu bacterii anaerobe (Fusobacterium spp) si spirochete, determina stomatita si angina Vincent. Infectia, relativ rara astazi, se caracterizeaza prin leziuni ulcero-necrotice care pot fi acoperite de false membrane. Afecteaza mai frecvent adultii decat copiii, in special pe cei cu igiena orala deficitara si deficite locale sau sistemice ale apararii antiinfectioase^1;2.

• Haemophilus influenzae (doar serotipul b are implicatii in patologie), Streptococcus pneumoniae si Staphylococcus aureus sunt microorganisme care, desi frecvent izolate din exsudatul faringian si secretia nazala, nu au fost confirmate ca fiind implicate in etiologia faringitelor. Statusul de purtator pentru unul dintre aceste microorganisme, ca si pentru Neisseria meningitidis poate avea semnificatie clinica pentru anumiti pacienti sau contactii lor^1;2.

• Cresterea predominanta si in cantitate mare in cultura a bacililor Gram negativ, a pseudomonadelor si a levurilor (Candida albicans – levura din microbiota orofaringiana) poate avea semnificatie clinica la nou nascuti, in cazul prematurilor, a pacientilor spitalizati pentru boli grave, imunodeprimati sau a celor ce au urmat tratament antimicrobian care a indus disbioze importante². De aici importanta stabilirii unei bune comunicari intre medicul clinician si medicul de laborator in vederea cunoasterii contextului clinic al pacientului.

Un caz particular de infectie faringiana apare la copiii cu fibroza chistica, afectiune ce trebuie mentionata in cererea trimisa laboratorului de catre medicul clinician. Unul din produsele patologice acceptate in acest caz este exsudatul faringian profund, laboratorul comunicand prezenta in orice cantitate a urmatorilor germeni: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa si Burkholderia cepacia⁴.

Recoltarea si transportul probelor

Exsudatul faringian se preleva inainte sau dupa 4 ore de la toaleta cavitatii bucale sau ingestia de alimente sau lichide.

Tehnica de recoltare

- Se aseaza pacientul pe scaun cu fata spre sursa de lumina, gatul in usoara extensie si ceafa sprijinita de spatar sau perete.

- Se deprima baza limbii cu apasatorul si, in timp ce pacientul pronunta vocala “a”, se sterg ferm cu tamponul amigdalele si peretele posterior al faringelui, insistand asupra zonelor inflamate, ulcerate sau cu depozite purulente; daca exista false membrane, acestea se desprind usor, tamponandu-se mucoasa subiacenta; atat la introducerea cat si la scoaterea tamponului, se evita atingerea bazei limbii si a palatului moale.

- Se introduce tamponul in tubul protector simplu sau prevazut cu mediu de transport (Amies sau Stuart), care se eticheteaza corespunzator.

- Se preleva:

• un tampon simplu fara mediu de transport, din care se va efectua testul rapid pentru detectarea antigenului streptococic de grup A;
• un tampon simplu, de la nivelul zonei ulcerate, din care se vor efectua extemporaneu doua frotiuri pentru examenul microscopic, in vederea diagnosticarii anginei Vincent;
• un tampon prevazut cu mediu de transport pentru efectuarea culturii.

Transportul probelor catre laborator se face in maximum 2 ore de la prelevare. Desi probele prelevate pe tampoane in tuburi ce contin mediu de transport pot fi pastrate pana la 24 ore, este recomandat ca insamantarile pe mediile de cultura sa se faca imediat ce probele ajung la laborator, pentru o mai sigura recuperare a microorganismelor urmarite.

Diagnosticul de laborator

• Se insamanteaza proba pe agar Columbia cu 5% sange de berbec si, la cerere, cand medicul clinician solicita si flora, pe agar Chocolate.

• Se incubeaza aerob  in atmosfera cu 5% CO₂, 24 h la 37°C, cu prelungire pana la 48 h daca la prima citire a placilor nu se observa coloniile caracteristice germenului urmarit.

• Coloniile caracteristice se repica in vederea obtinerii culturii pure pentru identificare.

Dupa obtinerea unui rezultat pozitiv la latexaglutinare pentru grupul A Lancefield, se efectueaza testul imuncromatografic PYR, care permite diferentierea intre Streptococcus pyogenes (PYR pozitiv) si ceilalti streptococi beta hemolitici (PYR negativ)³.

• Metoda directa, rapida pentru detectarea antigenului Streptococ betahemolitic de grup A este latexaglutinarea, cu o sensibilitate ce variaza intre 80-95% si o specificitate de 98%. Obtinerea unui rezultat pozitiv permite initierea prompta a  terapiei; un rezultat negativ impune, insa, efectuarea culturii.

• Examenul microscopic colorat Gram din probele de exsudat faringian nu este recomandat deoarece nu se poate face o diferentiere intre patogenii suspectati si flora normala de la acest nivel. Exceptie fac urmatoarele situatii:

• corelarea rezultatelor microscopiei cu izolarea predominanta si in cantitate mare in cultura a unei specii de Candida (albicans sau tropicalis)²;
• diagnosticul anginei fuso-spirochetozice – examinarea microscopica a frotiului colorat Gram, urmarind prezenta bacililor Gram negativi fusiformi si a spirochetelor, in contextul unei reactii inflamatorii^1;2;
• diagnosticul anginei difterice – frotiu efectuat extemporaneu ce trebuie trimis la laborator impreuna cu tampoanele si biletul de trimitere care are  obligatoriu notata suspiciunea clinica.

Criterii pentru efectuarea antibiogramei

Intrucat Streptococul β hemolitic si-a pastrat sensibilitatea naturala la Penicilina, antibiograma se efectueaza doar la cererea medicului sau in cazul  alergiei la Penicilina.

Daca in cultura Streptococul β hemolitic se asociaza cu Staphylococcus aureus, se va mentiona in buletinul de rezultate aceasta asociere, iar tratamentul pentru Streptococ nu se va efectua cu Penicilina, deoarece majoritatea tulpinilor de Stafilococ sunt secretoare de penicilinaza³.

Interpretarea rezultatelor

Uzual, in laboratoarele Synevo se comunica:

–Streptococi  β hemolitici;

–Staphylococcus aureus doar in asociere cu un Streptococ β hemolitic;

–Arcanobacterium haemolyticum;

–Neisseria gonorrhoeae³.

Bibliografie

1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld. Upper respiratory tract infections and other infections of the oral cavity and neck . In Diagnostic Microbiology, Twelfth Edition, 2007, 54: 814–821.

2. Dumitru Buiuc, Marian Negut. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului respirator superior si cavitatilor conecte. InTratat de Microbiologie Clinica, Edit. Medicala 2008, 12: 208–224.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

4. Lynne S. Garcia. Guidelines for Performance of Respiratory Tract Cultures. In Clinical Microbiology Procedures Handbook, American Society for Microbiology, 2007; 3.11.3.

5. Olga Mihaela Dorobat. Bacteriologie Medicala, 2006, 12: 189, 19: 300- 303.

6. Richard B. Thomson, Jr. Specimen collection, transport and processing: Bacteriology. In: Patrick R. Murray et al. – “Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. 2007 , 20: 291-333.

Faringita  bacteriana reprezinta 5-10% din totalul faringitelor, in comparatie cu faringita virala al carui procent este de 30-60%. Cel mai frecvent agent etiologic al faringitei bacteriene este streptococul beta-hemolitic grup A; microorganismul se transmite prin contact direct intre persoane, prin intermediul picaturilor Pflϋge sau al secretiilor nazale, de aceea riscul de imbolnavire este mai mare in colectivitati si familie. Perioada de incubatie a bolii variaza intre doua pana la cinci zile^1;2;5.

Testul de depistare rapida a antigenului Streptococului betahemolitic grup A este utilizat frecvent in practica clinica, in special in pediatrie, pentru identificarea germenului in faringite acute si inceperea prompta a tratamentului antibiotic, inainte de a astepta rezultatele culturii care devin disponibile in 24-48 ore. Sensibilitatea testului variaza intre 80-95% iar specificitatea acestuia este de 98%. Obtinerea unui rezultat pozitiv permite initierea prompta a  terapiei; un rezultat negativ impune insa, in prezenta simptomelor clinice, efectuarea culturii^1;2;4.

Testul mai poate fi folosit si la pacientii asimptomatici pentru depistarea starii de purtator; in acestii situatii s-a demonstrat ca aceasta investigatie are o valoare predictiva negativa foarte buna in comparatie cu cea a rezultatelor furnizate de cultura. Acest lucru se datoreaza faptului ca in cazul unei colonizari bacteriene a faringelui incarcatura bacteriana este mica, iar culturile pot fi negative datorita inhibarii germenilor de catre flora bacteriana normala⁴.

Recoltarea probei

- se aseaza pacientul pe scaun cu fata spre sursa de lumina, gatul in usoara extensie si ceafa sprijinita de spatar;

- se deprima baza limbii cu apasatorul si, in timp ce pacientul pronunta vocala “a”, se sterg ferm cu tamponul amigdalele si peretele posterior al faringelui, insistand asupra zonelor inflamate, ulcerate sau cu depozite purulente; daca exista false membrane, acestea se desprind usor, tamponandu-se mucoasa subiacenta; atat la introducerea cat si la scoaterea tamponului, se evita atingerea bazei limbii si a palatului moale.

- se introduce tamponul in tubul protector simplu fara mediu de transport, care se eticheteaza corespunzator³.

Metoda – imunocromatografica³.

Valori de referinta - Antigen streptococ betahemolitic grup A negativ³.

Bibliografie

1. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld. Upper respiratory tract infections and other infections of the oral cavity and neck . In Diagnostic Microbiology, eleventh ed., 2002, 57: 900–902.

2. Dumitru Buiuc. Diagnosticul de laborator al infectiilor tractusului respiratir superior si cavitatilor conecte. Dumitru Buiuc, Marian Negut . InTratat de Microbiologie Clinica, Edit. Medicala 1999, 12: 214–225.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

4. N. Mustafa, H.Nsanze, et.al. Group A streptococcal antigen detection in schoolchildren. In Eastern Mediterranean Health Journal ., vol.4, 1998, 260-264.

5. Weber DJ, Rutala WA, Denny FW. Management of healthcare workers with pharyngitis or suspected streptococcal infections. In Infect Control Hosp Epidemiol 1996;17:753-61.