Neutrofilele detin un rol important in raspunsul imun nespecific, in special in rezistenta antibacteriana,  ca celule efectoare, inductoare si reglatoare. Printre caracteristicile lor esentiale se numara:

• marginatia si aderarea la celulele endoteliului vascular;

• traversarea peretelui vascular (diapedeza) si migrarea catre focarele de inflamatie;

• recunoasterea si fagocitarea moleculelor opsonizate;

• degradarea si distrugerea acestor molecule prin generarea de radicali toxici de oxigen.

Aceste caracteristici sunt facilitate de prezenta de receptori aflati la suprafata si in interiorul celulelor, cum ar fi receptorii pentru citokine, neuromediatori, autacoizi si hormoni.

Chemotactismul neutrofilelor se produce ca raspuns la factorii chemotactici (chemotaxine) generati la nivelul focarului lezional. Mai mult, chemotaxinele intensifica metabolismul neutrofilelor, agregarea acestora si actiunile bactericide.

Fagocitoza este mediata de opsonine circulante, specifice (imunoglobuline IgG) sau nespecifice (componente ale complementului), neutrofilele avand receptori pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor IgG1, IgG2 si pentru fragmentul complementului iC3b (C3b inactivat). Microorganismele absorbite si opsonizate sunt distruse atat prin mecanisme oxigen-dependente cat si oxigen-independente. Radicalii liberi de oxigen degradeaza bacteriile absobite in fagozomi si sunt partial eliberati in mediul inconjurator unde intensifica distrugerea microorganismelor si determina simultan lezarea tesuturilor. Procesul este caracteristic inflamatiei acute, fiind mult mai rar intalnit in afectiunile inflamatorii cronice. Distrugerea microorganismelor se mai poate produce si prin intermediul proteinelor prezente in granulatiile azurofiele cum ar fi: catepsina G, lizozimul, interferonii etc.

Mediatorii inflamatiei, citokinele (de exemplu, TNFα) si selectinele cresc abilitatea granulocitelor de a se localiza la nivelul focarului de inflamatie. Capacitatea de fagocitoza este crescuta prin intensificarea productiei de radicali de oxigen si prin eliberarea enzimelor lizozomale. TNFα este un factor important care potenteaza activitatea fagocitara si citotoxica a neutrofilelor. La randul lor, granulocitele activate secreta citokine; IL-1 care stimuleaza productia de IL-8 de catre monocite, celule endoteliale si fibroblasti, creste expresia moleculelor de adeziune CD11b/CD18 si generarea de radicali de oxigen. Interferonul gamma este o citokina puternica care intensifica expresia receptorului Fc, stimuleaza modificarile oxigenului precum si eliberarea granulelor din neutrofile¹.

Datorita caracteristicilor mentionate granulocitele sunt implicate in raspunsul inflamator precoce, iar anomaliile functionale ale acestora, survenite in oricare din etape, determina deficiente semnificative ale  imunitatii celulare⁵.

O activitate redusa sau absenta de generare a exploziei oxidative in neutrofile sau monocite este intalnita in unele defecte mostenite cum ar fi boala granulomatoasa cronica (CGD). CGD reprezinta un grup heterogen de afectiuni cu transmitere X-linkata sau autozomal recesiva avand la baza mutatii genetice multiple.  Ca urmare a acestor anomalii este afectata una din cele patru subunitati ale enzimei NADPH oxidaza ce catalizeaza formarea peroxidului de hidrogen. Procesul de fagocitoza se desfasoara normal insa este perturbat metabolismul oxidativ – oxigenul molecular nu mai este redus la anionul superoxid si la alti radicali liberi (radical hidroxil si peroxid de hidrogen) ce reprezinta componente importante ale mecanismului intracelular de distrugere a bacteriilor.

Pacientii cu CGD prezinta infectii recurente cu microorganisme producatoare de catalaza, cum ar fi Staphylococcus aureus, care sunt capabili sa distruga peroxidul de oxigen generat de neutrofile. Aceste microorganisme supravietuiesc ingestiei intracelulare, se multiplica si determina o reactie granulomatoasa din partea tesuturilor, care atunci cand devine excesiva poate obstructiona tracturile gastrointestinal si genitourinar. Alte organe ce pot fi afectate de granuloame sunt plamanul, ganglionii limfatici, ficatul, osul. Infectiile cronice cu Serratia spp., Klebsiella spp., Burkholderia cepacia si Aspergillus spp., sunt in special problematice. De mentionat ca pacientii cu CGD nu sufera infectii cu microorganisme catalazo-negative. Debutul bolii are loc de obicei in primii doi ani de viata^2;3;4.

Explozia oxidativa a neutrofilelor poate fi afectata si la pacientii cu transplant precum si la cei cu SIDA.

Anumite imunomodulatoare (citokine: GM-CSF, G-CSF, TNFα) pot avea un oarecare efect si asupra metabolismului oxidativ celular⁴.

Caracteristica principala a neutrofilelor in CGD este aceea ca dupa stimulare nu sunt capabile sa produca o explozie oxidativa semnificativa. Metoda clasica pentru screening-ul acestei afectiuni utilizeaza un colorant – albastru-nitrat de tetrazol (nitroblue tetrazolium – NTB test) ce este incubat impreuna cu neutrofilele stimulate ale pacientului; neutrofilele functionale fagociteaza, reduc si precipita colorantul NTB galben rezultand depozite intracelulare de formazan negru-albastrui; aceste depozite reprezinta un indicator al formarii intracelulare de peroxid de hidrogen; in urma examinarii microscopice se efectueaza un scor al neutrofilelor ce contin depozite intracelulare de formazan³.

In laboratorul nostru testul NBT a fost inlocuit de Burstest care foloseste citometria in flux pentru a evalua metabolismul oxidativ alterat al neutrofilelor din CGD sau alte afectiuni si pentru a studia efectul unor medicamente imunomodulatoare⁴.

Pregatire pacient – se va evita recoltarea probei in cursul unei infectii acute⁴.

Specimen recoltat - sange venos⁴. 

Recipient de recoltare - vacutainer cu heparinat de litiu⁴.

Volum proba - minim 10 mL sange heparinat⁴.

Stabilitate proba - sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei⁴.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate⁴.

Metoda – citometrie in flux.

Burstest permite evaluarea cantitativa a exploziei oxidative din neutrofile si monocite. Se utilizeaza bacterii (E. coli) opsonizate nemarcate ca particule stimulante, ligandul de proteinkinaza C (PMA – forbol12-miristat 13-acetat) ca stimul puternic, independent de receptori si peptidul chemotactic N-formil-MetLeuPhe (fMLP)  ca stimul fiziologic slab. Sangele heparinat al pacientului este incubat cu stimulii mentionati la 37°C; se utilizeaza si o proba cu rol de control negativ care nu este incubata cu stimuli; dupa stimulare, neutrofilele si monocitele produc specii reactive de oxigen care distrug bacteriile din interiorul fagozomului; formarea acestor compusi este monitorizata prin adaugarea unui substrat fluorogenic – dihidrorodamina (DHR) – care odata oxidat va genera produsi intracelulari fluorescenti detectati ulterior prin citometrie in flux; reactia este stopata prin adaugarea solutiei de liza ce indeparteaza eritrocitele si determina o fixare partiala a leucocitelor; solutia de colorare a ADN-ului, adaugata inaintea analizei prin citometrie in flux, exclude artefactele generate de agregatele bacteriene care au proprietati de dispersare a luminii asemanatoare leucocitelor; se utilizeaza un laser cu argon (488 nm, lumina albastra); pentru fiecare proba se colecteaza prin “gating”  10000-15000 leucocite; sunt analizate atat procentul de celule (neutrofile si monocite) care au produs specii reactive de oxigen (recrutare), cat si intensitatea medie a fluorescentei acestora (activitatea, cantitatea de substrat clivat); in acest scop se va efectua un “gating” pe grupul leucocitar relevant si se va analiza histograma fluorescentei verzi a acestuia (FL1); prin utilizarea controlului negativ se va seta un marker pentru fluorescenta-1 (FL1) astfel incat sub 1% din evenimente sa fie pozitive; procentul de celule care produc specii reactive de oxigen va putea fi apoi determinat prin numararea evenimentelor localizate deasupra marker-ului; intensitatea medie a fluorescentei se coreleaza cu numarul de produsi generati de catre un singur leucocit⁴.

Valori de referinta si comunicarea rezultatelor

Sunt raportati urmatorii parametri:

Procentul de neutrofile care produce specii reactive de oxigen: >84%

Activitate oxidativa neutrofile: >550 mfi

mfi = intenistatea medie a fluorescentei⁴.

Limite

Probele cu un numar de leucocite aflat in afara intervalului de referinta necesita o corectie a cantitatii de bacterii adaugate⁴.

Bibliografie

1. Anatol Panasiuk, Jolanta Wysoka, Elzbieta Maciorkowska, Bozena Panasiuk, Danuta Prokopowicz, Janusz Zak, Karol Radomski. Phagocytic and oxidative burst activity of neutrophils in the end stage of liver cirrhosis. In World Journal of Gastroenterology 2005; 11(48):7661-7665.

2. Francesco Dati & Erwin Metzmann. Immunodeficiencies: Characteristics and laboratory findings. In Proteins Laboratory Testing and Clinical Use, Media Print Taunusdruck GmbH, Frankfurt am Main; 2005,187.

3. Kimberley W. Sanford, Susan D. Roseff. Immunodeficiency Disorders. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 911.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2011. Ref Type: Catalog.

5. Roger S. Riley, Jonathan Ben-Ezra. Laboratory Evaluation of the Cellular Immune System. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 826-830.

Neutrofilele detin un rol important in raspunsul imun nespecific, in special in rezistenta antibacteriana,  ca celule efectoare, inductoare si reglatoare. Printre caracteristicile lor esentiale se numara:

• marginatia si aderarea la celulele endoteliului vascular;

• traversarea peretelui vascular (diapedeza) si migrarea catre focarele de inflamatie;

• recunoasterea si fagocitarea moleculelor opsonizate;

• degradarea si distrugerea acestor molecule prin generarea de radicali toxici de oxigen.

Aceste caracteristici sunt facilitate de prezenta de receptori aflati la suprafata si in interiorul celulelor, cum ar fi receptorii pentru citokine, neuromediatori, autacoizi si hormoni.

Chemotactismul neutrofilelor se produce ca raspuns la factorii chemotactici (chemotaxine) generati la nivelul focarului lezional. Mai mult, chemotaxinele intensifica metabolismul neutrofilelor, agregarea acestora si actiunile bactericide.

Fagocitoza este mediata de opsonine circulante, specifice (imunoglobuline IgG) sau nespecifice (componente ale complementului), neutrofilele avand receptori pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor IgG1, IgG2 si pentru fragmentul complementului iC3b (C3b inactivat). Microorganismele absorbite si opsonizate sunt distruse atat prin mecanisme oxigen-dependente cat si oxigen-independente. Radicalii liberi de oxigen degradeaza bacteriile absobite in fagozomi si sunt partial eliberati in mediul inconjurator unde intensifica distrugerea microorganismelor si determina simultan lezarea tesuturilor. Procesul este caracteristic inflamatiei acute, fiind mult mai rar intalnit in afectiunile inflamatorii cronice. Distrugerea microorganismelor se mai poate produce si prin intermediul proteinelor prezente in granulatiile azurofiele cum ar fi: catepsina G, lizozimul, interferonii etc.

Mediatorii inflamatiei, citokinele (de exemplu, TNFα) si selectinele cresc abilitatea granulocitelor de a se localiza la nivelul focarului de inflamatie. Capacitatea de fagocitoza este crescuta prin intensificarea productiei de radicali de oxigen si prin eliberarea enzimelor lizozomale. TNFα este un factor important care potenteaza activitatea fagocitara si citotoxica a neutrofilelor. La randul lor, granulocitele activate secreta citokine; IL-1 care stimuleaza productia de IL-8 de catre monocite, celule endoteliale si fibroblasti, creste expresia moleculelor de adeziune CD11b/CD18 si generarea de radicali de oxigen. Interferonul gamma este o citokina puternica care intensifica expresia receptorului Fc, stimuleaza modificarile oxigenului precum si eliberarea granulelor din neutrofile¹.

Datorita caracteristicilor mentionate granulocitele sunt implicate in raspunsul inflamator precoce, iar anomaliile functionale ale acestora, survenite in oricare din etape, determina deficiente semnificative ale imunitatii celulare⁵.

Fagocitoza anormala poate sa apara in cazul unor defecte ale neutrofilului, ale imunoglobulinelor sau ale complementului. Cele mai cunoscute defecte mostenite sunt:

-disfunctia actinei din neutrofile (NAD): tulburare de motilitate a neutrofilelor indusa genetic ce determina reducerea marcata a capacitatii de migrare si de ingerare a particulelor;

-deficienta de tuftsina; tuftsina fiind implicata in stimularea fagocitozei, deficitul acesteia se asociaza cu perturbarea fagocitozei si susceptibilitate crescuta fata de infectii (germenii cel mai frecvent implicati: Staphylococus aureus, Streptococcus pneumoniae, Candida spp.); pacientii prezinta rash-uri asemanatoare dermatitei seboreice, adenopatii fluctuante, infectii respiratorii⁴;

-defectul receptorului pentru fragmentul complementului iC3b (CD11b) – rezulta dintr-o biosinteza anormala a unui lant beta de 95kDa (CD18) care este comun receptorului iC3b si moleculelor de adeziune LFA-1, Mac-1 si CR4; anomalia a fost denumita defectul de adeziune leucocitara tip 1 (LAD-1), se transmite autozomal recesiv si se caracterizeaza clinic prin ulcere cutanate cronice/recurente, gingivita, fistule intestinale sau perianale; functiile leucocitare (marginatia, chemotactismul, opsonizarea mediata prin iC3b si fagocitoza) sunt sever afectate².

O activitate fagocitara redusa poate fi intalnita si in unele afectiuni dobandite cum ar fi traumatismele, diabetul zaharat si infectiile (plagi infectate dupa arsuri, SIDA, infectii survenite la nou-nascuti sau varstnici).

Activitatea fagocitara a neutrofilelor si monocitelor poate fi stimulata de preparate imunomodulatoare: citokine (interleukina-2, gamma-interferon), probiotice sau extracte de plante (Echinaceae purpureae herba).

Fagotestul are ca scop investigarea activitatii fagocitare in diverse afectiuni si evaluarea efectelor exercitate de medicamente³.

Pregatire pacient – se va evita recoltarea probei in cursul unei infectii acute³.

Specimen recoltat - sange venos³. 

Recipient de recoltare - vacutainer cu heparinat de litiu³.

Volum proba - minim 2 mL sange heparinat³.

Stabilitate proba - sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei³.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate³.

Metoda – citometrie in flux.

Fagotest permite evaluarea cantitativa a fagocitozei prin masurarea procentului de fagocite care au ingerat bacterii si a activitatii acestora (numar de bacterii/celula). Se utilizeaza bacterii (E. coli) opsonizate marcate cu fluoresceina (FITC-E. coli) care se incubeaza impreuna cu sangele pacientului la 37°C; se utilizeaza si o proba cu rol de control negativ care se mentine pe gheata; ulterior, fagocitoza este oprita prin plasarea probelor pe gheata si adaugarea solutiei de stopare; aceasta solutie permite diferentierea intre atasarea si internalizarea bacteriilor prin eliminarea fluorescentei bacteriilor legate de suprafata celulelor si mentinand nealterata fluorescenta particulelor internalizate; dupa doua etape de spalare se indeparteaza eritrocitele cu ajutorul solutiei de liza; solutia de colorare a ADN-ului, adaugata inaintea analizei prin citometrie in flux, exclude artefactele generate de agregatele bacteriene care au proprietati de dispersare a luminii asemanatoare leucocitelor; se utilizeaza un laser cu argon (488 nm, lumina albastra); pentru fiecare proba se colecteaza prin “gating”  10000-15000 leucocite; sunt analizate atat procentul de celule (neutrofile si monocite) care au fagocitat bacterii, cat si intensitatea medie a fluorescentei acestora (numarul de bacterii ingerate); in acest scop se va efectua un “gating” pe grupul leucocitar relevant si se va analiza histograma fluorescentei verzi a acestuia (FL1); prin utilizarea controlului negativ se va seta un marker pentru fluorescenta-1 (FL1), astfel incat sub 1% din evenimente sa fie pozitive; procentul de celule care fagociteaza bacterii va putea fi apoi determinat prin numararea evenimentelor localizate deasupra marker-ului; intensitatea medie a fluorescentei se coreleaza cu numarul de bacterii ingerate de catre un singur leucocit³.

Valori de referinta si comunicarea rezultatelor

Sunt raportati urmatorii parametri:

Procentul de neutrofile care fagociteaza bacterii: >84%

Activitate fagocitara neutrofile: >550 mfi

mfi = intenistatea medie a fluorescentei³.

Limite

Probele cu un numar de leucocite aflat in afara intervalului de referinta necesita o corectie a cantitatii de bacterii adaugate³.

Bibliografie

1. Anatol Panasiuk, Jolanta Wysoka, Elzbieta Maciorkowska, Bozena Panasiuk, Danuta Prokopowicz, Janusz Zak, Karol Radomski. Phagocytic and oxidative burst activity of neutrophils in the end stage of liver cirrhosis. In World Journal of Gastroenterology 2005; 11(48):7661-7665.

2. Francesco Dati & Erwin Metzmann. Immunodeficiencies: Characteristics and laboratory findings. In Proteins Laboratory Testing and Clinical Use, Media Print Taunusdruck GmbH, Frankfurt am Main; 2005,186.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2011. Ref Type: Catalog.

4. Lawrence A. Schachner, Ronald C. Hansen. Genodermatoses. In Pediatric Dermatology, 3d edition, 2003, Mosby, 314.

5. Roger S. Riley, Jonathan Ben-Ezra. Laboratory Evaluation of the Cellular Immune System. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 826-830.

La adultul normal, imunoglobulina G (IgG) constituie 75% din cantitatea totala de imunoglobuline, fiind implicata in raspunsul imun secundar. In cadrul acestei clase de imunoglobuline se disting 4 subclase: IgG1, IgG2, IgG3 si IgG4, care reflecta existenta a 4 lanturi grele H (γ1-γ4) ce sunt similare dar un identice in ceea ce priveste secventa de aminoacizi si proprietatile generale. Astfel, subclasele prezinta o variabilitate considerabila a proprietatii de fixare a complementului, de legare a macrofagelor si traversare a placentei (vezi tabelul de mai jos)^2;6.

Tabel: Proprietatile subclaselor IgG umane

Abilitatea de a fixa complementul (legarea de fractiunea C_1q) variaza in ordinea IgG3 > IgG1 > IgG2; subclasa IgG4 este incapabila de a lega C_1q dar poate activa complementul pe calea alterna. Fragmentele Fc ale IgG1 si IgG3 se pot lega de receptorii de suprafata ai macrofagelor. Subclasele IgG sunt singurele imunoglobuline care pot traversa placenta; IgG2 sunt mai putin eficiente in acest sens.

IgG1, IgG2 si IgG3 apar in cursul raspunsului imun umoral mediat de limfocitele Th1, pe cand IgG4 (ca si IgE) se asociaza caracteristic cu raspunsul indus de limfocitele Th2.

Concentratii scazute de subclase IgG se pot inregistra in contextul hipogamaglobulinemiei (de exemplu, hipogamaglobulinemia comuna variabila in care toate clasele de imunoglobuline sunt scazute) sau in deficiente selective, cu afectarea de obicei a IgG2.

Deficitul de IgG1 se produce in special la pacientii cu deficiente severe de imunoglobuline care afecteaza si celelalte subclase IgG; pacientii prezinta de obicei infectii cu virusul Epstein-Barr.

Deficitul de IgG2 este mai heterogen; poate sa apara izolat sau in asociere cu deficitul de IgA sau de IgA si alte subclase IgG. Majoritatea pacientilor cu deficit de IgG2 prezinta infectii recurente de tipul sinuzitelor, otitelor si pneumopatiilor. Copiii cu deficit de IgG2 prezinta adesea un raspuns umoral specific deficitar fata de antigenele polizaharidice, cum ar fi antigenele bacteriilor incapsulate: Haemophilus influenzae tip B si Streptococcus pneumoniae.

Deficitele izolate de IgG3 si IgG4 se produc mai rar. Deficitul de IgG3 se asociaza cu sinuzita si otita medie, iar cel de IgG4 cu ataxie-telangiectazie si infectii sinopulmonare^4;5.

La pacientii alergici anticorpii de tip IgG4 produsi ca urmare a imunoterapiei blocheaza in vitro eliberarea de histamina IgE-mediata din bazofile. S-a constatat astfel ca o imunoterapie eficienta este insotita de o crestere a imunoglobulinelor IgG4 alergen-specifice; din acest motiv aceasta crestere, care depinde de doza administrata, ar putea reprezenta un marker obiectiv pentru raspunsul terapeutic¹.

La pacientii cu dermatita atopica se constata adesea niveluri crescute de IgG4, probabil induse de stimularea antigenica prelungita. In general, anticorpii IgG4 au fost considerati ca avand atat efecte daunatoare cat si protectoare. Pe langa imunoterapie, efectul protector a fost constatat si in unele infestari parazitare prin blocarea legarii IgE specifice la celulele trigger. Deoarece exista o mare diferenta intre anticorpii IgG4 si IgE in ceea ce priveste specificitatea epitopilor, doar o mica fractiune din IgG4 alergen-specifice interfera eficient cu legarea IgE de celulele efectoare⁹.

O entitate clinico-patologica recent descoperita este boala sclerozanta asociata cu IgG4, primul organ la care a fost descrisa afectarea fiind pancreasul. Este vorba de o afectiune sistemica caracterizata prin infiltrarea extensiva a diverselor organe cu plasmocite IgG4 pozitive si limfocite T. Pot fi afectate pancreasul, caile biliare, vezica biliara, glandele salivare, tesutul retroperitoneal, plamanii, rinichii si prostata; la nivelul acestor organe se constata fibroza tisulara cu flebita obliterativa. Pancreatita autoimuna descrisa initial in Japonia in 1995 nu este o simpla afectare a pancreasului, ci reprezinta una din manifestarile bolii sclerozante asociate cu IgG4. Pe langa pancreatita autoimuna, aceasta boala include colangita sclerozanta, colecistita, sialoadenita, fibroza retroperitoneala, nefrita tubulo-interstitiala, pneumonie interstitiala, prostatita, pseudotumora inflamatorie, limfadenopatie, toate asociate cu IgG4. Majoritatea bolilor sclerozante IgG4 pozitive asociaza pancreatita autoimuna, insa au fost descrise si cazuri fara afectare pancreatica. Boala apare in special la barbatii in varsta si inregistreaza un raspuns bun la corticoterapie. Deoarece adesea tabloul clinic initial sugereaza o afectiune maligna, boala sclerozanta trebuie considerata in diagnosticul diferential pentru a evita interventia chirurgicala nenecesara. Nivelurile serice crescute de IgG4 pot fi utile pentru stabilirea diagnosticului corect⁸.

Recomandari pentru determinarea subclaselor IgG - evaluarea pacientilor cu simptome si semne clinice de deficit imun umoral sau combinat; pacienti hipogamamglobulinemici; pacienti cu infectii recurente si cu un nivel normal de IgG; pentru IgG4: evaluarea alergiilor si a desensibilizarii prin imunoterapie^4;5; suspiciune de boala sclerozanta asociata cu IgG4⁸.

Pregatire pacient - à jeun³.

Specimen recoltat - sange venos³.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator³.

Cantitate recoltata - minim 2 mL ser³.

Cauze de respingere a probei – specimen intens hemolizat, icteric, lipemic sau contaminat bacterian³.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare si se transporta in conditii de refrigerare³.

Stabilitate proba - serul este stabil 8 zile la 4-8°C; timp indelungat la -20°C³.

Metoda – nefelometrica³.

Valori de referinta

Variaza in functie de varsta³:

Interpretarea rezultatelor

Concentratii scazute ale tuturor subclaselor sunt intalnite in imunodeficienta comuna variabila, imunodeficienta combinata, sindromul ataxie-telangiectazie sau alte imunodeficiente primare sau dobandite.

O concentratie scazuta de IgG2 poate fi clinic semnificativa in contextul infectiilor sinopulmonare recurente si se poate asocia sau nu cu un deficit de IgA⁵.

In cursul imunoterapiei cresterea IgG4 fata de nivelul bazal indica faptul ca sistemul imun al pacientului raspunde la tratament. In absenta unei cresteri IgG4 este putin probabil ca terapia sa fie eficienta⁷.

Limite si interferente

Ocazional pot fi intalnite concentratii usor scazute ale uneia sau mai multor subclase de IgG care nu prezinta de obicei semnificatie clinica. Rezultatele vor fi interpretate intotdeauna in contextul clinic al pacientului si al celorlalte analize de laborator⁵.

Nu se recomanda utilizarea valorilor IgG4 pentru evaluarea statusului atopic⁴.

● Interferente analitice

Prezenta in proba testata a factorului reumatoid, complexelor imune circulante sau a paraproteinelor poate interfera cu metoda de lucru si conduce la rezultate incerte³.

Bibliografie

1. Canonica GW et al. Clinical Outcome Measures of Specific Immunotherapy. In Allergy 2007; 62:317-324.

2. Francesco Dati & Erwin Metzmann. The Immune System. In Proteins Laboratory Testing and Clinical Use, Media Print Taunusdruck GmbH, Frankfurt am Main; 2005, 18-19.

3. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

4. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Immunoglobulin G, Subclasses (1-4). www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

5. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Test Catalog. IgG Subclasses , Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.

6. Richard A. McPherson, H. Davis Massey. Laboratory Evaluation of Immunoglobulin Function and Humoral Immunity. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 840.

7. Rossi RE et.al;. Evaluation of serum IgG4 antibodies specific to grass pollen allergen components in the follow up of allergic patients undergoing subcutaneous and sublingual immunotherapy. In Vaccine 2007, Jan 15;25(5):957-64.

8. Terumi Kamisawa, Atsutake Okamoto. IgG4-related sclerosing disease. In World J Gastroenterol 2008 July 7; 14(25): 3948-3955.

Neopterinul, D-eritro-6-trihidroxipropil-pterin, este un compus cu greutate moleculara mica produs de monocite/macrofage, ce serveste ca marker al activarii sistemului imun celular. Este sintetizat din guanil trifosfat (GTP) sub actiunea enzimei GTP – ciclohidroxilaza. Interferonul γ, sintetizat de limfocitele T in cursul raspunsului imun celular stimuleaza GTP – ciclohidroxilaza determinand cresterea productiei de neopterin. Prin urmare, masurarea concentratiilor de neopterin in fluidele corpului furnizeaza informatii despre activarea celulelor T helper. Este eliminat in principal prin urina, astfel incat determinarea nivelelor urinare poate fi utila in evaluarea raspunsului imun celular, chiar si in absenta simptomelor clinice tipice, deoarece studiile au aratat o corelare intre evolutia bolii si concentratiile urinare.  

Cresterea productiei de neopterin se intalneste in infectiile virale, inclusiv virusul imunodeficientei umane (HIV), infectiile determinate de bacterii si paraziti intracelulari, boli autoimune (artrita reumatoida si lupus eritematos sistemic), boli maligne si in episoadele de rejet de grefa. Concentratiile plasmatice de neopterin pot fi utilizate ca indicatori de prognostic pentru anumite tipuri de tumori maligne si la persoanele infectate cu HIV, nivelele ridicate fiind asociate cu o perioada de supravietuire mai redusa.  

O alta aplicatie a determinarii neopterinului este evaluarea pacientilor cu transplant de organ in scopul recunoasterii precoce a complicatiilor imunologice. Masurarea valorilor serice de neopterin este, de asemenea, utila pentru monitorizarea tratamentului pacientiilor cu afectiuni autoimune si cei infectati cu HIV.  

Screeningul donatorilor de sange permite detectarea infectiilor acute si imbunatateste siguranta transfuziilor de sange.

Sinteza crescuta de neopterin este asociata cu cresterea productiei de specii reactive de oxigen si cu concentratii plasmatice scazute de antioxidanti, ca alfa-tocoferolul. Prin urmare, masurarea valorilor serice de neopterin reprezinta o evaluare a gradului de activare a sistemului imun celular, dar si o estimare a stresului oxidativ^2;3;4.

Recomandari pentru determinarea neopterinului

-infectii virale (HIV), bacteriene (TBC), parazitare (malarie);

-boli autoimune si inflamatorii (artrita reumatoida, LES, boala Crohn, colita ulcerativa);

-tumori maligne (ginecologice, hematologice, pulmonare, prostatice, gastrointestinale);

-complicatii imunologice (rejetul de grefa);

-monitorizarea terapiei imunomodulatoare cu citokine sau a tratmentului antiviral sau antibacterian in infectiile cu HIV sau cu Mycobacterium tuberculosis^2,3.

Pregatire pacient – à jeun (pe nemancate)¹.

Specimen recoltat – sange venos¹.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator¹.

Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare¹.

Cantitate recoltata - 1 mL¹.

Cauze  de respingere a probei - specimen intens hemolizat/lipemic/contaminat bacterian¹.

Stabilitate proba - serul separat este stabil 1 luna la -20°C¹.

Metoda - imunoenzimatica (EIA)¹.

Valori de referinta - < 2.5 μg/L¹. 

Interpretarea rezultatelor⁴. 

In infectiile virale nivelul seric de neopterin incepe sa creasca inainte de aparitia primelor simptome si a anticorpilor serici. Concentratia plasmatica se coreleaza cu evolutia bolii, scazand dupa seroconversie si revenind in intervalul de referinta in perioada de convalescenta. 96% din pacientii cu hepatite virale prezinta valori plasmatice ridicate.

La pacientii cu infectie HIV concentratia serica de neopterin creste in faza acuta, dar spre deosebire de restul infectiilor virale, aceasta nu revine in limitele intervalului de referinta nici dupa seroconversie. La 80% dintre bolnavii infectati cu HIV, faza asimptomatica este caracterizata de valori plasmatice crescute. Pe masura ce boala avanseaza concentratia creste, inregistrand valori serice si urinare maxime in stadiul de SIDA. Masurarea concentratiilor de neopterin are o valoare deosebita pentru monitorizarea evolutiei si tratamentului pacientilor infectati cu HIV.

Nivelele plasmatice de neopterin inregistreaza cresteri in infectiile cu microorganisme intracelulare, cum ar fi tuberculoza, lepra, malaria si schistosomiaza. Neopterinul poate fi folosit ca marker al monitorizarii tratamentului, deoarece concentratia acestuia rapunde rapid la modificarile aparute in evolutia bolii. 

Determinarea valorilor serice de neopterin este utila in diagnosticul diferential al infectiilor virale si bacteriene, deoarece nivelul plasmatic al neopterinului inregistreaza valori normale sau usor crescute in afectiunile bacteriene, in timp ce in cele virale concentratiile sunt marcat ridicate.

La pacientii cu traume multiple sau postoperator, neopterinul este un indicator important pentru monitorizarea complicatiilor septice. S-a constatat ca, bolnavii cu sepsis care au decedat aveau nivele serice mult mai ridicate decat pacientii supravietuitori.

Persoanele cu boli autoimune sau inflamatorii (artrita reumatoida, LES, boala Crohn, colita ulcerativa) prezinta valori crescute de neopterin in ser, ce se coreleaza cu gradul de activitate al bolii si mai putin cu stadiul.

Deoarece, neopterinul este sintetizat de celulele sistemului imun, acesta nu este un marker tumoral propriu-zis. Activarea limfocitelor T, probabil cauzata de prezenta celulelor tumorale, determina eliberarea de citokine, activarea macrofagelor si sinteza de neopterin. Semnificatia clinica a determinarii neopterinului depinde de localizarea tumorii maligne, astfel aproape toate bolile maligne hematologice inregistreaza valori crescute, in timp ce tumorile  solide, cum ar fi cancerul mamar, prezinta rareori nivele ridicate de neopterin. In general, concentratia serica de neopterin se coreleaza direct proportional cu gradul de extensie si masa tumorala, fiind folosit, din acest motiv, in monitorizarea evolutiei si prognosticului bolii maligne.

Neopterinul poate fi folosit in evaluarea complicatiilor (rejetul de transplant si infectii virale), ce pot aparea dupa transplant, prin determinari zilnice. Cresterea valorilor serice de neopterin (inainte de aparitia manifestarilor clinice) incepand din ziua 2 si pana in ziua a 7 a este sugestiva pentru complicatiile post-transplant, dar investigatii suplimentare sunt necesare pentru a stabili un diagnostic corect. Aplazia, ce poate aparea in transplantul de maduva hematogena, se asociaza cu nivele plasmatice scazute de neopterin. Concentratia serica poate creste considerabil in infectiile virale sau  in reactia de respingere a grefei.

Neopterinul poate fi de asemenea util in screening-ul donatorilor de sange. Avantajul folosirii unui astfel de test nespecific este faptul ca, acesta poate exclude persoane cu afectiuni diverse (infectii virale, bacteriene, boli autoimune, diferite tipuri de afectiuni maligne)³.

Bibliografie

 1. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

2. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Neopterin, Serum Profile. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

3. Lothar Thomas. Neopterin. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998, 707-710.

4. Murr C, Widner B, Wirleitner B, Fuchs D. Neopterin as a marker for immune system activation. In Curr Drug Metab. 2002 Apr;3(2):175-87

Tuberculoza (TBC) reprezinta o boala infectioasa respiratorie contagioasa produsa de bacteriile incluse in complexul Mycobaterium tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis si M. africanum).

Infectia tuberculoasa cuprinde atat forme active cat si latente; tuberculoza latenta se produce atunci cand o persoana devine expusa la M. tuberculosis, iar organismul controleaza infectia dar nu reuseste sa o eradicheze. Se estimeaza ca aproximativ 10% din persoanele cu tuberculoza latenta vor progresa in cursul vietii catre o forma activa. Printre cauzele associate cu reactivarea infectiei latente se numara infectia HIV si tratamentele cu antagonisti de TNFα. Din acest motiv, diagnosticarea tuberculozei latente reprezinta o etapa importanta in prevenirea reactivarii infectiei in special la persoanele cu risc crescut. Tratamentul tuberculozei latente poate reduce semnificativ riscul de progresie catre formele active⁵.

QuantiFERON TB, dezvoltat de firma Cellestis Limited (Australia),  a fost aprobat de FDA in mai 2005 ca test in vitro cu utilitate in diagnosticul infectiei cu Mycobacterium tuberculosis, atat pentru forma latenta cat si pentru cea activa. In Comunitatatea Europeana testul a fost certificat pentru a fi folosit in aceleasi situatii in care este indicat testul la tuberculina.

Pana nu demult, IDR la tuberculina a reprezentat singura metoda de diagnostic a infectiei TBC. Desi larg folosit testul la tuberculina prezinta o serie de limitari. In cazul QuantiFERON-ului, care este un test de laborator efectuat din singe, stimularea limfocitelor cu antigenele TBC are loc in tubul de flebotomie si nu intradermic. Din acest motiv se exclude efectul de “booster” care poate sa apara in cazul testului la tuberculina (efectuarea unui test cutanat la o persoana care nu a fost expusa la infectia TBC stimuleaza sistemul imun si-l determina sa reactioneze la tuberculina intr-o etapa ulterioara, cand se repeta testul cutanat).

Spre deosebire de IDR la tuberculina, rezultatele testului nu sunt influentate de vaccinarea BCG; infectiile in antecedente cu mycobacterii netuberculoase exercita de asemenea o influenta mai redusa. Sunt eliminate si reactiile adverse de hipersensibilitate care pot sa apara in cazul testului cutanat. De asemenea rezultatele la QuantiFERON TBC test sunt mult mai obiective, fara sa intervina erori in citire si interpretare^1;4;5.

Indicatiile testului:

1. Poate fi folosit in toate situatiile in care este utilizat in mod obisnuit testul la tuberculina:

-suspiciune clinica si radiologica de tuberculoza activa;

-contactii pacientilor cu forme contagioase de TBC;

-screening-ul persoanelor cu risc crescut: personalul din unitati sanitare si institutii de ingrijire, persoane provenite din medii cu igiena deficitara, etc^1;4;5.

Un studiu din 2008 a indicat faptul ca testul poate fi aplicat si copiilor peste 2 ani in scopul diagnosticarii tuberculozei latente, cu aceleasi caracteristici de performanta ca si la adulti².

Mentiune: QuantiFERON TBC inlocuieste testul la tuberculina; nu trebuie folosite concomitent ambele teste^1;4;5.

2. Poate constitui un instrument pentru monitorizarea pacientilor cu tuberculoza activa. Exista unele studii care indica potentiala utilitate a testului in evaluarea eficientei tratamentului tuberculostatic prin urmarirea cantitatii de interferon gamma eliberate care se modifica in timp⁶.

Conform unui studiu, evaluarea prin QuantiFERON la 2 luni de la initierea terapiei poate avea valoare predictiva semnificativa asupra probabilitatii ca la sfarsitul fazei intensive de tratament culturile din sputa sa ramana pozitive³.

3.  Poate fi folosit inaintea unei terapii imunosupresoare (de ex. cu anticorpi anti-TNFα) sau inaintea transplantului de organe pentru a exclude o infectie latenta cu M. tuberculosis^1;4.

Pregatire pacient – se va intrerupe terapia imunosupresoare (citostatice) cu cel putin 14 zile inaintea recoltarii⁴.

Specimen recoltat - sange venos⁴.

Recipient de recoltare - vacutainer cu heparinat de litiu⁴.

Volum proba - minim 10 mL sange heparinat⁴.

Stabilitate proba - sangele trebuie sa ajunga in 12 ore (max.16 ore) la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei⁴.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate⁴.

Metoda

Sangele heparinat al pacientului se incubeaza timp de 24 ore impreuna cu un amestec de peptide sintetice ce simuleaza cele 3 proteine specifice pentru M. tuberculosis : ESAT- 6, CFP- 10 si TB 7.7 (p4). Aceste proteine sunt produse de toate tulpinile de Mycobacterium tuberculosis si de tulpinile patogene de Mycobacterium bovis, dar nu si de catre tulpinile incluse in vaccinul BCG . Astfel, QuantiFERON este mai specific decat testul la tuberculina in detectarea infectiei cu M. tuberculosis. Daca in proba de sange sunt limfocite T cu memorie pentru aceste proteine (ceea ce se intampla si in cazul unei infectii cu multi ani in urma), aceste celule vor produce γ-interferon in contact cu antigenul specific. Determinarea cantitativa a γ-interferonului eliberat in plasma se face printr-o metoda imunoenzimatica inalt sensibila (ELISA). Se utilizeaza obligatoriu controale pozitive si negative pentru a asigura validitatea testului. Controlul pozitiv este reprezentat de fitohemaglutinina (substanta mitogena) iar controlul negativ de ser fiziologic (folosit ca un blank pentru a masura nivelul bazal de γ-interferon). Cantitatea de γ-interferon eliberata este exprimata in UI/mL^1;4.

Interpretarea rezultatelor

Rezultat negativ (cantitatea de γ-interferon eliberata < 0.35 UI/mL)

In conditiile date se poate exclude o infectie cu Mycobacterium tuberculosis. Totusi, la pacientii cu infectie cronica HIV sau alte cauze care dau o imunodeficienta severa (tratament imunosupresor, anumite afectiuni hematologice: leucemii, limfoame, anumite tumori solide: pulmonare sau din regiunea cap-gat, diabet, silicoza, insuficienta renala cronica) trebuie luat in considerare statusul imun actual si utilizate si alte metode de diagnostic a infectiei^1;4.

Un studiu recent efectuat in Japonia indica faptul ca QuantiFERON TB test este mai util in diagnosticarea infectiei tuberculoase la pacienti imunodeprimati decat testul la tuberculina. Totusi, avand in vedere faptul ca  s-a obtinut o rata crescuta de rezultate neconcludente la pacientii cu limfopenie care primesc tratament imunosupresor rezultatele trebuie interpretate cu prudenta la aceasta categorie de pacienti⁷.

In cazul unui rezultat negativ la persoanele care au venit recent in contact cu pacienti diagnosticati cu forme de TBC contagios acesta va fi confirmat printr-un nou test efectuat la 6-8 saptamani de la sfarsitul perioadei de expunere (ca si in cazul testului la tuberculina) ^1;4.

Rezultat pozitiv (cantitatea de γ-interferon eliberata ≥ 0.35 UI/mL)

Un rezultat pozitiv indica o infectie cu M. tuberculosis. In majoritatea cazurilor, diferentierea dintre o infectie latenta si una activa nu este posibila cu acest test.

In cazul suspiciunii clinice de tuberculoza activa raman valabile toate metodele de diagnostic microbiologic (microscopie, cultura) si de biologie moleculara^1;4.

Rezultat neconcludent

Apare in situatia in care nu s-au obtinut criteriile de validare fie a controlului pozitiv mitogen (raspuns inadecvat < 0.5 UI/mL), fie ale controlului negativ (nivel bazal crescut al γ-interferonului). In conditiile in care recoltarea si transportul probei s-au efectuat in conditii adecvate, lipsa de validare a controlului mitogen indica cel mai probabil o imunosupresie severa cauzata de SIDA si tratamentul curent cu medicamente imunosupresoare (corticosteroizi in doze mari, antagonisti ai TNFα, medicamente folosite la pacientii cu transplant de organe) ^1;4.

Limite

Valoarea predictiva a testului depinde de prevalenta infectiei cu M. tuberculosis in populatia testata. Fiecare rezultat trebuie interpretat in contextul clinic si epidemiologic al pacientului¹.

Bibliografie

1. Gerald H. Mazurek, MD, John Jereb, MD, Phillip LoBue, MD, Michael F. Iademarco, MD, Beverly Metchock, PhD, Andrew Vernon, MD. Guidelines for Using the Test for Detecting Mycobacterium tuberculosis Infection, United States. Division of Tuberculosis Elimination, National Center for HIV, STD, and TB Prevention. MMWR 2005; 54 (No. RR-15).

2. Jennifer Lighter, MD, Mona Rigaud, MD, MPH, Roger Eduardo, BS, Chia-Hui Peng, MPH and Henry Pollack, MD. Latent Tuberculosis Diagnosis in Children by Using the QuantiFERON-TB Gold In-Tube Test. In Pediatrics Vol. 123 No. 1 January 2009, pp. 30-37.

3. Katiyar, S.K.; Sampath, A.; Bihari, S.; Mamtani, M.; Kulkarni, H. Use of the QuantiFERON-TB Gold In-Tube® test to monitor treatment efficacy in active pulmonary tuberculosis. In The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, Volume 12, Number 10, October 2008 , pp. 1146-1152(7).

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

5. Laboratory Corporation of America.Directory of Services and Interpretive Guide. QuantiFERON®-TB Gold www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication

6. R. Markova, R. Drenska, Y. Todorova, V. Terzieva and D. Stefanova. Monitoring the efficacy of anti-TB therapy by using the QuantiFERON-TB Gold In tube test. In European Respiratory Review, 2008;17: 74-75.

7. Y. Kobashi, K. Mouri, Y. Obase, M. Fukuda, N. Miyashita and M. Oka. Clinical evaluation of QuantiFERON TB-2G test for immunocompromised patients. Division of Respiratory Diseases, Dept of Medicine, Kawasaki Medical School, Kurashiki, Japan, 2008.

Intoleranta la histamina este consecinta unui dezechilibru intre histamina acumulata in organism si capacitatea de degradare a acesteia. Aceasta afectiune nu este mediata prin anticorpi IgE, de aceea testele cutanate si dozarile de IgE specifice vor da rezultate negative^1;2.

Histamina este o amina biogena prezenta in cantitati variabile in multe alimente. In mod normal histamina alimentara este rapid detoxifiata de catre aminoxidaze; persoanele care prezinta o activitate redusa a acestor enzime au risc de a dezvolta intoleranta la histamina. Principala enzima implicata in metabolismul histaminei ingerate este diaminoxidaza (DAO), proteina stocata in structurile veziculare asociate membranei plasmatice a celulelor epiteliale si eliberata in circulatie in prezenta stimulilor adecvati.

Scaderea capacitatii de degradare a histaminei datorita unei activitati DAO reduse poate determina o serie de manifestari clinice care mimeaza o reactie alergica: diaree, cefalee, urticarie, prurit, flushing, simptome rino-conjunctivale, bronhospasm, hipotensiune, aritmii cardiace. Intoleranta la histamina devine clinic manifesta cand organismul este incarcat cu histamina mai mult decat poate cataliza (consum de alimente bogate in histamina, alcool sau medicamente care elibereaza histamina sau blocheaza DAO). Bolile alergice precum febra fanului sau sensibilizarile la fungi reprezinta o sursa in plus de histamina care se adauga la cea din alimente. Cel mai frecvent afectate sunt persoanele de sex feminin cu varste intre 30 si 55 ani.

Histamina apare in alimente datorita activitatii bacteriilor, printr-un proces de decaboxilare a aminoacizilor. De aceea se gaseste in cantitati mai mari in alimentele fermentate (de ex. branza, varza murata sau vin) si bogate in proteine (de ex. peste, carne si mezeluri). Niveluri foarte mari se gasesc de asemenea in alimentele alterate².

Nivelul de histamina creste odata cu perioada de pastrare a alimentelor de aceea acestea trebuie pregatite rapid, nu trebuie stocate mult si nu trebuie reincalzite! Datorita stabilitatii la caldura, histamina nu poate fi distrusa nici prin congelare, nici prin fierbere, prajire sau coacere^1;2.

In majoritatea cazurilor, deficitul DAO este dobandit ca urmare a unor afectiuni gastrointestinale care scad productia DAO sau a inhibarii activitatii enzimatice prin consum de alcool si diverse medicamente. Cu toate acestea, studii recente au evidentiat o mare variabilitate individuala in expresia DAO la nivelul celulelor epiteliale intestinale si diverse polimorfisme la nivelul genei DAO asociate cu afectiuni gastrointestinale, care demonstreaza existenta unei predispozitii genetice la un subgrup de pacienti cu intoleranta la histamina.

Pacientii diagnosticati cu deficit DAO pot beneficia de o dieta corespunzatoare care elimina alimentele cu un continut ridicat in histamina. Deoarece alcoolul creste permeabilitatea intestinala si prin aceasta nivelul histaminei in organism, se vor evita bauturile alcoolice la masa. De asemenea antialgicele (aspirina) faciliteaza o crestere a permeabilitatii intestinale².

Alimente cu un continut ridicat in histamina

Vinul si alte bauturi alcoolice

Histamina apare si in procesul de fermentatie alcoolica. Bacterii acidifiante ca Pediococcus cerevisiae au fost identificate ca formatoare de histamina. Continutul in histamina este un criteriu de calitate al vinului. In general vinurile rosii au un continut ridicat in histamina. Pot fi intalnite concentratii de histamina de pana la 3000 µg/l in vinurile care dau in mod caracteristic cefalee.

Continutul mediu in histamina:

• Vin rosu: 60-3800 µg/l
• Sampanie: cca 670 µg/l
• Spumos: 15-80 µg/l
• Vin dulce: 80-400 µg/l
• Vin alb: 3-120 µg/l
• Bere: 20-300 µg/l

Peste

Categoriile de peste dupa consumarea carora apar adesea simptome de intoxicare apartin familiei Scombridae (macrou). De aceea in literatura engleza cazurile de intoxicatie sunt descrise sub numele de “scombroid poisoning”. Pestii din aceasta familie (mai ales tonul si macroul) au o cantitate mare de carne rosie cu un continut crescut de histamina. Dar si la alte tipuri de peste s-au masurat cantitati crescute de histamina: heringi, sardine si sardele. Productia de histamina este influentata de temperatura la care este tinut pestele pana la pregatirea sa culinara. In cazurile in care s-au gasit cantitati mari de histamina in conservele de ton sau macrou afumat, cercetarile au dovedit ca pestele n-a fost transportat in conditii de refrigerare corespunzatoare sau a fost depozitat inadecvat. In mod surprinzator s-au gasit cantitati mai mari de histamina in marinata decat in carnea de peste.

• Ton: pana la 8000 mg/kg
• Macrou afumat: pana la 788 mg/kg
• Macrou (conserva): pana la 15 mg/kg
• Sardina: pana la 1500 mg/kg
• Sardele: pana la 180 mg/kg
• Hering: pana la 12 mg/kg (mai ales marinat)

Lapte/branza

In timp ce laptele crud si cel de baut contine cantitati minime de histamina, unele sortimente de branzeturi au niveluri ridicate. In general se considera ca nivelul de histamina creste cu maturarea si cu stocarea. Bacteriile incriminate sunt diversi lactobacili si streptococi.

• Emmentaler: 10-500 mg/kg
• Stilton (branza cu muceagai albastru): cca 160 mg/kg
• Gorgonzola: pana la 160 mg/kg
• Camembert: 10-300 mg/kg
• Parmezan: 10-580 mg/kg

Carne/mezeluri

Continutul in amine biogene in preparatele de carne este foarte divers. Unele sortimente de carnati pot contine cantitati relativ mari de histamina, in timp ce produsele proaspete abia daca ating niveluri critice. Dar mai sunt si alte amine biogene prezente in carne. Cercetarile au aratat ca diaminele cadaverina si putresceina – ambele substraturi peste DAO sunt un indicator al prospetimii carnii.

• Salam: pana la 280 mg/kg
• Carnati cervelat: pana la 100 mg/kg
• Jambon Westfal: 40-270 mg/kg

Alte alimente

Otetul din vin rosu contine pana la 4000 µg/l histamina. In cazul ciocolatei continutul oscileaza intre 5-100 mg/kg, dupa sortiment¹.

Medicamente care elibereaza histamina sau inhiba DAO

-miorelaxante: pancuroniu, alcuroniu, D-tubocurarina

-narcotice: tiopental

-analgetice si antiinflamatorii: acid acetilsalicilic, metamizol, antiinflamatorii nesteroidiene, opioide

-anestezice locale: prilocaina

-anti-hipertensive: verapamil, alprenolol, dihidralazina

-antiaritmice: propafenona

-diuretice: amilorid

-antiemetice: metoclopramid

-antibiotice: cefuroxime, cefotiam, isoniazid, pentamidin, clavulanic acid, chorochina

-mucolitice: acetilcisteina, ambroxol

-bronhodilatatoare: aminofilina

-antagonisti de receptori H2: cimetidina

-chimioterapice: ciclofosfamida

-antidepresive: amitriptilina²

Recomandari pentru determinarea activitatii DAO

Testul este indicat la pacienti cu suspiciune clinica de intoleranta la histamina (prezenta a ≥ 2 simptome tipice cu raspuns favorabil la dieta fara alimente cu continut ridicat in histamina) dupa excluderea altor afectiuni gastrontestinale, a mastocitozei sistemice (rezultat negativ pentru triptaza) si a alergiilor alimentare (teste cutanate si IgE specifice negative)².

Pregatire pacient - à jeun¹.

Specimen recoltat - sange venos¹.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator¹.

Cantitate recoltata - minim 0.5 mL ser¹.

Cauze de respingere a probei – specimen intens hemolizat, icteric, lipemic sau contaminat bacterian¹.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare si se transporta in conditii de refrigerare¹.

Stabilitate proba - serul este stabil 1 saptamana la 4-8°C¹.

Metoda – REA (radioextractie):  la proba de ser a pacientului se adauga putresceina marcata cu ¹⁴C care constituie un substrat cu afinitate inalta pentru DAO; sub actiunea DAO putresceina este converita in delta-pirolina; cantitatea de pirolina obtinuta se coreleaza cu activitatea DAO din serul pacientului¹.

Valori de referinta – 10-22 UI/mL¹.

Interpretarea rezultatelor

Obtinerea unor valori scazute ale activitatii DAO indica o capacitate enzimatica redusa de degradare a histaminei.

Obtinerea unor valori crescute ale activitatii DAO sunt sugestive pentru o inducere enzimatica in cadrul unui proces alergic activ.

Obtinerea unor valori ale activitatii DAO la limita inferioara a normalului exclude existenta unui deficit genetic; totusi in cazul incarcarii organismului cu histamina, de exemplu prin alergii floride sau alimentatie bogata in histamina, pot aparea manifestari clinice (deficit latent)¹.

Limite si interferente

La unii pacienti cu simptome clinice de intoleranta la histamina activitatea DAO este normala sau situata in jurul limitei inferioare a normalului. La acesti este utila determinarea histaminei in sange².

In timpul sarcinii se pot inregistra valori DAO mult crescute, de aceea nu se recomanda efectuarea testului la pacientele gravide¹.

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referinte specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog.

2. Laura Maintz, Natalija Novak. Histamine and histamine intolerance. In American Journal of Clinical Nutrition, vol. 85, No. 5, 1185-1196, May 2007.