Functia primara a sistemului imun este aceea de a lupta impotriva agentilor patogeni microbieni (bacterii, paraziti, fungi, virusuri). Sistemul imun indeplineste aceasta functie in doua moduri: in primul rand, prin generarea unui raspuns imun specific impotriva agentului patogen invadant si controlul infectiei; si in al doilea rand, prin reamintirea acestui prim “conflict” si declansarea unui raspuns imun accelerat in urma reexpunerii la acelasi agent patogen microbian³.

Sistemul imun este constituit dintr-o retea complexa de celule, tesuturi si organe care participa impreuna la apararea organismului uman.

Cunoasterea structurii si functiei complexe a sistemului imun ajuta la intelegerea fundamentului deficientelor immune congenitale sau dobandite (infectia HIV) si la perceperea cailor potentiale prin care sistemul imun poate fi modulat in cazul unor boli specifice^3;9.

Organele limfoide ale sistemului imun sunt: maduva osoasa hematogena (situsul hematopoiezei), timusul (centrul “instructajului timic”, de maturare a protimocitelor in celule T mature), splina („filtrul” imunologic al sangelui), nodulii limfatici (centrul imunologic al limfei), tesutul limfoid asociat mucoaselor (MALT) si tesutul limfoid asociat tractului digestiv (GALT)^9;11. Intr-o maniera similara, macrofagele si celulele dendritice de la nivelul splinei si nodulilor limfatici captureaza antigenele si le prezinta limfocitelor B si T, declansand astfel raspunsul imun.

Celulele sistemului imun sunt: limfocitele T, limfocitele B, celulele NK, granulocitele, macrofagele/monocitele, fibrobastii, celulele epiteliale, celulele dendritice^3;9.

Majoritatea agentilor patogeni au o capacitate de proliferare foarte ridicata, iar prevenirea infectiilor sistemice necesita raspunsuri adecvate si rapide din partea sistemului imun innascut si a sistemului imun dobandit¹¹.

Imunitatea nespecifica/innascuta asigura prima linie de aparare impotriva agentilor microbieni patogeni¹¹.

Se caracterizeaza prin raspunsuri imune nespecifice, rapide si la fel de intense, indiferent de tipul agentului patogen, care destul de rar sunt suficiente pentru a elimina in totalitate infectiile microbiene celulare si prin lipsa memoriei imunologice sau a unei imunitati protective de durata. Este asigurata prin intermediul barierelor anatomice (tegumente, membrane, mucoase), barierelor fiziologice (temperatura, pH), factorilor chimici (interferoni, sistemul complement), celulelor cu activitate fagocitara (macrofage/monocite, celule dendritice, neutrofile, fibroblasti, celule epiteliale), citotoxicitatii mediate celular (celulele NK)^3;9.

Prin productia de mediatori (citokine, chemokine, interferoni), raspunsurile imune nespecifice stabilesc “scena“ pentru declansarea raspunsurilor imune specifice¹¹.

Imunitatea specifica/dobandita/adaptativa este acea functie a sistemului imun de a recunoaste specific antigenele si de a dezvolta o imunitate mediata umoral, o imunitate mediata celular sau ambele, principalii “ jucatori” fiind anticorpii, limfocitele B, limfocitele T si celulele prezentatoare de antigen. Acest tip de imunitate poate fi dobandita activ (organismul gazda produce propriile anticorpi/limfocite imunologic active, iar imunitatea este de lunga durata) sau pasiv (organismul primeste anticorpi/limfocite imunologic active produse in timpul unui raspuns imunologic activ in alt organism, iar imunitatea este de scurta durata). Indiferent ca este vorba despre o imunitate activa sau pasiva, aceasta poate fi dobandita natural (anticorpii sunt produsi in organismul gazda sau primiti prin transfer placentar/alaptare) sau artificial (prin vaccinare)⁹.

O carateristica importanta a acestui tip de imunitate este memoria imunologica.

Raspunsurile imune adaptative sunt larg extinse prin stimulare antigenica, ceea ce conduce la expansiunea clonala, diferentierea si maturarea a diverse clone de celule B antigen specifice, pentru a produce anticorpi circulanti (raspuns imun umoral), si prin activarea celulelor T, derivate din timus, la raspunsuri imune celulare antigen specifice. Practic, imunitatea adaptativa depinde de reteaua de interactiuni foarte complexe si intricate dintre diferitele tipuri celulare si subseturile lor, reglate prin productia lor de mediatori (citokine, chemokine si interferoni tip I,II )¹¹.

Celulele sistemului imun innascut constituie o rezerva celulara uniforma fara specificitate antigenica; pot fi recrutate in numar remarcabil de mare; sunt primele care ajung la locul infectiei; modelul de migrare este unidirectional, iar odata exercitata functia lor, celulele vor fi eliminate. In cazul celulelor specifice sistemului imun dobandit (limfocitele), acestea sunt prezente intr-un numar scazut pentru un anumit antigen si, pentru a contrabalansa acest dezavantaj, ele urmeaza un mod complex de migrare, strans dependent de statusul lor de activare si memorie imunologica. Prezinta deci capacitatea de a recircula: reintra in circulatia sangvina de la nivelul tesuturilor limfoide si migreaza catre un situs la distanta. Migrarea limfocitelor este bine organizata pentru a asigura o expunere eficienta a acestora la antigenele lor inrudite de la nivelul organelor limfoide secundare. Mai mult, clonele limfocitare care prezinta anumite caracteristici relevante, cum ar fi receptorii care recunosc epitopii antigenici, nu sunt pierdute dupa implicarea in raspunsul imun, in schimb sunt rezervate ca “celule cu memorie” pentru a asigura raspunsuri imune specifice mai rapide si mai puternice, in cazul reinfectiei cu acelasi agent patogen¹¹.

Celulele prezentatoare de antigen (APC) reprezinta un grup de celule heterogen din punct de vedere morfologic si functional, provin din precursori medulari si sunt specializate in a prezenta antigenele limfocitelor, in special celulelor T. Aceste celule profesionale prezentatoare de antigen includ monocite (prezente in sangele periferic), macrofage (monocite tisulare), celule rezidente de la nivelul organelor limfoide ale sistemului imun (celule dendritice) si constituenti ai sistemului monocit-macrofag din alte organe solide. Limfocitele B, care capteaza antigenul prin intermediul receptorilor de tip mIg (imunoglobuline de membrana), pot de asemenea sa functioneze eficient ca APC pentru limfocitele T, prin prezentarea antigenului degradat (oligopeptid) legat de moleculele complexului major de histocompatibilitate (MHC); limfocitele T activate vor secreta citokine care vor dirija diferentierea limfocitelor B si productia de anticorpi a acestora. Caracteristica definitorie a acestor celule este exprimarea moleculelor MHC I si II pe suprafata lor, precum si a moleculelor accesorii necesare pentru activarea limfocitelor T: CD86 si CD80. Imediat dupa activare, APC pot sa secrete citokine care induc functii specifice in celulele carora le prezinta antigenul. Monocitele si macrofagele sunt fagocitic active, exercitand aceasta functie in special asupra antigenelor acoperite de anticorpi sau de componente ale sistemului complement care se leaga de receptorii de suprafata pentru Fcγ si C3b^11;12.

Moleculele de legare a antigenelor, prin capacitatea lor de a lega antigenele straine organismului uman, sunt responsabile de specificitatea raspunsului imun dobandit. Exista trei seturi de astfel de molecule: imunoglobuline (Ig), receptorul celulelor T (TCR) si moleculele MHC, toate aceste molecule facand parte din superfamilia de imunoglobuline (IgSF). Ig sunt alcatuite dintr-un lant polipetidic greu (H) si un lant usor (L), de tip kappa sau lambda; acestea sunt exprimate pe suprafata limfocitelor B si secretate ca anticorpi in cadrul raspunsului imun umoral. TCR se prezinta sub forma unui heterodimer alcatuit din 2 lanturi polipeptidice H – αβ/γδ; majoritatea limfocitelor T exprima αβ-TCR. Genele HLA situate pe cromozomul 6 codifica moleculele complexului major de histocompatibilitate MHC I si II. Moleculele MHC I sunt formate dintr-un singur lant H (HLA-A, B, C), spre deosebire de moleculele MHC II care sunt alcatuite din doua lanturi H – α si β (HLA-DQ, DR, DP). Limfocitele T care exprima pe suprafata lor receptori αβ-TCR pot fi divizate in doua subpopulatii majore. Aceasta impartire este bazata pe clasa de molecule MHC recunoscuta de receptorii αβ-TCR si de expresia moleculelor CD4 sau CD8, care prin atasarea de moleculele MCH contribuie la completarea legaturii moleculare intercelulare. In timp ce limfocitele CD4 recunosc antigenul legat de moleculele MHC I, limfocitele CD8 recunosc antigenul legat de moleculele MCH II; raportul limfocitelor CD4/CD8 in sangele periferic este aproximativ 2:1 (0.8:1-3:1). Toate celulele nucleate exprima molecule MHC I si sunt APC non-profesionale, APC profesionale exprimand molecule MHC II. Interactiunea dintre complexul MHC-peptidul antigenic si TCR detine un rol esential in protectia imuna, deoarece un raspuns imun complet necesita interventia celulelor T antigen specifice. Acesta reprezinta practic un mecanism de siguranta pentru a minimaliza posibila auto-reactivitate (reactivitate impotriva self-ului), astfel incat un limfocit T devine activat numai pentru ca a intalnit un antigen strain (non-self).

Limfocitele B provin din celulele stem hematopietice care, in mod succesiv, populeaza splahnopleura embrionara paraaortica, ficatul fetal si maduva osoasa hematogena. Celulele stem fiice dau nastere progenitorilor limfoizi multipotenti (PLM), care genereaza celulele mieloide sau limfoide. Astfel, PLM pot produce precursorii limfoizi comuni (PLC), iar acestia pot genera limfocitele T, limfocitele B, celulele NK si un subset special de celule dendritice. Diferentierea finala spre celulele B necesita ca celulele fiice PLC sa fie expuse unor micromedii specializate, asa cum sunt cele prezente in ficatul fetal si maduva osoasa. Trecerea de la ficatul fetal la maduva osoasa incepe la mijlocul vietii fetale si se termina chiar inainte de nastere; celulele B continua sa fie produse in maduva osoasa pe parcursul intregii vieti. Diferentierea celulelor B are loc in doua stadii, diferite din punct de vedere anatomic si functional; astfel, primul stadiu are loc in maduva osoasa si este antigen independent, iar cel de-al doilea stadiu are loc in organele limfoide periferice si este antigen dependent^9;11.

Limfocitele B imature, care exprima pe suprafata lor mIgM (imunoglobulina de membrana) si BCR (receptorul celulei B), parasesc maduva osoasa dupa un proces de selectie negativa a celulelor B auto-reactive si patrund in periferie (sange si organe limfoide secundare) unde isi completeaza diferentierea in celule B mature care exprima pe suprafata lor mIgM si mIgD si pot fi activate prin legarea de antigen¹¹.

Celulele B imature auto-reactive, ce exprima mIgM self-reactiv, urmeaza un proces cunoscut ca “receptor editing“, in care un rearanjament la nivelul genelor care codifica lantul greu al imunoglobulinelor (IgH) modifica specificitatea antigenica a receptorului. Daca acest proces esueaza, celulele B imature auto-reactive devin anergice sau vor suferi apoptoza in urma contactului cu antigenul. Aceasta contrasteaza cu abilitatea celulelor B mature de a deveni activate in urma contactului antigenic¹².

BCR este un complex format dintr-o mIg si doua molecule citoplasmatice Igα/CD79a si Igβ/CD79b. Cu ajutorul acestui receptor limfocitele B recunosc antigenul si devin astfel activate. Implicarea BCR initiaza o serie de evenimente care culmineaza cu diferentierea celulelor B in plasmocite capabile sa secrete imunoglobuline. Limfocitele B vor prezenta antigenul, recunoscut cu ajutorul BCR, limfocitelor T helper CD4 care au fost activate anterior de acelasi antigen,  limfocitele T helper fiind selectate din pool-ul de limfocite T naive de catre celulele dendritice prezentatoare de antigen. Acest proces de activare a limfocitelor B, dependent de limfocitele T, are loc prin interactiunea dintre CD40 de pe suprafata celulelor B si ligandul sau, CD145, de pe suprafata celulelor T helper si prin secretia de interleukina-4 (IL-4) de catre celulele helper. Ambele semnale servesc la promovarea si mentinerea activarii initiate de BCR¹¹.

La nivelul organelor limfoide secundare – in zonele bogate in celule T – celulele B naive, dupa stimularea antigenica, urmeaza o expansiune clonala si formeaza grupuri de celule B activate (focare extrafoliculare). Acestea se pot diferentia in plasmocite de scurta durata (secretoare de anticorpi cu afinitate joasa) sau migreaza inapoi in foliculi si initiaza formarea unui centru germinativ.

Dupa proliferare si maturatie, celulele B din centrul germinativ se pot diferentia in plasmocite de lunga durata si celule B de memorie. Majoritatea plasmocitelor de lunga durata migreaza in maduva osoasa si sunt raspunzatoare de mentinerea nivelului seric de anticorpi (anticorpi de inalta afinitate); celulele B de memorie pot ramane pentru o lunga perioada de timp la nivelul organelor limfoide secundare sau pot migra si habita in maduva osoasa^11;12. In urma contactului antigenic, celulele B de memorie raspund printr-o proliferare rapida si diferentiere in plasmocite, refacand astfel rezerva de celule B de memorie si plasmocite.

Prin dezvoltarea tehnologiei anticorpilor monoclonali, analiza anumitor molecule de pe suprafata celulelor B (CD = “cluster determinants”) a ajutat la definirea stadiilor care se succed pe parcursul intregului proces de diferentiere si maturatie a celulelor B (vezi tabelul 17.9.1.1):

Tabel 17.9.1.1 Markeri pentru diferentierea celulelor B

Limfocitele T citotoxice (CTL) si celulele NK

Aceste doua tipuri celulare, distincte din punct de vedere fenotipic, dar strans legate prin functia lor citolitica (“killer”), sunt importante atat in controlul infectiilor, cat si in identificarea si eliminarea celulelor tumorale. Celulele CTL sunt limfocite T CD8+ care isi indeplinesc functia de “killer“ prin doua cai majore: liza mediata de perforine si granzime ce sunt eliberate din lizozomi si apoptoza receptor indusa (TNFR), ambele cai necesitand un contact apropriat intre celula litica si tinta sa, in special prin interactiunea dintre TCR si moleculele MHC I. Raspunsul CTL la o infectie acuta are loc in trei faze: prima consta in activarea initiala si proliferarea CTL; a doua in contractia celulelor T efectoare in celule T de memorie; iar a treia faza se refera la mentinerea de lunga durata a pool-ului de celule T de memorie. Celulele CTL se dezvolta la nivelului timusului, parasesc acest organ limfoid in stare naiva, circula intre organele limfoide secundare (splina si ganglionii limfatici) pe calea sistemului arterial, respectiv limfatic, si in cursul acestui pasaj intalnesc antigenul nonself. Antigenul este adus la nivelul organelor limfoide secundare prin sistemul limfatic de catre celula dendritica (APC); aceasta devine matura dupa achizitia antigenului nonself la nivelul tesuturilor non-limfoide. Desi celula dendritica este cel mai important APC profesional, macrofagele si celulele B sunt de asemenea capabile sa prezinte antigenul. Procesul infectios conduce la o crestere dramatica a CTL patogen/antigen specifice, iar magnitudinea acestui proces depinde de natura infectiei si de inoculul/doza de antigen. Aceasta expansiune este urmata de  contractia CTL efectoare in celule T de memorie. Un procent de 5% din populatia celulelor efectoare expansionate supravietuieste sub forma celulelor de memorie de lunga durata. Este prevenita astfel afectarea tisulara nespecifica ce se poate produce prin activitatea citolitica si eliberarea necontrolata de citokine si este asigurata flexibilitatea CTL de a raspunde la noi infectii.

Productia de celule de memorie antigen independenta de lunga durata este esentiala pentru un raspuns rapid in cazul unei reinfectii. CTL de memorie asigura un raspuns mult mai intens decat celulele CTL naive activate primar, atat din punct de vedere cantitativ cat si calitativ. Deoarece in cursul infectiei primare CTL sufera o expansiune clonala importanta, numarul de precursori CTL antigen specifici este mult mai mare la indivizii imunizati comparativ cu cei naivi, ceea ce permite un raspuns imun mai puternic. CTL de memorie prezinta o eficienta extraordinara in elaborarea functiilor efectoare prin productia rapida de gamma-interferon (IFNγ).

Compartimentul CTL de memorie este compus din doua tipuri celulare: CTL de memorie-efectoare (Tem) si CTL de memorie-centrale (Tcm), acestea din urma fiind capabile de o auto-reinnoire antigen-independenta homeostatica prelungita. La intalnirea cu antigenul, aceste celule dobandesc rapid functia efectoare si fenotipul celulelor Tem. Celulele CD4 si citokinele IL-15, IL-7, IL-2 si GM-CSF (factorul de stimulare al coloniilor pentru granulocite si monocite) au un rol important in supravietuirea si mentinerea rezervei de CTL de memorie (vezi tabelul 17.9.1.2).

In final, activitatea citotoxica a CTL are loc prin doua mecanisme:

• citolitic: dependent de productia de granzime (A, B) si perforine;

• non-citolitic: dependent de productia de citokine (IFNγ si TNF-α) care au capacitatea de a inhiba proliferarea agentilor patogeni intracelulari^11;12.

 Tabel  17.9.1.2 Proprietatile CTL

Celulele NK apartin liniei celulare limfoide si sunt implicate in raspunsul imun innascut. In comparatie cu CTL, celulele NK sunt de talie relativ mare, granulare si nu necesita pre-activare pentru a recunoaste si a liza celule tumorale sau aberante. De asemenea nu au nevoie de prezenta moleculelor MHC I. Aceste celule sunt capabile sa produca cantitati importante de citokine si chemokine, care le permit sa moduleze raspunsul imun. IL-15 este necesara pentru a mentine nivelul homeostatic al celulelor NK in organism, activitatea de „killer” fiind exercitata in acelasi  mod ca si in cazul CTL.

Receptorii celulelor NK sunt clasificati in activatori si inhibitori si apartin la doua familii importante de receptori: killer cell immunoglobulin-like (KIR) si lectin-like. Prin receptorii inhibitori celulele NK recunosc moleculele MHC I de pe suprafata celulei tinta si primesc astfel un semnal inhibitor – no-killing; prin receptorii activatori recunosc liganzi celulari, virali sau indusi de stres, care transmit un semnal activator – pro-killing. In cazul in care o celula tinta nu exprima moleculele MHC I pentru a evita actiunea citolitica a CTL, aceasta va fi distrusa de catre celula NK.

Celulele NK se afla intr-un numar relativ redus la nivelul maduvei osoase si splinei (<2%) si reprezinta aproximativ 15% din numarul total de limfocite din sange. NK sunt de obicei definite prin intermediul unei combinatii de markeri de suprafata celulara (CD): CD3-, CD16+, CD56+. Astfel pot fi clasificate in doua subseturi, in functie de exprimarea CD16 si CD56:

• NKCD56dimCD16bright reprezinta >90% din NK din sangele periferic, exprima nivele mari de KIR si activitate citotoxica/citolitica mare (secretie crescuta de perforine/granzime);

• NKCD56brightCD16dim se caracterizeaza printr-o productie mai mare de citokine, potential proliferativ mai inalt si reprezinta principala populatie celulara NK de la nivelul organelor limfoide secundare^11;12.

Celulele T helper-CD4, in mod similar celulelor TCR+, se diferentiaza la nivelul timusului din celulele progenitoare comune limfoide, in cea mai mare parte in timpul vietii fetale si imediat dupa nastere. Initial, celulele T nu exprima TCR si sunt CD3-/CD4-/CD8- (triplu negative). Etapele de diferentiere timica includ stadiile:

• preTCR CD3+/CD4-/CD8- (dublu negative);

• TCR CD3+/CD4+/CD8+ (dublu pozitive);

• in ultima etapa, celulele T al caror TCR recunoaste antigenul prezentat de moleculele MHC II devin TCR CD3+/CD4+, iar cele al caror TCR recunoaste antigenul prezentat de moleculele MHC I devin TCR CD3+/CD8+.

Celulele T naive, pozitive pentru un singur CD (CD4 sau CD8) parasesc timusul si recircula din sange in ariile timus-dependente (TDA) ale organelor limfoide secundare. In majoritatea raspunsurilor imune, activarea celulelor T CD4+ are loc in TDA ale organelor limfoide secundare, iar celulele prezentatoare de antigen sunt reprezentate de celulele dendritice. Prezentarea eficienta a antigenului non-self stimuleaza activarea, proliferarea si diferentierea limfocitelor CD4+ in trei categorii functionale: celule CD4+ cu activitate  proinflamatorie, celule CD4+ cu activitate reglatoare/antiinflamatorie si celule CD4+ ce functioneaza ca celule de memorie. Diferentierea dintre celulele T naive, efectoare si de memorie se face baza moleculelor exprimate pe suprafata lor (vezi tabelul 17.9.1.3).

Celulele CD4+ efectoare sunt cele care sustin procesele inflamatorii prin eliberarea de citokine, fiind divizate in trei categorii: Th1 , Th2, Th17^11;12.

Celulele T reglatoare (Treg)

Pentru a preveni raspunsurile imune auto-distructive si a permite cele protective impotriva antigenelor non-self, sistemul imun a dezvoltat o serie de mecanisme reglatoare care au rolul de a inhiba generarea de limfocite T si B self-reactive potential daunatoare – toleranta imuna centrala - si de a scadea activarea celulara si expansiunea limfocitelor atunci cand acestea intalnesc antigene self – toleranta imuna periferica.

Au fost descrise mai multe tipuri de celule T cu activitate reglatoare: celule T TCRγδ +, celule NK, limfocite T CD8+ si limfocite T CD4+.

Celulele T CD4+ reg pot fi divizate in doua categorii: celulele Treg care apar natural (generate in timus) si celulele Treg induse (Treg 1 care secreta IL-10, Th3 care secreta TGFβ), diferentiate din celulele T naive. Celulele T CD4+ reg  derivate din timus sunt CD25+ si se gasesc intr-un procent de 30%, insa doar 2-4% din celule Treg CD25high+ au proprietati supresive. Un alt marker important este factorul de transcriptie FOXP3 care este exprimat in mod specific la nivelul celulele Treg timic derivate. Majoritatea celulelor FOXP3 + sunt celule CD4+CD25 bright+ si doar cateva sunt celule CD25- si CD25 low+¹¹.

Celulele T de memorie

Nivelul protectiei imune se coreleaza cu numarul de celule T de memorie antigen specifice. In cursul infectiei primare exista o expansiune importanta a rezervei de celule T CD4+ si celule T CD8+ specifice antigenului patogen. Numeroase studii demonstreaza faptul ca marimea rezervei de celule T de memorie depinde de marimea „exploziei” de celule T antigen specifice din timpul fazei de expansiune. Celulele T de memorie pot fi clasificate in: celule T centrale de memorie si celule T efectoare de memorie.

Trebuie retinut ca celulele T de memorie pot prolifera si produce citokine ca raspuns la o stimulare cu o cantitate mai mica de antigen, cu o costimulare mai slaba si mult mai rapid comparativ cu celulele T naive. In plus, ele pot promova si intensifica functia APC si accelera activitatea celulelor T naive.

In absenta stimularii antigenice, celule T de memorie pot suferi o proliferare homeostatica pentru a isi reface rezerva. Celulele T de memorie CD4+ si CD8+ isi pot pastra responsivitatea lor rapida in absenta stimulului antigenic si sunt capabile sa confere o imunitate protectiva^11;12.

Tabel 17.9.1.3  Markeri pentru diferentierea celulelor T

H = exprimare marcata; L= exprimare slaba                                                              

Infectia HIV

Virusul imunodeficientei umane este un retrovirus si celulele tinta sunt limfocitele T helper CD4+. Aceste celule reprezinta elementul central in raspunsul imun al gazdei fata de infectia HIV, intervin in raspunsul imun umoral prin activarea limfocitelor B care vor secreta anticorpi impotriva peptidelor virale HIV si in raspunsul imun mediat celular prin activarea limfocitelor citotoxice⁷.

Intelegerea relatiei complexe care se stabileste intre fenotipul proteinei Env HIV (gp160), expresia coreceptorilor de pe suprafata celulelor CD4+ (CCR5, CXCR4) si dezvoltarea raspunsului imun adaptativ ajuta la intelegerea patogenezei indusa de HIV. Prin clivarea GP160 rezulta GP120 si GP41. GP120 actioneaza ca un ligand, atasandu-se de moleculele CD4 si coreceptorii CCXR4 si CCR5, iar GP41 mediaza procesul de fuziune dintre invelisul HIV si membrana celulei gazda.

Studii recente demonstreaza afectarea timpurie in cadrul infectei HIV a celulelor T cu memorie de la nivelul tesutului limfoid asociat tubului digestiv (GALT). Astfel, intr-o perioada scurta de timp de de la infectie, 20% din celulele GALT CD4T sunt infectate si, dintre acestea, 80% sunt distruse prin citotoxicitate directa mediata de virus sau apoptoza Fas-mediata. In momentul atingerii nivelului maxim de viremie ~ 60% din celulele T CD4 de memorie sunt infectate. Trebuie mentionat faptul ca majoritatea celulelor T CD4 rezida la nivelul GALT, iar numarul acestor celule aflate in circulatie nu reflecta magnitudinea distructiei limfocitelor T la nivel digestiv. In lumina acestor date noi s-ar putea presupune ca acea crestere initiala a incarcaturii virale reprezinta proliferarea exagerata si infectarea celulelor GALT CD4T, iar scaderea ulterioara a incarcaturii virale pana la o anumita valoare de platou indica depletia majoritatii celulelor T CD4+ din organism².

Evolutia naturala a infectiei HIV cunoaste 4 stadii/faze (vezi figura 17.9.1.1):

 1. Sindromul retroviral acut se intalneste pe o perioada de cateva zile pana la 6 saptamani de la infectie si se caracterizeaza printr-o viremie foarte mare (de exemplu, 10 milioane copii/mL) si scaderea rapida a celulelor T CD4+ si CD8+ din circulatia periferica.

2. Stadiul asimptomatic se caracterizeaza prin scaderea viremiei pana la o anumita valoare de „platou’’ si se considera ca acest nivel de platou reprezinta un echilibru intre abilitatea virusului de a se replica si a distruge celulele CD4+ si abilitatea raspunsului imun al gazdei (celular si umoral) de a suprima replicarea virala. In medie, perioada de latenta clinica care urmeaza infectiei active dureaza 7–10 ani (T CD4 >500 celule/μL).

 3. Stadiul simptomatic al infectiei HIV – Pre SIDA (T CD4+ 500 – 200 celule/μL).

 4. Stadiul final al infectiei HIV – SIDA - se caracterizeaza prin scaderea celulelor T CD4+ <200 celule/μL (<14%).

In cursul terapiei HAART, cresterea celulelor T CD4+ are loc in primele 3–6 luni si este rezultatul scaderii activarii imune si a migrarii consecutive a celulelor T de memorie (CD4+CD45RO+) in afara organelor limfoide; o crestere mult mai accentuata are loc dupa 3–5 ani de terapie prin aparitia de celule T naive noi (CD4+CD45RA+CD62L+) si de memorie.

In concluzie, depletia celulelor T CD4+ reprezinta principalul marker de afectare imunologica cauzata de infectia HIV si de evolutie spre stadiul SIDA¹¹.

Fig. 17.9.1.1 Evolutia naturala a infectiei HIV

(Adaptare dupa http://mcb.berkeley.edu/courses)¹⁰

Profilul imun de baza si recomandari pentru efectuarea acestui test

In cadrul profilului de baza sunt determinate atat procentual cat si in valoare absoluta principalele subseturi de limfocite implicate in raspunsul imun, prin identificarea markerilor de suprafata specifici (moleculele CD):

-limfocitele T totale (CD3+);

-limfocitele T helper (CD3+/CD4+);

-limfocitele T supresoare/citotoxice (CD3+/CD8+);

-raportul CD4+/CD8+;

-limfocitele T imature CD3+/CD8+/CD4+ ;

-limfocitele B (CD19+);

-celulele NK (CD3-/CD16+/CD56+);

-limfocitele T activate (HLA DR+/CD3+).

Profilul de baza este suficient pentru excluderea defectelor imune celulare cantitative⁵.

Determinarea subseturilor limfocitare este utila atat pentru clasificarea si diagnosticul imunodeficientelor primare cat si pentru evaluarea si monitorizarea pacientilor cu infectie HIV^6;8.

Imunodeficientele primare rezulta ca urmare a unor defecte congenitale ale sistemului imun. Acest test stabileste daca anumite subseturi limfocitare sunt reduse sau absente pentru a sustine diagnosticul de imunodeficienta celulara numerica. Imunodeficientele cauzate de disfunctii celulare pot fi detectate prin testul de transformare limfoblastica (LTT)⁶.

Imunodeficientele datorate generarii defectuoase a limfocitelor T (de exemplu, sindromul DiGeorge) se caracterizeaza prin pierderea completa sau reducerea limfocitelor T CD3+.

Defectele genetice ale complexului major de histocompatibilitate MHC clasa II determina o stare de imunodeficienta grava – deficitul MHC II (conform OMS). Mai este denumit si sindromul limfocitelor goale tip II si se caracterizeaza prin absenta expresiei moleculelor MHC II de pe suprafata celulara. “Instructajul” timic si selectarea limfocitelor T imature sunt compromise datorita lipsei de procesare a antigenului de catre moleculele MHC II. Cantitatea totala de limfocite B si T in sange este normala, insa numarul limfocitelor CD4+ este redus ca urmare a absentei  unei procesari adecvate a antigenului. Acesti pacienti nu pot raspunde la antigenele straine si prezinta infectii bacteriene, virale, fungice si parazitare recurente; nu raspund la testele cutanate, au o capacitate redusa de a raspunde la reactiile limfocitare mixte si prezinta panhipogammaglobulinemie. Defectul nu este localizat la nivelul genelor MHC II ci la una din cele patru gene care codifica factorii reglatori esentiali pentru exprimarea moleculelor MHC II⁴.

In cazul pacientilor cu infectie HIV determinarea limfocitelor T CD4+ este utila pentru stadializarea infectiei HIV (conform CDC), stabilirea momentului inceperii terapiei antiretrovirale precum si a terapiei impotriva infectiilor oportuniste, pentru monitorizarea progresiei bolii si a raspunsului la tratament. Astfel, terapia antiretrovirala este adesa initiata in momentul in care numarul absolut de celule CD4+ <500/μL; in cazul in care celulele CD4+ <200/μL se incepe tratamentul profilactic impotriva pneumoniei cu Pneumocistis jiroveci si a altor oportunisti; in cazul in care celulele CD4+ <100/μL se recomanda profilaxia infectiilor produse de complexul Mycobacterium avium¹.

Programele actuale recomanda monitorizarea nivelului celulelor CD4+ la un interval de 3-6 luni, pentru toti pacientii cu infectie HIV^1;6;8.

Specimen recoltat - sange venos⁵. 

Recipient de recoltare - vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant⁵.

Volum proba – 5 mL sange³.

Stabilitate proba - sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei⁵.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate⁵.

Metoda - citometrie in flux⁵.

Valori de referinta si comunicarea rezultatelor

Buletinul final va contine intervalele de referinta pentru subseturile limfocitare adecvate varstei pacientului  impreuna cu o interpretare a rezultatelor obtinute⁵.

Trebuie cunoscut faptul ca numarul absolut al populatiilor limfocitare este influentat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatura si mediul inconjurator. Studiile legate de variatiile circadiane au demonstrat o crestere progresiva a numarului de celule CD4+ in cursul zilei, in timp ce limfocitele CD8+ si limfocitele B CD19+ cresc doar in prima parte a zilei, fara a se modifica in cursul dupa-amiezei. Din acest motiv, atunci cand se efectueaza o monitorizare seriata a populatiilor limfocitare se recomanda ca probele de sange sa se recolteze in acelasi moment al zilei⁸.

Bibliografie

1. ARUP Laboratories. Test Directory: Lymphocyte Subset Panel 5 – Total Lymphocyte Enumeration. www.aruplab.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

2. Christopher S. Baliga, Mary E. Paul, Javier Chinen, William T. Shearer. HIV Infection and Acquired Immunodeficiency Syndrome. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 571-582.

3. Kenneth Todar. Immune Defense against Bacterial Pathogens: Adaptive or Acquired Immunity. In Todar’s Online Textbook of Bacteriology. www.textbookofbacteriology.net/adaptive. Reference Type: Internet Communication.

4. Kimberley W. Sanford, Susan D. Roseff. Immunodeficiency Disorders. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods- Sauders Elsevier 21-Ed 2007, 906-913.

5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

6. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. T- and B-Lymphocyte Differential Profile. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication

7. Marie-Dominique Franco. Immunology, HIV and AIDS. http://www.biol.sc.edu/courses. Ref Type: Internet Communication.

8. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication

9. Paul A. Linnemeyer. The Immune System – An Overview, 2008. www.the body.com. Ref Type: Internet Communication.

10. Prof. Schlissel. The Immunology of HIV Infection and AIDS. http://mcb.berkeley.edu/courses. Ref Type: Internet Communication.

11. Robert R. Rich, Thomas A. Fleisher. William T. Shearer, Harry W. Schroeder, Anthony J. Frew, Cornelia M. Weyand. Fundamental Principles of the Immune Response. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 3-127.

12. Shane Crotty, Rafi Ahmed. Immunological Memory. In Topley & Wilson Microbiology & Microbial Infections, Immunology, Hodder Arnold, 10th Edition, 2005, 487-503.

Transformarea neoplazica a unei celule reprezinta prima etapa din istoria naturala a cancerului. Celula tumorala odata aparuta determina, prin diviziuni successive, formarea unei clone celulare si in final constituirea tesutului tumoral, cu exprimarea principalelor caracteristici ale fenotipului malign si anume : proliferarea excesiva si infinita, migrarea anormala si instabilitatea genetica¹.

La adult leziunea canceroasa reprezinta, in cele mai multe cazuri, stadiul final al unei inflamatii cronice (de exemplu, fumatul se asociaza cu neoplasmul pulmonar, radiatiile solare cu cancerul cutanat), pe cand la copil este rezultatul unei instabilitati genomice progresive, innascuta sau datorata unor leziuni genetice dobandite. Tumorile pediatrice sunt sarace in celule ale imunitatii dobandite (celule T si celule dendritice mieloide)⁶.

Problema existentei cu adevarat a imunovigilentei in cazul tumorilor nu este inca rezolvata. In timp ce in cazul bacteriilor si a virusurilor, care exprima o varietate de proteine straine, sistemul imun poate recunoaste si controla efectiv infectia, in cazul celulelor tumorale, care difera foarte putin de cele normale, raspunsul imun nu mai are aceeasi eficienta².

Antigenele tumorale

In mod ideal, pentru a fi recunoscute ca straine de catre sistemul imun, ar trebui ca antigenele tumorale sa fie exprimate doar de celulele tumorale, nu si de cele normale. In realitate majoritatea antigenelor tumorale sunt putin imunogene, fiind slab exprimate si foarte heterogene. In acelasi timp exista si antigene supraexprimate la nivelul celulei tumorale dar care se gasesc de asemenea in cantitati mici in celulele normale².

Antigenele tumorale recunoscute de limfocitele efectoare au fost clasificate astfel:

 - antigene straine organismului (specific tumorale): molecule ce sunt expresia unor gene mutante, oncogene virale, molecule ce prezinta modificari post-translationale anormale (de exemplu, MUC1- underglycosylated mucin). In cazul acestor proteine mutante doar cateva peptide pot fi potential recunoscute ca straine organismului.

- self-antigene: antigene testiculare, antigene de diferentiere care se exprima doar in anumite tipuri de tesuturi (de exemplu, antigenele de diferentiere exprimate de melanocite si celule melanomatoase implicate in producerea de melanina), antigene supraexprimate de celulele tumorale comparativ cu statusul lor normal (de exemplu, – tirozinaza exprimata in mod normal de toate melanocitele apare in concentratii crescute in celulele melanomatoase); celulele T cu specificitate pentru tirozinaza, ce recunosc si distrug celulele tumorale, pot fi gasite in sangele unor pacienti cu melanom; aceste celule T sunt responsabile de depigmentarea pielii (vitiligo) la acesti pacienti, fapt ce se asociaza cu un prognostic bun; – antigenele fetale (AFP si CEA) prezente in tumori ale ficatului, gonadelor si in diverse adenocarcinoame se gasesc in cantitati crescute in timpul dezvoltarii fetale dar sunt putin exprimate in mod normal la adult; aceste oncogene fetale sunt folosite ca markeri de progresie tumorala; – HER-2/neu , cunoscut ca si c-Erb-2 (receptor tirozin-kinazic omolog cu receptorul factorului de crestere epidermal). Raspunsul fata de toate aceste antigene consta in celule efectoare CD4+ si/sau CD8+^1;2.

Mecanisme de evaziune a apararii imune in cancer

Formatiunile tumorale au proprietatea de a fi tolerate de sistemul imun prin exprimarea unor factori care influenteaza negativ raspunsul imun al organismului.

Exista o serie de motive pentru absenta unui raspuns imun eficace in cazul tumorilor. Fiecare proteina autologa este degradata in citoplasma pana la peptide formate din 9-12 aminoacizi. Aceste peptide sunt transportate de catre un sistem numit  „tranporter associated with antigen processing (TAP)” la reticulul endoplasmic unde sunt legate de moleculele MCH clasa I si prezentate celulelor T CD8+².

In cazul tumorilor, peptidele nu  se “potrivesc” mereu la locul de legare pe moleculele MCH clasa I. Existenta unui mecanism defectuos de procesare a antigenelor la nivelul celulei tumorale (de exemplu, deficitul de TAP) face ca peptidele tumorale sa nu fie transportate la nivelul reticulului endoplasmic si sa nu fie prezentate la suprafata celulei. In multe cazuri diminuarea moleculelor MCH clasa I si II pe suprafata celulelor tumorale impiedica recunoasterea acestora de catre limfocitele T si astfel raspunsul imun nu poate fi declansat^2;6.

Celulele tumorale nu pot fi considerate adevarate celule prezentatoare de antigen, deoarece le lipsesc molecule co-stimulatoare importante, CD80 si CD86, necesare pentru activarea celulelor T. In absenta co-stimularii, prezentarea peptidelor via complex MCH/TCR, duce la anergia celulelor T si toleranta.

Unele celule tumorale sunt de asemenea capabile de a stopa producerea de antigene tumorale  evitand astfel raspunsul imun. De asemenea tumorile pot produce substante imunosupresive asa cum sunt IL-10, TGFβ (transforming growth factor beta), prostaglandine, iar in unele cazuri  celulele tumorale pot exprima molecule MCH I-like ce interactioneaza cu liganzii inhibitori aflati pe celulele T, ducand in final la anergia/apoptoza celulelor T².

Asemanator virusurilor (HIV, HCV), tumorile solide sunt caracterizate prin instabilitate genomica ceea ce conduce la generarea unor neoepitopi identificati potential de moleculele MCH clasa I si II³.

In ultima decada s-a observat un interes crescut fata de  mecanismul dominant de toleranta mediat de celulele T reglatoare – Tregs (CD4+CD25+), ce par sa joace un rol important in autoreactivitate, alergii, infectii si transplant, controland atat raspunsul imun innascut cat si pe cel dobandit, limitand astfel autoimunitatea si imunopatologia. Selectia acestor celule are loc in mod natural in timus – natural T regulatory cells (nTreg), dar pot fi induse si in periferie – induced Treg cells (iTreg). Efectul supresor al celulelor Treg asupra raspunsului imun tumoral este bine documentat. Astfel studiile efectuate pe soareci arata ca indepartarea celulelor Treg favorizeaza rejetul celulelor tumorale putand chiar sa previna dezvoltarea acestora in vivo, atat la soarecii „predispusi la cancer” cat si dupa tratamentul cu agenti chimici. In studiile efectuate pe pacienti cu cancer s-a observat prezenta mult mai frecventa a celulelor Treg in populatia limfocitara periferica decat la persoanele sanatoase. Exista de asemenea rapoarte din care reiese faptul ca nivelele crescute de Treg se coreleaza cu un stadiu avansat al bolii, fiind implicate astfel in progresia cancerului. Infiltrarea cu celule T reglatorii este de asemenea prezenta si in statiile ganglionare metastazate, nu si in cele fara metastaze^1;3.

Mecanisme efectoare ale imunitatii

La adult, raspunsul imun innascut are rolul de a recunoaste celulele “stresate” sau continutul celular nedigerat atunci cand celulele devin nonapoptotice sau nonautofagocitice.

Raspunsul imun adaptativ (dobandit) joaca un rol crucial, fiind o sursa bogata de celule T efectoare CD4 si CD8 cu rol in recunoasterea proteinelor aberante ce apar la nivelul tumorii, in acelasi timp reprezentand sursa unor celule regulatoare si a unor factori cu rol important in limitarea abilitatii celulelor NK si a celulelor T de a media eradicarea cancerului⁶. 

Modul in care diferitele tipuri de celule implicate in generarea raspunsului imun influenteaza in sens pozitiv sau negativ cresterea tumorala este prezentat in tabelul urmator¹:

Imunofenotipare limfocitara – profil tumoral si recomandari pentru efectuarea acestui test

In cadrul profilului tumoral sunt determinate atat procentual cat si in valoare absoluta urmatoarele subseturi de limfocite, prin identificarea markerilor de suprafata specifici (moleculele CD):

• limfocitele T totale (CD3+);
• celulele T naive CD45RA+, celulele T de memorie CD45RA- ;
• celule CD31+ (rezerva timica);
• limfocitele T helper (CD3+/CD4+);
• celule Treg (CD25++/CD127-);
• celule T CD8+, celule T CD8+/CD28+ (citotoxice),  celule T CD8+/CD28- (reglatoare);
• raport CD4+/CD8+;
• celule  T imature (CD4+/CD8+);
• celule T activate ( CD3+/HLA DR+);
• celule B (CD19+)
• celule NK (CD16+/CD56+) si NK activate.

Testul este indicat pentru monitorizarea statusului imun la pacienti cu diverse afectiuni maligne, mai ales daca sunt aplicate tratamente de imunostimulare⁴.

In cursul evolutiei neoplaziilor, se instaleaza constant un status de imunodeficienta (ce trebuie urmarit in dinamica) de intensitate diferita in functie de tipul tumorii, stadiul procesului malign si mijloacele de aparare ale organismului⁹.

Celulele T naive CD4+CD31+  reprezinta o subpopulatie a celulelor T CD4+ naive  recent eliberate din timus.

Statusul „CD28” diferentiaza limfocitele CD8 cu proprietati citotoxice. Numarul celulelor T citotoxice nu da informatii despre functia lor, acest lucru fiind posibil prin teste functionale (teste de citotoxicitate)⁴.

Celulele T CD8+ pot fi impartite in functie de expresia pe suprafata lor a receptorului co-stimulator CD28 in CD28+ ( aproximativ 50% din celulele CD8+) si CD28-, fiecare din cele doua populatii limfocitare avand proprietati biologice si secretoare diferite.

Populatia de celule T CD28+ predomina la indivizii sanatosi si prolifereaza in timpul infectiilor virale primare.

S-a observat ca celulele T reglatorii CD8+ CD28-  sunt prezente aproape constant in infiltratul limfocitar tumoral, fiind un potent factor supresor fata de raspunsul imun, putand inhiba, prin intermediul IL 10, atat proliferarea celulelor T cat si citotoxicitatea specifica anti-tumorala^3;8.

Celulele T CD8+ CD28- sunt prezente in procent mai mare in sangele periferic al bolnavilor de cancer decat la voluntarii sanatosi.

Superfamilia CD28 este formata din molecule receptoare cu actiune co-stimulatoare (CD28 si costimulatorul inductibil – ICOS) sau inhibitoare (CTLA-4, PD-1 si BTLA) asupra celulelor T. CD28 si CTLA-4 sunt receptori specifici ai celulelor T pe cand BTLA si PD-1 sunt exprimate si pe celulele B, iar ICOS pe celulele NK.  Activarea sau inhibarea celulelor T ca raspuns la un stimul antigenic necesita doua semnale din partea celulelor prezentatoare de antigen (APC). Primul semnal este reprezentat de antigenul exprimat de APC sub forma peptidelor legate de moleculele MCH, care se leaga de TCR. Recunoasterea antigenului de catre receptorii celulei T asigura specificitatea raspunsului. Al doilea semnal, co-stimulator sau inhibitor, este asigurat de interactiunea unor anumiti receptori ai celulelor T cu liganzii corespunzatori de la suprafata APC. CD28 este considerat prototipul receptorului co-stimulator. Se considera ca CD28 este prezent pe aproape toate celulele T CD4+ si doar pe jumatate din celulele CD8+. In absenta co-stimularii semnalele venite de la TCR pot induce anergia celulelor T. In prezenta celor doua semnale are loc producerea de citokine (de ex. IL2) ca si poliferarea, diferentierea si supravietuirea celulelor T.

De mentionat este faptul ca  atat CD28 cat si CTLA-4 se leaga de aceeasi liganzi (CD80 si CD86) pe suprafata APC. CTLA-4 inhiba productia de IL2 si proliferarea celulelor T, fiind implicat in inductia si mentinerea tolerantei⁷.

Specimen recoltat - sange venos⁴. 

Recipient de recoltare - vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant⁴.

Volum proba – 5 mL sange⁴.

Stabilitate proba - sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei⁴.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate⁴.

Metoda - citometrie in flux⁴.

Valori de referinta, comunicarea si interpretarea rezultatelor

Buletinul final va contine intervalele de referinta pentru subseturile limfocitare adecvate varstei pacientului  impreuna cu o interpretare a rezultatelor obtinute⁴.

Trebuie cunoscut faptul ca numarul absolut al populatiilor limfocitare este influentat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatura si mediul inconjurator. Studiile legate de variatiile circadiane au demonstrat o crestere progresiva a numarului de celule CD4+ in cursul zilei, in timp ce limfocitele CD8+ si limfocitele B CD19+ cresc doar in prima parte a zilei, fara a se modifica in cursul dupa-amiezei. Din acest motiv, atunci cand se efectueaza o monitorizare seriata a populatiilor limfocitare se recomanda ca probele de sange sa se recolteze in acelasi moment al zilei⁵.

Orientativ, prezentam cateva modele patologice de imunofenotipare associate unor afectiuni maligne:

-epiteliom al buzei (operabil): scaderea valorilor procentuale pentru celulele T totale (CD3+), T activate ( CD3+/HLA DR+) si NK ( CD16+/CD56+);

-adenocarcinom de col uterin (stadiul I – II) : scaderea proportiei  de celule T CD8+ (probabil T citolitice) si, inconstant, scaderea celulelor NK (CD16+/CD56+);

-adenocarcinom mamar (stadiul II): limfopenie, scaderea celulelor T totale (CD3+), B totale (CD19+), scaderea raportului CD4+/CD8+,  cresterea celulelor T CD8+ (probabil T supresoare);

-adenocarcinom pulmonar (operabil): limfopenie, scaderea celulelor T totale (CD3+), T activate (CD3+/HLA DR+), inconstant scaderea celulelor B (CD19+)⁹.

Cresterea  celulelor T reglatoare in cursul terapiei imunostimulatoare este nefavorabila, datorita  proprietatilor imunosupresoare ale acestora⁴.

Bibliografie

1. AM Gallimore and AK Simon. Positive and negative influences of regulatory T cells on tumor immunity. In Oncogene (2008) 27, 5886-5893.

2. Gerd-Rudiger Burmester, Antonio Pezzutto. Tumor Immunology. In Color Atlas of Immunology .Thieme 2003, 150-154.

3. Gilberto Filaci et al. CD8+CD28-T regulatory lymphocytes inhibiting T cell proliferative and cytotoxic function infiltrate human cancers. In The Journal of Immunology,2007,179,4323 – 4334

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog

5. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication

6. Michael T Lotze, Markus Y Mapara, Carl H June. Tumor immunology and immunotherapy. In Clinical Immunology. Principles and Practice, , Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 1181-1199

7. Raul M.Torres,John Imboden,Harry W.Schroeder Jr. Antigen receptor genes, gene products, and co-receptors. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 74-75.

8. Simona Fiorentini et al. CD11b expression identifies CD8+CD28+T lzmphocytes with phenotype and function of both naïve/memory and effector cells. The Journal of Immunology,2001,166, 900 – 907

9. Voiculescu C et al. Aplicatiile imunofenotiparii prin citometrie in flux in imunodiagnosticul si monitorizarea unor afectiuni umane. In Citometria de flux in medicina clinica si experimentala, Ed Acad Rom, Buc, 1996, 109-113.

Mecanismele autoimunitatii

Afectiunile autoimune apar frecvent (afecteaza mai mult de 5% din indivizi), avand un impact semnificativ asupra morbiditatii si mortalitatii in populatia umana. Bolile autoimune sunt definite ca afectiuni in care raspunsul imun fata de anumite autoantigene sta la baza afectarii tisulare ce apare in aceste situatii.

Bolile autoimune pot fi atat specifice fata de un anumit tip de tesut (de exemplu, tiroida, celulele β pancreatice), cat si sistemice, afectand tesuturi multiple. Complexitatea acestor afectiuni este foarte mare, acestea avand implicatii genetice, fenotipice si kinetice. Adesea exista o perioada lunga de timp (saptamani sau luni) intre debutul simptomelor si aparitia fenotipului diagnostic, expresia bolii putand varia in timp la acelasi individ. In ciuda acestei complexitati exista o legatura stransa intre fenotipul clinic si tintele raspunsului autoimun, ceea ce a facut ca autoanticorpii sa fie folositi pentru diagnostic si prognostic (de exemplu, anticorpii anti-tiroid peroxidaza in tiroidita autoimuna, anticorpii anti-Sm pentru LES, anticorpii anti-topoizomeraza-1 in formele difuze de sclerodermie).

Raspunsul imun are caracterul imunitatii dobandite (care in mod normal este directionata impotriva antigenelor exogene) la care tinta este reprezentata de autoantigene. Substratul molecular este reprezentat de afectarea discriminarii intre self si nonself, mecanism ce poate fi mediat atat de anticorpi cat si de celulele T, dar asocierea frecventa cu  un anumit tip de HLA sugereaza ca in patogeneza acestor afectiuni este de obicei implicat mecanismul discriminarii self/nonself mediat de celulele T.

Etapele dezvoltarii autoimunitatii

Caracteristicele autoanticorpilor in afectiunile autoimune:

- unii anticorpi preced cu mult timp (ani) aparitia simptomelor (de exemplu, anticorpii antinucleari, antifosfolipidici si, in mai mica masura, anti-DNA in LES, anticorpii anti-CCP in artrita reumatoida);

- unii anticorpi apar cu putin timp inainte de debutul manifestarilor bolii (de exemplu, anti-Sm si anti-RNP in LES);

- in anumite situatii exista o asociere stransa intre autoanticorpii specifici si fenotipul clinic (de exemplu, anticorpii anti-topoizomeraza-1 sunt asociati cu sclerodermia difuza si boala pulmonara interstitiala).

Studiile efectuate cu privire la momentul aparitiei autoanticorpilor in LES fata de debutul simptomelor au dus la incadrarea lor in doua grupe, astfel: markeri de initiere a bolii (cei cu aparitie precoce) si markeri de propagere a bolii (cei asociati cu boala clinica).

Ca urmare, se considera ca boala autoimuna evolueaza in patru etape:

1. Susceptibilitatea – apare inaintea bolii si rezulta dintr-un complex de evenimente care vor permite ulterior manifestarea autoreactivitatii, prin afectarea echilibrului imun. Susceptibilitatea presupune urmatoarele mecanisme:

• inductia incompleta a tolerantei in timus fata de autoantigenele exprimate in periferie (de exemplu, deficitul de AIRE – “autoimun regulator” – reprezinta cauza sindromului poliendocrin autoimun tip I);

• afectarea mecanismelor de clearance a celulelor apoptotice si de producere a citokinelor anti-inflamatorii ce au ca rezultat inducerea tolerantei (de exemplu, deficitul de C1q, C4, MFG-E8, Mer);

• producerea defectiva a celulelor Treg (deficitul de FOXP3);

• alterarea mecanismelor de semnalizare imuna (de exemplu, polimorfismul CTLA-4, polimorfismul PTPN22).

Susceptibilitatea poate fi ereditara sau dobandita (in multe afectiuni se intalnesc ambele situatii), permanenta sau tranzitorie.

2. Initierea –  este marcata prin prezenta raspunsului autoimun care precede diagnosticul fenotipic clinic (de exemplu, anticorpii antifosfolipidici in LES). Se caracterizeaza prin concentratie crescuta de autoantigene, prezenta de structuri netolerate, existenta unui context proimun (infectii, malignitati, expunerea la adjuvanti).

Mecanisme care pot altera procesarea antigenelor ducand la expunerea unor epitopi criptici:

-  modificarea procesarii autoantigenelor prin cresterea afinitatii de legare fata de un ligand sau un anticorp;

- existenta unor mecanisme proteolitice distincte in timus si in periferie sau modificari diferentiale ale activitatii proteolitice;

- evenimente proteolitice noi care nu sunt prezente in mod normal la nivelul APC, de exemplu, clivaje noi ce apar in cursul proceselor de distructie/afectare celulara sau in inflamatie;

- forme noi de autoantigene rezultate prin mutatii, trunchieri sau splitari, modificari ce apar in cursul afectiunilor maligne (de exemplu, asocierea melanom-vitiligo sau aparitia afectiunilor neurologice paraneoplazice autoimune).

Inducerea autoimunitatii prin mimetism molecular

Conform acestei ipoteze, un anumit antigen – viral sau bacterian – prezinta importante similaritati cu structurile endogene. In cazul unei infectii cu un asemenea antigen, organismul va reactiona atat impotriva moleculelor straine cat si a celor endogene.

3. Propagarea – corespunde cu debutul bolii clinice si prezinta urmatoarele caracteristici: achizitia de proprietati adjuvante de catre autoantigenele tinta; cresterea expresiei autoantigenelor in tesutul afectat; caile efectoare ale imunitatii genereaza/expun autoantigene care intretin mai departe raspunsul imun (de exemplu, anti-Sm in LES).

4. Rezolutia – in multe cazuri are loc activarea mecanismelor imunoreglatorii (inca din faza de propagare a bolii) care vor stopa in mod natural evolutia bolii in timp².

Lupusul eritematos sistemic (LES)

LES este o afectiune autoimuna caracterizata prin productia de autoanticorpi si prin existenta unui spectru larg de manifestari clinice. Afecteaza mai ales femeile aflate in perioada fertila.

Urmatoarele elemente pot  contribui la  aparitia autoimunitatii:

- factorii genetici;

- pierderea tolerantei periferice prin anomalii la nivelul limfocitelor B,T si a celulelor dendritice;

- factori hormonali;

- factori de mediu.

Astfel, pe langa modificarile imunologice ce apar in LES, cum ar fi disfunctii ale sistemului complementului, modificarile de interactiune intre limfocitele B si T sau cele aparute in procesul de fagocitoza, hiperactivitatea celulelor B reprezinta o trasatura centrala a acestei boli. Prin urmare, studierea anomaliilor ce apar in biologia celulelor B este esentiala pentru descifrarea patogenezei in lupus. Au fost rapotate, de exemplu, secretia spontana de imunoglobuline de catre limfocitele periferice; expresia aberanta a unor receptori sau activarea cailor de semnalizare ce controleaza diferentierea si proliferarea celulelor B, productia de anticorpi si apoptoza; expresia anormala a unor factori – cum ar fi BAFF/BLyS, IL 10 si factorul solubil CD154 -  implicati in activarea si diferentierea celulelor B ce au fost identificati atat la pacientii cu LES cat si pe modelele animale¹.

Deoarece limfocitele joaca un rol impotant in raspunsul imun alterat din LES, determinarea diferitelor subpopulatii limfocitare este utila in monitorizarea activitatii bolii.

Celulele B CD19+/CD27++

CD27 este un marker util pentru diferentierea subseturilor de celule B din periferie. Astfel celulele B din periferie pot fi impartite in trei subgrupe: celule B naive (CD19+/CD27-), celule B de memorie (CD19+/ CD27+ sau CD19+/CD27 dim) si plasmocite (CD19+/ CD 27++ sau CD19+/ CD27 high). Plasmocitele prezinta nivele mai crescute ale CD27 decat celulele B de memorie. In mod special, procentul de plasmocite (CD19+/CD27++) este crescut la pacientii cu lupus, atat la copii cat si la adulti, corelandu-se pozitiv cu indexul de activitate al bolii (SLEDAI ≥ 8 ) si cu titrul de anticorpi anti-ADN dublu catenar. Cu toate acestea valori semnificativ crescute ale celulelor CD27high au fost observate si la pacientii anti-ADN dublu catenar negativi dar care erau pozitivi pentru alti autoanticorpi (anti-Sm, anti-La, anti-Ro, antihistone). In acelasi timp procentul de celule B naive si celule B de memorie este scazut. Ca urmare a terapiei imunosupresoare conventionale, celulele B naive CD27- si plasmocitele CD27++ sunt marcat reduse, in schimb celulele B de memorie CD27+ nu sunt afectate. Acest lucru sugereaza ca recaderile ar putea avea legatura cu retentia de celule de memorie CD27+. Studiile au aratat ca subseturile de limfocite B circulante nu sunt influentate de varsta sau de sex, dar par a fi influentate de durata bolii (s-a observat cresterea numarului de celule CD27 high si scaderea numarului de celule B naive CD27- de-a lungul timpului)^1;6;9.

Celulele B CD19+/CD5+

Populatia de celule B din periferie poate fi impartita in doua compartimente (B1 si B2) in functie de expresia diferita a moleculelor de suprafata IgD, CD5, CD11b/CD18, CD23 si CD45. Celulele B conventionale  (celulele B2) exprima pe suprafata lor nivele crescute de IgM si IgD, pe cand celulele B1 prezinta o expresie minima pe suprafata lor pentru IgD, CD45 si virtual absenta pentru CD23. In schimb, toate celulele B1 exprima CD5 ARNm, dar nu toate prezinta pe suprafata lor CD5. Din acest motiv, celulele B1 pot fi impartite, in functie de expresia pe suprafata lor a moleculei CD5, in doua subpopulatii: B1a (CD5+) si B1b (CD5-). Se pare ca celulele B1 deriva din progenitori distincti fata de cei ai celulelor B2, ce reprezinta majoritatea celulelor B in timpul vietii fetale. Astfel, toate celulele B din ficatul fetal murin sunt de tip B1 pe cand in splina fetala murina proportia lor este de 40-60%. La animalele adulte celulele B1 reprezinta mai putin de 10% din celulele splenice B IgM+. Celulele B1 se gasesc din abundenta in cavitatea peritoneala.

Studiile au aratat faptul ca la oameni aproximativ 20% din celulele B din sangele periferic sunt CD5+, reprezentand astfel o componenta majora a populatiei de celule B. Celulele B1a produc anticorpi naturali IgM polireactivi, cu specificitate atat fata de antigenele bacteriene cat si fata de autoantigene.

In anumite circumstante acesti anticorpi sunt implicati in patogeneza bolilor autoimune^3;8.

In lupus, celulele T contribuie la alterarea self-tolerantei prin facilitarea productiei de autoanticorpi de catre celulele B autoreactive. Totodata aceste celule prezinta o crestere a expresiei markerilor de activare. In mod normal, la mentinerea tolerantei fata de self contribuie in parte si actiunea supresiva a celulelor T reglatorii (Treg). Studiile au demonstrat ca la pacientii cu lupus in perioada activa exista o scadere a numarului de celule Treg (CD4+/CD25+) in periferie⁴.

Imunofenotipare limfocitara – profil autoimun si recomandari pentru efectuarea acestui test

Profilul autoimun cuprinde urmatoarele celule exprimate in valoare procentuala si absoluta:

• numarul de leucocite, granulocite, limfocite, monocite;

• numarul total de celule T (CD3+);

• celule T helper (CD4+);

• celule Treg (CD25++/CD127-);

• celule T CD8+;

• raport CD4+/CD8+;

• celule  T imature (CD4+/CD8+)

• celule B (CD19+), celule B imature (CD19+/CD5+), celule B CD19+/CD27++;

• celule NK (CD16+/CD56+);

• celule T activate (CD3+/HLA DR+).

Urmarirea tabloului imunofenotipic limfocitar este util in monitorizarea clinica a bolilor autoimune, in corelatie cu tipul si stadiul afectiunii cat si cu tratamentul imunosupresiv administrat⁵.

Specimen recoltat - sange venos⁵. 

Recipient de recoltare - vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant⁵.

Volum proba – 5 mL sange⁵.

Stabilitate proba - sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei⁵.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate⁵.

Metoda - citometrie in flux⁵.

Valori de referinta si comunicarea rezultatelor

Buletinul final va contine intervalele de referinta pentru subseturile limfocitare adecvate varstei pacientului  impreuna cu o interpretare a rezultatelor obtinute⁵.

Trebuie cunoscut faptul ca numarul absolut al populatiilor limfocitare este influentat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatura si mediul inconjurator. Studiile legate de variatiile circadiane au demonstrat o crestere progresiva a numarului de celule CD4+ in cursul zilei, in timp ce limfocitele CD8+ si limfocitele B CD19+ cresc doar in prima parte a zilei, fara a se modifica in cursul dupa-amiezei. Din acest motiv, atunci cand se efectueaza o monitorizare seriata a populatiilor limfocitare se recomanda ca probele de sange sa se recolteze in acelasi moment al zilei⁷.

Citopeniile apar frecvent in LES, severitatea lor fiind influentata de varsta si de etnie. Leucopenia cu neutropenie si limfopenie apare in 15–50 % din cazuri, neutropenia si limfopenia reflectand activitatea bolii si predispozitia la infectii. Limfopenia are o incidenta de 19–62% si consta in reducerea numarului de celule T CD4 circulante si scaderea raportului CD4/CD8⁴.

Bibliografie

1. Annet M.Jacobi et al. Correlation between circulating CD27high plasma cells and disease activity in pacients with systemic lupus erythematosus. In Arthritis &Rheumatism, vol 48, no 5, 2003, 1332 – 1352.

2. Antony Rosen. Mechanism of autoimmunity. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 739 -749

3. Claudia Berek, Andreas Radbruch, Harry W. Schroeder Jr. B-cell development and differentiation. In Clinical Immunology. Principles and Practice , Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 121.

4. Cyntia Aranow, Betty Diamond, Meggan Mackay. Systemic lupus erythematous. In Clinical Immunology. Principles and Practice. Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 749 -765.

5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog

6. Marcus Odendahl et al. Disturbed peripheral B lymphocyte homeostasis in systemic lupus erythematosus . In The Journal of Immunology, 2000, 165: 5970 – 5979.

7. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.

8. Paolo Casali. Abner L Notkins . CD5+ B lymphocytes, polyreactive antibodies and human B – cell repertoire. In Trends in Immunology, vol 10, 1989, 364 – 368.

9. T.Dorner, P.E. Lipsky. Correlation of circulating CD27high plasma cells and disease activity in systemic lupus erythematous. In Lupus, vol 13,no 5, 2004, 283 – 289.

Multe infectii virale persista indefinit dupa faza acuta si pot avea consecinte clinice considerabile. Printre acestea se numara infectiile HBV, HCV, HIV si HTLV, ce sunt caracterizate prin niveluri crescute ale antigenelor persistente, prin afectarea localizarii tisulare a celulelor imune si perturbarea functiei celulelor T⁵.

Prin definitie, infectiile virale persistente nu sunt controlate in intregime de sistemul imun al gazdei. Functia alterata a celulelor T este ierarhica si pare sa se coreleze direct cu nivelul antigenic; include o productie scazuta de citokine si o capacitate proliferativa perturbata, pana la “epuizarea” completa a celulelor T implicate in raspunsul imun. Acest fenomen contrasteaza cu dezvoltarea normala a celulelor T cu memorie care se produce in absenta antigenului persistent^2;5.

Procesul de “epuizare” a celulelor T, ca urmare a confruntarii continue cu niveluri moderate sau crescute de antigene virale exprimate pe numeroase celule, a fost descris initial la soarecii infectati cu virusul meningitei coriolimfocitare si s-a constatat ca se aplica si la infectiile HIV si HCV la om. Pana in acest moment, nu exista un raspuns definit la intrebarea daca “epuizarea” celulelor T este consecinta expunerii continue la concentratii crescute de antigen sau aceasta constituie cauza replicarii virale necontrolate si deci a incarcarii antigenice crescute.

La nivel molecular, “epuizarea” celulelor T este definita prin:

• alterarea cailor de semnalizare prin TCR si citokine;

• exprimarea de receptori inhibitori (PD-1, LAG-3, Tim3 etc.);

• deficit metabolic si energetic;

• alterarea maturatiei/diferentierii².

Lipsa celulelor producatoare de IL-2 in cursul expunerii persistente la virusul HIV este o constatare deosebit de importanta in lumina studiilor recente privind dezvoltarea celulelor T cu memorie. Astfel, celulele de memorie CD4 si CD8 pot fi impartite in doua subtipuri, dupa functiile efectoare si capacitatea de migrare: celule T de memorie centrale CD45RA- care exprima markerii L-selectin (CD62L) si CCR7 si celule T de memorie efectoare CD45RA- care nu exprima acesti markeri si care migreaza catre situsurile replicarii virale din tesuturi. In ceea ce priveste productia de citokine, celulele T de memorie centrale produc in principal IL-2, in timp ce celulele T de memorie efectoare produc atat IL-2 cat si interferon gamma.

Persistenta antigenului la persoanele infectate cu HIV in faza de viremie este asociata cu un numar scazut de celule CD4+ de memorie centrale virus-specifice in comparatie cu persoanele ce au o viremie suprimata. Constatari similare au fost raportate si in infectia cronica cu virus C. Aceste studii arata ca expunerea cronica la antigen conduce la alterarea functionala a celulelor CD4 virus-specifice. Astfel, prezenta antigenului viral stimuleaza generarea de celule de memorie efectoare capabile sa produca interferon gamma dar care au o capacitate de proliferare redusa si o durata de viata scurta in vivo; in acelasi timp este perturbata dezvoltarea de celule de memorie centrale care au capacitate proliferativa si secreta IL-2; la randul lor, celulele de memorie efectoare scad nivelurile de antigen¹.

Studiile care descriu un defect functional in celulele CD4+ virus-specifice ar putea explica lipsa functiei antivirale eficace a celulelor CD8+ in infectia HIV. Pentru un raspuns sustinut al celulelor CD8+ se pare ca este necesar ca limfocitele CD4+ sa furnizeze IL-2 (in cursul fazelor precoce ale infectiei cronice) si IL-21 (in cursul fazelor tardive). Exprimarea moleculei costimulatoare CD28 pe suprafata celulelor CD8+ antigen-specifice este posibil legata de productia de IL-2 de catre celulele CD4+. O alta modalitate prin care celulele T CD4+ contribuie la raspunsul sustinut al celulelor CD8+ in cazul infectiilor persistente este inductia continua si mentinerea productiei de anticorpi neutralizanti^1;2.

Pe baza conceptului care prevede implicarea  mai multor mecanisme in reducerea raspunsurilor celulelor T CD8+ in cursul infectiilor virale cronice, au aparut posibilitati noi de interventii imunomodulatoare care se afla in curs de evaluare.

Unele comunicari au documentat reversarea in vitro a functiei celulelor T CD4+ izolate de la soarecii infectati cronic cu virusul coriomeningitei limfocitare, de la maimutele infectate cu virusul SIV sau de la oamenii infectati cu HIV sau HCV, prin blocarea unuia sau mai multor receptori inhibitori. Aceasta restaurare functionala a fost dependenta de cultura in vitro prelungita in prezenta anticorpilor blocanti respectivi si a fost precedata de proliferarea celulelor T CD8+. Inductia proliferarii in prezenta anticorpilor blocanti indreptati impotriva PD-1 rezulta intr-o apoptoza redusa precum si intr-o crestere atat a lungimii telomerelor cat si a activitatii telomerazei, ambele contribuind se pare la potentialul proliferativ crescut si la recuperarea functiilor efectoare².

Imunofenotipare limfocitara – profil infectii cronice si recomandari pentru efectuarea acestui test

Profilul infectii cronice cuprinde urmatoarele celule exprimate in valoare procentuala si absoluta:

• numarul de leucocite, granulocite, limfocite, monocite;

• numarul total de celule T(CD3+);

• celulele T naive CD45RA+, celulele T de memorie CD45RA- ;

• celule T helper (CD4+);

• celulele T naive CD45RA+ raportate la numarul de celule CD4+;

• celule T CD31+;

• celule T CD8+, celule T CD8+/CD28+ (citotoxice),  celule T CD8+/CD28- (reglatoare);

• raport CD4+/CD8+;

• celule  T imature (CD4+/CD8+);

• celule B ( CD19+);

• celule NK (CD16+/CD56+);

• celule T activate (CD3+/HLA DR+).

Urmarirea tabloului imunofenotipal limfocitar este util in monitorizarea clinica a pacientilor cu infectii cronice in corelatie cu tratamentul administrat³.

Specimen recoltat - sange venos³. 

Recipient de recoltare - vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant³.

Volum proba – 5 mL sange³.

Stabilitate proba - sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei³.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate³.

Metoda - citometrie in flux³.

Valori de referinta si comunicarea rezultatelor

Buletinul final va contine intervalele de referinta pentru subseturile limfocitare adecvate varstei pacientului  impreuna cu o interpretare a rezultatelor obtinute³

Trebuie cunoscut faptul ca numarul absolut al populatiilor limfocitare este influentat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatura si mediul inconjurator. Studiile legate de variatiile circadiane au demonstrat o crestere progresiva a numarului de celule CD4+ in cursul zilei, in timp ce limfocitele CD8+ si limfocitele B CD19+ cresc doar in prima parte a zilei, fara a se modifica in cursul dupa-amiezei. Din acest motiv, atunci cand se efectueaza o monitorizare seriata a populatiilor limfocitare se recomanda ca probele de sange sa se recolteze in acelasi moment al zilei⁴.

In infectiile cronice se inregistreaza de obicei o granulocitopenie, o reducere a limfocitelor CD4+ si o inversare a raportului CD4/CD8.

Celulele T naive CD4+CD31+  reprezinta o subpopulatie a celulelor T CD4+ naive  recent eliberate din timus. Determinarea rezervei timice prin celule T naive CD31+ este utila in depistarea cauzei unei limfopenii persistente. Aceasta poate fi datorata unui “consum”crescut (indiciu de infectie cronica) sau unei “productii” scazute. Cu cat proportia de celule T CD31+ este mai mare cu atat capacitatea de generare a limfocitelor T naive este mai mare.

Raportul dintre celulele T naive si celulele T cu memorie scade in cursul vietii, deoarece se genereaza mereu noi celule cu memorie prin contactul cu antigenele. In infectiile cronice apare cresterea procentuala a celulelor T cu memorie CD45RA- ca urmare a activarii imune cronice³.

Bibliografie

1. Cheryl L Day, Bruce D Walker. Progress in Defining CD4 Helper Cell Responses in Chronic Viral Infections. In J Exp Med, Vol. 198, No.12, December 2003.

2. Helge Frebel, Kirsten Richter, Annette Oxenius. How chronic viral infections impact on antigen-specific T-cell responses. In European Journal of Immunology, 2010.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

4. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. T- and B-Cell Quantitation by Flow Cytometry. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.

5. Scott N. Mueller, Barry T. Immune responses to viruses. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 426-427.

Imunofenotiparea prin citometrie in flux (IFCF) reprezinta un instrument indispensabil pentru diagnosticul, clasificarea, stadializarea si monitorizarea neoplaziilor hematologice.

La Conferinta Internationala de Consens din 2006 de la Bethesda, Maryland s-au emis recomandari privind indicatiile medicale ale testarii prin citometrie in flux. Astfel, aceasta este indicata in urmatoarele situatii clinice:

-citopenii, in special bicitopenia si pancitopenia;

-numar crescut de leucocite, incluzand limfocitoza, monocitoza si eozinofilia;

-prezenta de celule atipice sau blasti in sangele periferic, maduva osoasa sau alte lichide ale corpului;

-plasmocitoza sau gamopatia monoclonala;

-organomegalia si masele tisulare.

In aceste situatii imunofenotiparea poate constitui un screening sensibil pentru prezenta/absenta unei neoplazii hematologice. In plus, citometria in flux este un instrument util in stadializarea unei neoplazii limfoide diagnosticate anterior, in monitorizarea raspunsului la tratament incluzand detectarea bolii minime reziduale, in documentarea recaderii sau progresiei si in diagnosticul unei malignitati hematologice intercurente.

In malignitatile hematologice mai multi pasi sunt urmati in aplicarea si interpretarea informatiei imunofenotipice:

1. identificarea celulelor din linii diferite si determinarea daca acestea sunt mature sau imature;
2. detectarea celulelor anormale prin identificarea expresiei antigenice care difera semnificativ de normal;
3. documentarea detaliata a fenotipului populatiei celulare anormale (adica prezenta sau absenta antigenelor) si, prin comparatie cu populatia normala, documentarea unei cresteri sau scaderi a intensitatii colorarii cu anticorpi marcati cu fluorocromi;
4. evaluarea faptului daca informatiile obtinute sunt diagnostice pentru o anumita boala, iar daca nu, stabilirea unei liste de entitati posibile cu sugerarea unor studii suplimentare ce pot avea valoare diagnostica, cum ar fi imunohistochimie (IHC), citogenetica, FISH sau studii moleculare;
5. furnizarea de informatii imunofenotipice ce pot avea valoare prognostica suplimentara, incluzand identificarea de tinte pentru o potentiala terapie tintita.

Atunci cand se primeste o proba pentru testare prin citometrie in flux, se stabilesc liniile celulare si antigenele ce trebuie evaluate pe baza tipului de proba si alte informatii disponibile, cum ar fi: indicatia medicala pentru testare, istoricul clinic, elementele morfologice, testarile anterioare prin citometrie in flux, rezultatele altor teste de laborator, precum si rezultatele unei eventuale testari preliminare sceening prin citometrie in flux. Pentru indicatiile medicale identificate de grupul Bethesda s-a stabilit un consens privind liniile celulare care trebuie evaluate si antigenele incluse in evaluarea primara a fiecarei linii¹.

Astfel reactivii de consens mentionati in tabelul 17.9.5.1, atunci cand sunt evaluati in combinatiile potrivite, reprezinta minimul care permite evaluarea eficienta a liniilor celulare indicate pentru neoplazia hematopoietica cu un grad acceptabil de sensibilitate².

Tabel 17.9.5.1: Reactivii consens pentru evaluarea initiala a neoplaziilor hematopoietice¹⁶

Este furnizat de asemenea un set secundar de reactivi potrivit pentru caracterizarea in situatii specifice, dar numai un numar limitat dintre acestia va fi utilizat intr-un caz particular (vezi tabelul 17.9.5.2). De mentionat faptul ca in conditii practice specifice poate fi necesara inlocuirea anumitor reactivi intre cele doua paneluri pentru adaptarea la o anumita populatie de pacienti sau o anumita prevalenta a bolilor, dar numarul total al reactivilor utilizati trebuie sa ramana acelasi.

Tabel 17.9.5.2: Reactivi pentru evaluarea secundara a liniilor celulare hematopoietice specifice¹⁶

 In prezent imunofenotiparea limfocitelor din sangele periferic este utilizata in mod comun in evaluarea pacientilor cu limfocitoza sustinuta pentru determinarea naturii sale reactive sau maligne³.

 NEOPLAZIILE LIMFOIDE MATURE

Acestea includ leucemia limfocitara cronica si limfoamele non-Hodgkin, recunoscute dupa un fenotip care este  similar celulelor limfoide mature normale (cum ar fi prezenta Ig de suprafata pe celulele B mature) si lipsa trasaturilor antigenice de imaturitate (cum ar fi expresia TdT, CD34 si intensitate scazuta a expresiei CD45). Prin identificarea antigenelor asociate liniei celulare, neoplaziile limfoide mature pot fi impartite in neoplazii ale liniei celulare B, T sau NK.

Neoplaziile limfoide cu celula B matura

Citometria in flux este indispensabila pentru diagnosticul neoplaziilor limfoide cu celula B matura, prin identificarea celulelor anormale fenotipic apartinand liniei celulare B si recunoasterea fenotipurilor caracteristice diferitelor entitati². Multe cazuri de posibil limfom cu celula B sunt evaluate initial prin imunofenotiparea sangelui periferic si/sau aspiratului de maduva osoasa inaintea efectuarii biopsiei tisulare. Limfoamele cu celula B identificate astfel sunt adesea incadrate in spectrul larg al bolilor limfoproliferative cronice cu celula B (BLPC-B), aceasta terminologie fiind utilizata deoarece subclasificarea precisa utilizand criteriile OMS necesita corelarea cu histopatologia tisulara. In ciuda acestei cerinte, necesitatea unui diagnostic specific rapid, utilizand proceduri minim invazive, a dus la cresterea tendintei de subclasificare completa a BLPC-B care afecteaza sangele periferic si maduva osoasa in mare parte pe rezultatele IFCF sau in combinatie cu histopatologia medulara. Aceasta tendinta a fost impulsionata de studii ce au documentat identitatea fenotipica in neoplaziile cu celula B cu afectare concomitenta a sangelui periferic sau maduvei osoase si ganglionilor limfatici¹³.

In plus citometria in flux poate fi utilizata pentru identificarea expresiei unor tinte pentru terapia cu anticorpi si furnizarea de informatii prognostice suplimentare. De asemenea, in urma terapiei, citometria de flux constituie metoda stabilita pentru evaluarea bolii minime reziduale².

Celulele limboide B mature neoplazice pot fi distinse de celulele normale prin identificarea a 2 tipuri principale de anomalii fenotipice: restrictia clasei lanturilor usoare de Ig si expresia aberanta de antigene^2;11.

Spre deosebire de majoritatea populatiilor normale sau reactive, neoplaziile cu celula B matura reprezinta de obicei o singura clona celulara care exprima o singura clasa de lant usor de Ig, adica kappa sau lambda, reflectata printr-un raport anormal kappa-lambda. In mod tipic, leucemia limfocitara cronica (CLL) prezinta o intensitate scazuta a colorarii pentru Ig de suprafata. Unele celule B nu prezinta Ig de suprafata, acestea incluzand limfoblastii, plasmocitele si celulele B timice, precum si corespondentele lor neoplazice: leucemia acuta limfoblastica, neoplaziile plasmocitare si limfomul cu celula B mediastinal primar. Rezultate fals negative pentru Ig de suprafata se pot datora interferentei Ac solubili cu legarea Ac de detectie sau alterarii/deletiei epitopilor recunoscuti, datorate de exemplu mutatiilor hipersomatice din limfomul folicular.

Prin IFCF se poate identifica expresia aberanta de antigene la nivelul celulelor B. Expresia CD5 la nivelul celulelor B este in general raportata ca un fenotip aberant, dar exista populatii mici de celule B normale mature CD5⁺, aflate de obicei in sangele periferic, dar si la nivelul ganglionilor limfatici, in special la pacientii cu boli autoimune. Expresia CD5 a fost raportata si la nivelul unor precursori normali ai celulelor B din maduva osoasa. Astfel expresia CD5 trebuie interpretata in corelatie cu alte anomalii, incluzand restrictia lantului usor de Ig sau alterarea intensitatii colorarii CD20, CD22 si CD79b. Un alt tip de aberatie fenotipica este expresia de antigene care nu sunt in mod tipic prezente intr-un subset de celule B apartinand unui compartiment biologic distinct (de exemplu expresia bcl-2 pe celulele B CD10⁺)².

Intr-un studiu, Morice si colaboratorii au evaluat retrospectiv abilitatea IFCF a sangelui periferic si maduvei osoase de a prezice tipul de limfom cu celula B intr-un grup de 252 pacienti cu IFCF pozitive si biopsii tisulare diagnostice, iar concluziile extrase din acest studiu corelativ sunt rezumate intr-un algoritm pentru clasificarea limfoamelor cu celula B prin IFCF a sangelui periferic/maduvei osoase (vezi figura 17.9.5.1)¹³.

Fig. 17.9.5.1  Adaptare dupa Morice W G et al. Mayo Clin Proc. 2008; 83:776-785.

* Se recomanda ciclina D1 (FISH sau IHC)                                                   ** Este necesara corelarea cu biopsia de tesut  

*** Se recomanda confirmare prin TRAP si/sau biopsie maduva osoasa

Imunofenotiparea prin citometrie in flux este in mod particular utila pentru subtiparea limfoamelor/leucemiilor cu celula B compuse predominant din celule mici (vezi tabelul 17.9.5.3)⁵.

Tabel 17.9.5.3

NHL = limfom non-Hodgkin, sIg = imunoglobuline de suprafata, CLL = leucemie limfocitara cronica, SLL = limfom cu limfocite mici, LPL = limfom limfoplasmocitar, MCL = limfom/leucemie cu celula a mantalei, MZL = limfom de zona marginala, SMZL = limfom de zona marginala splenic

 ▪ Expresia aberanta a CD5 este caracteristica pentru CLL/SLL si MCL, care prezinta manifestari superpozabile. Coexpresia omogena a CD5 si CD23 de catre o BLPC-B, atunci cand este insotita de colorarea slaba atat pentru sIg cat si pentru CD20, CD22, CD79b, iar FMC-7^- prezice CLL/SLL cu specificitate inalta. Acest fenotip exclude MCL (in care de obicei CD23 este negativ), iar alte limfoame similare fenotipic sunt relativ indolente, astfel incat efectele clinice ale clasificarii unuia din aceste cazuri in categoria CLL ar fi probabil minime. Totusi acest diagnostic IFCF trebuie confirmat prin corelarea cu date clinice, de laborator si citologice, cu recomandarea de biopsie tisulara cand subclasificarea precisa ramane neclara¹³.

Un fenotip caracterizat prin expresia intensa a sIg si CD20, pozitivitate CD5 uniforma, iar expresia CD23 fie absenta fie partiala si FMC-7⁺ se asociaza puternic cu MCL^2;13.

In anumite cazuri IFCF prezinta aspecte care se suprapun intre fenotipurile CLL si MCL, expresia slab pozitiva a CD23 putand fi intalnita in ambele. Astfel, dat fiind comportamentul clinic relativ agresiv al MCL, studii suplimentare, care includ imunohistochimie pentru supraexpresia ciclinei D1 sau examen citogenetic pentru identificarea translocatiei t(11;14)(q13;q32) sau FISH pentru gena de fuziune CCND1/IGH, sunt necesare pentru diagnostic in toate cazurile de BLPC-B care prezinta expresia uniforma a CD5 si in care lipsesc alte atribute fenotipice tipice pentru CLL. Totusi absenta genei de fuziune in aceste cazuri nu stabileste diagnosticul definitiv de CLL, alte boli (LPL, SMZL) putand prezenta un imunofenotip similar. De asemenea in cazurile cu IFCF tipica pentru MCL un FISH negativ nu exclude complet diagnosticul, in cazuri rare alte tipuri de ciclina D putand fi supraexprimate^2;5;13.

CD5 poate fi exprimat si in alte BLPC-B, in mod particular LPL sau SMZL, in multe din aceste cazuri expresia CD5 fiind partiala. Expresia partiala a CD5 nu exclude CLL sau MCL, iar pe de alta parte nu prezice un anume tip de limfom¹³. Posibile aspecte distinctive includ absenta expresiei CD23 in majoritatea MZL si prezenta diferentierii plasmocitare intr-un subset semnificativ din acestea demonstrata de expresia CD138, expresia intensa a CD38 si restrictia lantului usor de imunoglobuline citoplasmatice (cIg). Totusi si alte subtipuri de neoplazii limfoide B pot demonstra diferentiere plasmocitara, in special LPL². De aceea, in cazul unei BLPC-B detectata prin IFCF a sangelui periferic sau maduvei osoase, cu expresia partiala a CD5, pentru un diagnostic precis se recomanda biopsia tisulara^2;13. Uneori studiile de genotipare pot sustine diagnosticul de MZL. Desi unele anomalii genetice pot fi intalnite atat in CLL/SLL cat si in MZL (de exemplu, trisomia 18), urmatoarele anomalii sunt mai tipice pentru MZL: t(11;18)(q21;q21), t(1;14)(p22;q32), t(14;18)(q32;q21), precum si deletia 7q31 in SMZL².

Un mic subset din pacientii cu leucemie prolimfocitara B (B-PLL) pare sa fie CD5⁺. Unii dintre acestia au fost ulterior diagnosticati cu varianta blastoida de MCL prin testarea pentru translocatia t(11;14)(q13;q32) sau rearanjamentele genei CCND1. Este dificil sa se distinga intre CLL cu numar crescut de prolimfocite, transformarea prolimfocitoida a CLL sau PLL de novo. Transformarea prolimfocitoida se caracterizeaza prin colorare scazuta pentru CD5, intensitate crescuta a colorarii pentru CD20 si sIg si achizitia FMC-7. Totusi unii pacienti cu transformare prolimfocitoida demonstreaza un fenotip identic cu cel al CLL/SLL precedente. Fenotipul B-PLL de novo este variabil, incluzand unii pacienti CD5⁺, dar care, spre deosebire de CLL/SLL, de obicei sunt CD23^{- 2}.

Este putin probabil ca o BLPC cu celula mica B CD5 negativa sa reprezinte CLL, iar aceste cazuri sunt clasificate mai potrivit ca NHL in faza leucemica.

▪ Expresia CD10 la IFCF se coreleaza puternic cu diagnosticul tisular de limfom folicular (FL) sau limfom difuz cu celula mare B (DLBCL), urmate de limfomul Burkitt (BL)^2;13. Expresia CD10 in alte tipuri de limfoame este neobisnuita, fiind foarte rara in LPL, MZL si MCL. Pe de alta parte CD10 este in mod normal exprimat de celulele B ale centrului folicular, leucemia/limfomul limfoblastic cu precursor de celula B, subseturi de celule T mature, limfoblasti precursori ce celula T, neutrofile si unele celule nonhematolimfoide.

Aproximativ 20-40% din toate DLBCL prezinta un fenotip CD10⁺, acestea putand fi dificil de diferentiat de BL sau de FL compus din multe celule mari. Astfel cand un fenotip B matur CD10⁺ este identificat prin IFCF, distinctia intre aceste posibilitati trebuie evaluata in continuare prin morfologie².

BL al copilului este in general CD10⁺ si CD5^-. Desi BL al adultului este de obicei CD10⁺, fenotipul in aceste cazuri este mai variabil si este mai dificil de diferentiat de DLBCL, dar spre deosebire de unii pacienti cu DLBCL si majoritatea pacientilor cu FL, BL este de obicei bcl-2^{- 2}.

▪ HCL are un fenotip distinctiv care permite diagnosticul si detectia unor niveluri scazute de boala ulterior terapiei: CD20 intens, CD22 intens, CD11c intens, CD25⁺, CD103⁺, sIg intermediar sau intens, FMC-7⁺, CD23^-, CD5^-, CD10^-. Acest fenotip este mai sensibil si specific pentru diagnosticul de HCL decat coloratia pentru fosfataza acida tartrat rezistenta (TRAP). CD103 este caracteristic exprimat in HCL, alte boli CD103⁺ fiind rare si nu raspund bine la acelasi tip de terapie, acestea incluzand HCL varianta (HCLv) si limfomul pulpei rosii a splinei cu limfocite viloase (SRPL), care sunt frecvent CD103⁺, precum si rare cazuri de SMZL si DLBCL. Coexpresia CD103 si CD25 este considerata unul din cele mai utile criterii de diagnostic pentru HCL. Ocazional HCL clasica deviaza de la fenotipul caracteristic. Un mic subset de HCL (10-26%) sunt CD10⁺, dar sunt morfologic similare HCL CD10^- si raspund la terapia tipica. Astfel diagnosticul de HCL trebuie luat in considerare atunci cand se identifica un fenotip CD10⁺, CD5^- asociat cu identificarea altor aspecte fenotipice caracteristice HCL. Alte variatii fenotipice raportate includ lipsa CD103 (foarte rar), lipsa CD25, expresia bcl-1 sau prezenta colorarii pentru CD23. Cazurile CD25^- au morfologie variabila, de la HCLv si SMZL la PLL si DLBCL. Recent, coloratia histochimica pentru anexina A1 a fost aratat ca distinge cu o sensibilitate si specificitate de 100% intre HCL si alte BLPC-B, incluzand SMZL si HCLv. HCLv se caracterizeaza prin numar mai mare de leucocite, absenta monocitopeniei, prezenta de celule cu nucleoli proeminenti, lipsa colorarii pentru TRAP, CD25^-, dar in rest este similara fenotipic HCL clasice. Este importanta recunoasterea acestei HCL variante deoarece raspunsul la agentii eficienti in HCL clasica este de obicei slaba, iar supravietuirea mediana este semnificativ scurtata. Totusi existenta HCLv este dezbatuta si s-a pus intrebarea daca unele din aceste neoplasme nu reprezinta SMZL, cu care prezinta similitudini morfologice. In clasificarea OMS 2008, HCLv si SRPL au fost listate sub termenul de “limfom splenic cu celula B, neclasificabil”, HCLv nemaifiind considerata legata biologic de HCL^2;4;5.

• MZL prezinta de obicei un fenotip CD5^-, CD10^-, iar diagnosticul se bazeaza pe identificarea trasaturilor morfologice caracteristice si excluderea altor neoplazii cu celula mica B: FL CD10^-, MCL CD5^- si HCL. Distinctia de HCL este mai dificila datorita fenotipurilor care se pot suprapune. MZL este adesea CD11c⁺ si poate fi pozitiv pentru CD103. Totusi in MZL colorarea pentru CD11c este mai slaba, lipseste combinatia CD103, CD11c si CD25 si lipseste colorarea intensa pentru CD20 si CD22².
• Aproximativ 60-80% din pacientii cu LPL sunt raportati cu un fenotip CD5^-, CD10^-, CD23^-; multi pacienti exprima CD11c si CD25, dar spre deosebire de HCL sunt CD103^{- 2}.

▪ Neoplazii limfoide cu celula B matura care sa exprime atat CD5 cat si CD10 sunt putin comune. Acest grup include, in ordinea incidentei: DLBCL, FL, MCL, CLL/SLL, BL. Evaluarea morfologica si studii genetice (rearanjamentele genei BCL-2 in FL, tranlocatia t(11;14)(q13;q32) sau rearanjamentele genei CCND1 in MCL, translocatiile MYC in BL) pot fi necesare pentru stabilirea diagnosticului².

Expresia CD38 si ZAP-70 a fost raportata ca ar avea valoare prognostica in CLL/SLL. Desi majoritatea studiilor au utilizat un cut-off de 30% celule pozitive pentru a determina pozitivitatea expresiei CD38, unele studii au demonstrat un prognostic advers pentru pacientii cu expresia CD38 pe 20% sau chiar mai putine celule tumorale². Expresia ZAP-70 a fost aratat ca se coreleaza cu statusul mutational al regiunii variabile a lantului greu de Ig (IgVH), progresie mai rapida a bolii si supravietuire mai mica⁵. Exista o serie de dificultati tehnice in determinarea statusului ZAP-70, legate de intensitatea relativ slaba a colorarii cu multi fluorocromi disponibili comercial, localizarea intracitoplasmatica a marker-ului care face necesara folosirea de tehnici de permealizare care pot duce la scaderea intensitatii colorarii, prezenta colorarii nespecifice la nivelul celulelor B nonneoplazice, expresia labila in timp si sensibilitatea la diferiti anticoagulanti (a fost recomandata utilizarea EDTA si transportul in maxim 24 ore in laborator). Nu s-a ajuns la un consens in ceea ce priveste metoda optima de determinare a caror celule ar trebui considerate pozitive pentru ZAP-70. Recent au fost propuse cateva sisteme de calculare implicand media si mediana intensitatii fluorescentei ZAP-70 in celulele leucemice, celulele T, NK si celulele B normale².

Neoplaziile limfoide cu celula T si NK matura

IFCF poate contribui la diagnosticul si clasificarea neoplaziilor limfoide cu celula T si NK matura, insa adesea celulele T sau NK anormale fenotipic sunt mai dificil de identificat in comparatie cu celulele B mature anormale. Pe de alta parte clasificarea neoplaziilor cu celula T si NK este mai putin bine stabilita decat cea a neoplaziilor cu celula B si multe neoplazii raman in categoria limfomului cu celula T periferica, nespecificat (PTCL,U). Clasificarea conform schemei curente nu urmeaza un algoritm simplu si necesita adesea asimilarea de informatii diverse, incluzand studii morfologice, imunohistochimice, citometrie in flux, citogenetica, FISH si teste moleculare².

Neoplaziile cu celula T/NK matura (periferica) sunt divizate in leucemice, cutanate si extraganglionare si cele cu origine ganglionara. Majoritatea limfoamelor cu celula T periferica (PTCL – PTCL,U, limfomul T angioimunoblastic, limfomul cu celula mare anaplazica) sunt malignitati posttimice, care exprima TCR α/β, derivate aparent din sistemul imun adaptativ (antigen specific bazat pe receptor). Ele apar in general in organele limfoide periferice din celule T naive, efectoare (reglatoare CD4⁺ si citotoxice CD8⁺) sau de memorie. Limfoamele cu celula NK si un numar mic de PTCL ce pot fi derivate extratimic sunt legate de sistemul imun innascut (nerestrictionat MHC). PTCL din acest grup (limfomul cu celula T hepatosplenic, limfomul cu celula T subcutanat panniculitis-like, limfomul cu celula T tip enteropatie) tind sa apara in localizari mucoase si cutanate, adesea exprima TCR γ/δ, antigene asociate celulei NK si proteine asociate granulelor citotoxice¹¹.

Neoplasmele cu celula T si NK matura pot fi identificate prin IFCF pe baza detectiei expresiei antigenice aberante, spre deosebire de celulele B neexistand un marker surogat de clonalitate la fel de fidel ca expresia kappa si lambda. In plus expresia antigenica aberanta trebuie distinsa de variatiile fenotipice normale observate intre multiplele subseturi de celule nonneoplazice.

Ocazional expresia antigenica aberanta poate consta in lipsa completa a colorarii pentru unul sau mai multe antigene pan-celula T, CD5 si CD7 fiind antigenele cel mai frecvent pierdute. Celulele neoplazice CD7^- trebuie distinse de o populatie mica de celule T normale CD7^- din piele si sange care pot creste in dermatoze benigne si alte conditii reactive.

Mai frecvent neoplaziile T si NK demonstreaza o alterare mai subtila a colorarii pentru antigene decat lipsa completa a acestora, cele mai frecvente fiind colorarea celulelor T mai intensa sau mai slaba pentru CD3 sau CD5, colorarea mai slaba a celulelor NK pentru CD2, CD7, CD56 si CD57, o expresie intensa mai omogena a CD8 si CD16 de catre celulele NK.

De asemenea populatiile de celule T si NK anormale pot fi recunoscute dupa expresia de antigene care nu sunt in mod normal exprimate in aceste linii, spre exemplu antigenele mieloide CD15, CD13 si CD33 au fost descrise in unele neoplazii cu celula T matura, putand duce la confuzia cu leucemia acuta mieloida; celulele NK pot achizitiona CD5; expresia antigenului celulei B CD20 a fost descrisa intr-un procent mic de neoplazii cu celula T si poate fi de asemenea detectata intr-un subset mic de celule T normale.

Evaluarea prin IFCF a expresiei TCR V-β permite identificarea de populatii restrictionate de celule T, dar, spre deosebire de testele PCR pentru rearanjamentele genei TCR care pot fi efectuate atat pe specimene proaspete cat si inghetate si fixate, acest test este laborios si necesita analizarea de preferinta in 24 ore de la recoltare.

Celulele NK nu prezinta expresia TCR, pentru demonstrarea clonalitatii celulelor NK fiind dezvoltata analiza prin citometrie in flux a expresiei receptoruui NK (NKR), incluzand receptorii pentru Ig ai celulelor killer (KIR) si complexul CD94/NKG2, care pot fi de asemenea aplicate celulelor T citotoxice de memorie din leucemia cu limfocite mari granulare (LGL) cu celule T.

Informatiile imunofenotipice formeaza o parte importanta a clasificarii neoplasmelor limfoide cu celula T si NK matura, acestea putand fi efectuate fie prin citometrie in flux, fie prin imunohistochimie (IHC), selectarea tehnicii optime depinzand de aspectul care este cercetat. Studiile de IFCF sunt superioare IHC in distinctia intre celulele T si NK.  Anticorpii utilizati de IFCF detecteaza de obicei intregul complex TCR-CD3, prezent pe suprafata celulelor T si absent de pe suprafata celulelor NK, spre deosebire de IHC care detecteaza numai componenta epsilon a CD3, neputand distinge intre celulele T si NK. Celulele CD3^- trebuie evaluate in continuare pentru diferentierea intre celulele NK, celulele T anormale cu lipsa aberanta a CD3 si celulele T imature. Studiile moleculare care demonstreaza rearanjamentul clonal al genei TCR pot de asemenea confirma linia celulara T.

IFCF permite determinarea expresiei  ambelor forme, α/β si γ/δ, ale TCR, spre deosebire de IHC care detecteaza numai forma α/β a receptorului, aceasta distinctie fiind importanta deoarece limfoamele cu celela T γ/δ sunt mai agresive.

Expresia CD4 si CD8 poate fi stabilita atat prin IFCF cat si prin IHC, IFCF prezentand avantajul identificarii celulelor neoplazice pe baza expresiei aberante a altor antigene si apoi izolarea lor pentru caracterizarea in continuare a acestora.

Atat IHC cat si IFCF pot fi utilizate pentru identificarea diferentierii NK prin detectia CD56 si CD57, IFCF fiind considerata o tehnica mai sensibila. In plus IFCF poate detecta CD16 si ar trebui utilizati mai degraba anticorpii pentru detectia izoformei CD16A decat a izoformei 16B asociata granulocitelor.

Coloratii pentru proteinele asociate granulelor citotoxice TIA-1, care identifica majoritatea celulelor T citotoxice, si granzima B sau perforina, care indica un fenotip citotoxic activat, pot fi efectuate atat prin IFCF, cat si prin IHC. De asemenea coloratii pentru CD30 si proteina Alk-1 asociate cu limfomul cu celula mare anaplazica (ALCL) sunt mai frecvent efectuate prin IHC, dar sunt disponibile si prin IFCF.

CD103, exprimat de un subset de celule T intramucoase normale si in limfomul cu celula T asociat enteropatiei (EATCL), este detectabil prin IFCF².

Neoplaziile cu ceula T matura

Expresia CD4 si CD8 poate fi utilizata pentru formularea unei liste de posibilitati diagnostice si determinarea informatiilor necesare pentru subclasificarea acestora.

▪ Neoplaziile CD4⁺/CD8^- includ sindromul Sézary/limfomul cu celula T cutanat (CTCL); leucemia prolimfocitara cu celula T (T-PLL); leucemia/limfomul cu celula T al adultului (ATLL); ALCL; limfomul cu celula T angioimunoblastic (AITCL); PTCL, U; rar LGL.

In primul rand vor fi luate in considerare bolile care afecteaza primar sangele, incluzand sindromul Sézary/CTCL, ATLL si T-PLL².

• Sindromul Sézary/CTCL prezinta de obicei CD4⁺, CD26^-, CD7^-, cu prezenta variabila a colorarii si intensitate variabila a CD25, acest fenotip nefiind specific bolii^2;5.
• ATLL are un fenotip similar sindromului Sézary/CTCL CD4⁺, CD7^-, dar cu o colorare intensa mai uniforma pentru markerul de activare CD25 (receptorul IL-2). De asemenea acesti pacienti prezinta integrarea clonala a genomului HTLV-1^{2;5;11 .}
• T-PLL este cel mai frecvent CD4⁺ (60%), dar poate fi si CD4⁺, CD8⁺ (25%) si mai rar numai CD8⁺ (15%). Spre deosebire de CTCL si ATLL, T-PLL este de obicei CD7⁺, CD25^-, lipseste pierderea aberanta sau scaderea expresiei altor antigene T si este de obicei negativ pentru antigene asociate NK si pentru proteinele asociate granulelor citotoxice. Diagnosticul trebuie sa ia in considerare excluderea cazurilor rare de LGL CD4⁺. Studiile citogenetice pot confirma diagnosticul, peste 80% din pacientii cu T-PLL avand fie inv(14)(q11;q32), fie t(14;14)(q11;q32), implicand gena TCL1 si locusul TCR α/δ^2,6.
• ALCL afecteaza primar ganglionii limfatici si pielea, dar in mod particular poate prezenta afectarea sangelui periferic. Aceasta entitate includea initial toate limfoamele compuse din celule mari care exprima uniform CD30 (Ki-1), insa clasificarea OMS curenta include acele cazuri care exprima un fenotip T sau nul, excluzand limfoamele cu celula mare B CD30⁺. ALCL este de obicei CD4⁺, poate exprima CD56, este cel mai frecvent CD2⁺, dar adesea lipsesc multe alte antigene T, incluzand CD3, CD5 si CD7 si poate exprima antigene mieloide CD13, CD15, CD33, putand duce la confuzia cu leucemia acuta  mieloida. Un diagnostic definitiv poate fi stabilit la pacienti care exprima proteina Alk-1 sau prezinta rearanjamentul genei ALK1 de pe cromozomul 2 la examenul citigenetic clasic sau FISH^2,11. Rearanjamentele ALK sunt prezente la 50-70% din ALCL CD30⁺, t(2;5) aparand la aproximativ trei patrimi din acesti pacienti. Expresia Alk subdivide ALCL in 3 subtipuri clinice: a) ALCL sistemic Alk⁺, b) ALCL sistemic Alk^- si c) ALCL primar cutanat (de asemenea Alk^-). ALCL Alk^- poate fi considerat ca ALCL secundar cand urmeaza mycosis fungoides, papulozei limfomatoide sau bolii Hodgkin⁶.

AITCL este de obicei CD4⁺, CD2⁺, CD5⁺, prezinta adesea scaderea expresiei CD7 si uneori a CD3. Un subset de celule neoplazice pot fi CD10⁺, expresia CD10 de catre celulele T putand fi intalnita si in ALL cu precursor de celula T, rar in alte neoplasme cu celula T matura si intr-un subset de celule T normale. Aproape toti pacientii prezinta celule B EBV pozitive, iar aproximativ o treime prezinta de asemenea rearanjamente ale genei Ig^2,6.

Asa cum este de asteptat, fenotipul PTCL,U este heterogen, neoplasmele din aceasta categorie fiind de obicei CD4⁺ si prezentand pierderea aberanta a expresiei CD7 si CD5. Prin definitie, alte entitati specificate trebuie excluse inaintea stabilirii diagnosticului de PTCL,U^2;5. Expresia aberanta a CD20 a fost raportata in PTCL,U, fiind propus ca aceste celule ar putea reprezenta contrapartea neoplazica a subpopulatiei mici de celule T CD20⁺ prezente la persoanele sanatoase⁷.

▪ Cel mai frecvent neoplasm cu celula T CD4^-/CD8⁺ este T-LGL. In sangele periferic alte entitati care trebuie luate in considerare sunt PTCL,U CD8⁺, o mica proportie din PLL si rar CTCL/sindromul Sézary. In splina si alte situsuri extraganglionare diagnosticul diferential include si limfomul cu celula T subcutanat panniculitis-like (SPTCL), rar limfomul cu celula T hepatosplenic (HSTCL) si limfomul cu celula T γ/δ nonhepatosplenic.

• T-LGL prezinta un fenotip CD8⁺, CD3⁺, frecvent cu scaderea intensitatii pentru CD5 si CD7 si expresia de antigene asociate NK, majoritatea pacientilor exprimand CD57, multi CD16 si cativa sunt CD56⁺. In plus, sunt exprimate de obicei proteinele asociate granulelor citotoxice TIA-1, granzima B si perforina. Desi majoritatea pacientilor exprima TCR α/β, au fost raportati si pacienti TCR γ/δ. LGL cu un fenotip NK poate prezenta de asemenea un fenotip CD8⁺, CD4^-, dar lipseste expresia complexului CD3-TCR, astfel neintrand in categoria neoplaziilor limfoide cu celula T matura^2,5,6.
• SPTCL este un limfom cu celula T citotoxica rar, de obicei CD8⁺, prezinta expresia uneia sau mai multor proteine asociate granulelor citotoxice, este numai focal pozitiv pentru CD56, este de obicei EBV^- si cel mai frecvent TCR α/β^2,11.
• HSTCL este de obicei CD4^-, CD8^-, rar fiind descrisi pacienti CD8⁺, care pot fi dificil de diferentiat de LGL. In comun cu T-LGL, HSTCL afecteaza de obicei splina si poate afecta sangele periferic, este frecvent CD16⁺ si exprima un fenotip citotoxic nonactivat cu prezenta TIA-1 si absenta granzimei B si perforinei, dar difera de majoritatea LGL prin expresia CD56 si lipsa CD57, demonstreaza absenta completa a CD5 mai degraba decat scaderea intensitatii acestuia, cel mai adesea exprima TCR γ/δ, exprima receptori de celula killer Ig-like (KIR), sugerand derivarea din celule T de memorie, si demonstreaza frecvent la examenul citogenetic isocromozomul 7q^2,11.
• Cazuri rare de limfom cu celula T γ/δ nonhepatosplenic sunt CD8⁺, dar nu sunt confundate cu LGL deoarece lipseste afectarea splinei si a sangelui periferic².
• O proportie mica din CTCL sunt CD8⁺ si trebuie distinse de limfomul cu celula T γ/δ cutanat nonhepatosplenic mai agresiv. CTCL este de obicei negativ pentru proteinele asociate granulelor citotoxice, dar acestea pot fi prezente in transformarea cu celula mare a CTCL. Morfologia si aspectele clinice raman criterii importante de diferentiere².

▪ Expresia duala CD4⁺/CD8⁺ este neobisnuita in limfoamele cu celula T matura si trebuie sa duca la considerarea ALL cu precursor de celula T.

Cel mai caracteristic neoplasm limfoid cu celula T matura CD4⁺/CD8⁺ este T-PLL. Acesta exprima CD3 de suprafata si un set complet de antigene T ca CD2, CD5 si CD7, lipsesc markerii de imaturitate CD34, CD10 si TdT si demonstreaza inv(14)(q11;q32) sau t(14;14)(q11;q32).

Rar pacienti cu ATLL, LGL si PTCL,U coexprima CD4 si CD8².

▪ Categoria CD4^-/CD8^- include EATCL, HSTCL, limfomul cu celula T γ/δ nonhepatosplenic, PTCL,U si rar limfomul cu celula NK/T tip nazal.

• EATCL este de obicei negativ pentru CD4, CD8 si CD5, exprima CD3 si CD7, TCR α/β⁺, este pozitiv pentru proteinele asociate granulelor citotoxice TIA-1, granzima B si perforina, este CD103⁺, poate fi CD56⁺ sau CD56^- si poate exprima CD30, iar aceste cazuri trebuie diferentiate de ALCL. Recent EATCL a fost asociat cu achizitii in cromozomul 9q33-34 ce pot ajuta la confirmarea diagnosticului. Limfocitele intramucoase din boala celiaca pot demonstra un fenotip similar ca si rearanjamente clonale al genei TCR, diagnosticul de EATCL necesitand prezenta unui infiltrat distructiv^2,5,11.
• Limfomul cu celula T γ/δ nonhepatosplenic demonstreaza un fenotip similar HSTCL, dar de obicei  cu un fenotip citotoxic activat: CD4^-, CD8^-, CD2⁺, CD3⁺, CD5^-, C56⁺, in principal CD57^-, TIA-1⁺, granzima B⁺, perforina⁺. Un numar semnificativ din limfoamele mucoase T γ/δ sunt asociate cu EBV, in timp ce cele cutanate sunt de obicei EBV^{- 2}.

Neoplaziile cu celula NK matura includ limfomul extraganglionar cu celula T/NK tip nazal (EN-NK/T-NT), leucemia agresiva cu celula NK si un subset de LGL. Neoplaziile cu celula NK pot fi localizate sau diseminate in momentul examinarii initiale si majoritatea se comporta agresiv, dar este importanta diferentierea LGL cu celula NK care prezinta un curs mai indolent. Spre deosebire de celelalte neoplazii cu celula NK aceasta exprima adesea CD57 alaturi de CD56 si este EBV^-.

• Limfomul extraganglionar cu celula T/NK tip nazal tipic este CD4^-, CD8^-, CD3s^-, CD5^-, CD2⁺, C56⁺, iar spre deosebire de NK normale este de obicei CD7^-, CD16^-. Celulele tumorale exprima lantul ε al CD3 in citoplasma si astfel se coloreaza pozitiv pentru CD3 la IHC. Celulele exprima proteinele asociate granulelor citotoxice TIA-1, granzima B si perforina, iar EBV este prezent in forma epizomala clonala, respectiv EBER (EBV small encoded RNA) pozitiv, ceea ce implica rolul acestui virus in patogeneza. Cazurile de EN-NK/T-NT care se prezinta cu alte localizari decat cea nazala clasica (cel mai frecvent piele, tract gastrointestinal, testicul) , inclusiv ganglionara, dar sunt in rest tipice, sunt incadrate in aceeasi categorie^2;5;7. EN-NK/T-NT aparut la nivelul pielii trebuie diferentiat de mycosis fungoides pleomorfic/transformat, PTCL,U si neoplaziile hematodermice CD4⁺, C56⁺, iar cel aparut la nivel intestinal trebuie diferentiat de EATCL. Un subset bine recunoscut al EN-NK/T-NT are originea intr-o celula T citotoxica NK-like, acestea exprimand CD3 de suprafata si prezinta rearanjamente clonale ale genei TCR. Ramane problematica clasificarea cazurilor atipice in care lipseste expresia CD56 si proteinelor asociate granulelor citotoxice, precum si a formelor nonnazale in care lipseste dovada implicarii EBV, fiind sugerata incadrarea ca limfom cu celula NK neclasificabil. Clasificarea OMS a EN-NK/T-NT solicita atat pozitivitatea EBV, cat si a proteinelor asociate granulelor citotoxice⁷.
• Leucemia cu celula NK agresiva si limfomul extraganglionar cu celula T/NK tip nazal au un fenotip similar, diferentierea fiind clinica, limfomul fiind localizat tisular, in timp ce leucemia se prezinta cu afectare medulara, citopenii si prezenta de celule neoplazice circulante, simptome B, hepatosplenomegalie, teste functionale hepatice crescute, insotite uneori de sindrom hemofagocitic².

Neoplaziile blastice limfoide includ leucemia acuta si limfomul limfoblastic. ALL si LL au caracteristici comune morfologice, imunofenotipice si citogenetice, distinctia dintre ele fiind considerata de multi arbitrara. Astfel in clasificarea OMS acestea sunt incadrate in categoria leucemie/limfom limfoblastic cu precursor de celula B si T. Desi unii pacienti cu LL  pot aparea la evaluarea clinica si morfologica cu boala localizata, studii sensibile de IFCF si moleculare evidentiaza frecvent afectarea submicroscopica a maduvei osoase sau sangelui periferic¹⁴. IFCF permite identificarea celulelor imature sau anormale, distinctia lor de celulele imature prezente in mod normal in maduiva osoasa si timus, diferentierea intre ALL si AML, identificarea liniei celulare B sau T, subtiparea acestora  si urmarirea raspunsului la tratament, incluzand identificarea responder-ilor precoce si detectia bolii minime reziduale^2;5.

Utilizarea unui plot CD45 versus lumina dispersata lateral este foarte utila in identificarea blastilor, acestia prezentand o intensitate scazuta a expresiei CD45 si lumina dispersata lateral scazuta. Aceasta permite distinctia de limfocite (CD45 intens), precursorii eritroizi (CD45 negativ), precursorii neutrofilici si eozinofilici (lumina dispersata lateral mai crescuta) si monocite (lumina dispersata lateral mai crescuta si CD45 mai intens). Populatia blastica este apoi izolata prin “gating” electronic pentru analiza detaliata a expresiei antigenice. Blastii neoplazici pot fi similari celulelor normale blocate in maturatie si sunt recunoscute la diagnosticul prin IFCF prin numarul crescut comparativ cu celulele normale care exprima acelasi fenotip dar si prin expresia frecventa de pattern-uri anormale de maturatie, denumite pattern-uri imunofenotipice asociate leucemiei, ce pot fi clasificate in 4 tipuri: 1) expresia aberanta de markeri care nu sunt in mod normal prezenti pe celulele liniei respective; 2) expresia asincrona sau fenotipul contine aspecte neasteptate pentru stadiul de maturatie respectiv, cum ar fi expresia CD20 pe suprafata precursorilor de celula B; 3) supraexpresia si 4) lipsa expresiei unor markeri^1;2;5.

Distinctia intre AML si ALL este importanta pentru selectia terapiei corespunzatoare. In ALL CD19 are sensibilitatea si specificitatea cele mai mari pentru detectia liniei B, iar cCD3 pentru detectia liniei T. cCD22 sau cCD79a sunt de asemenea markeri sensibili si specifici pentru linia B².

Tabel 17.9.5.4: Markeri pentru diagnosticul leucemiei acute limfoblastice⁸

ALL demonstreaza frecvent expresia a 1 sau 2 antigene mieloide, care contribuie la detectia celulelor anormale si nu trebuie sa duca la diagnosticul de leucemie bifenotipica. Mai putin de 5% din cazuri prezinta heterogenitate lineala, fie leucemie bifenotipica (expresia de antigene de la mai mult de o linie de catre o singura populatie de blasti) sau leucemie bilineala (doua populatii de blasti din linii diferite). Atunci cand o neoplazie blastica exprima markeri de la mai mult de o linie, celulele leucemice trebuie caracterizate complet morfologic, citochimic, imunofenotipic si citogenetic, iar informatiile trebuie cantarite si, de preferinta, stabilit un diagnostic de AML sau ALL. Aceeasi abordare este necesara la pacientii care exprima foarte putini markeri in incercarea de a minimiza numarul cazurilor din categoria AL nediferentiate².

Este in dezbatere existenta AL de linie NK, parand a exista un grup denumit leucemie NK/mieloida, ce poate avea afectare extramedulara si poate exprima urmatorul imunofenotip: CD56⁺, CD7⁺, posibil CD2⁺, CD13⁺, CD33⁺, MPO^- si CD3^- (de suprafata si citoplasmatic)².

Studiile de imunofenotipare au evidentiat diferente minore ale expresiei antigenice in LL cu precursor de celula B sau T si ALL. LL este rar la adult, dar este comun la copii. Aproximativ 90% din LL sunt de linie T, restul fiind de linie B, foarte rar putand avea originea intr-o celula NK. De obicei LL sunt TdT pozitive, un marker care distinge acest tip de neoplazie de alte tipuri de limfoame. Un numar mic de limfocite imature benigne TdT pozitive pot fi intalnite in sange si ganglionii limfatici. CD34 este de asemenea exprimat de multe LL, fiind util pentru diferentierea acestora de limfomul Burkitt (BL). De asemenea LL cu precursor de celula T sau B poate exprima CD10 sau CALLA (common acute lymphoblastic leukemia antigen), dar expresia CD10 in T-LL nu a fost asociata cu un prognostic favorabil ca in T-ALL. LL cu precursor de celula B, ca si B-ALL, poate fi impartit mai departe in 4 subtipuri, pre-B precoce, pre-B, pre-B tardiv (tranzitional) si B matur, in functie de expresia lantului greu μ citoplasmatic si de suprafata si a lanturilor usoare de Ig. LL pre-B precoce exprima CD10, CD19, CD34 si TdT. Stadiul de maturatie pre-B este cel mai frecvent intalnit si exprima CD20 si lantul greu μ citoplasmatic fara Ig suprafata detectabile. Cazuri rare de LL cu precursor de celula B pot exprima Ig de suprafata fara TdT detectabil si acestea trebuie diferentiate de BL.

Tabel 17.9.5.5: Aspecte imunofenotipice in limfoamele limfoblastice cu precursor de celula B si T¹⁴

 Malignitatile limfoblastice cu precursor de celula T pot fi de asemenea subdivizate corespunzator cu stadiile de maturatie timica normala a celulelor T: precoce (CD7⁺, cCD3⁺, CD5^+/-, CD2^+/-, CD1a^-, CD4^-, CD8^-), mijlociu (CD7⁺, CD5⁺, CD2⁺, cCD3⁺, sCD3^+/-, CD1a^+/-, CD4^+/-, CD8^+/-), si tardiv (CD7⁺, CD5⁺, CD2⁺, cCD3⁺, sCD3⁺, CD1a^-, CD4⁺ sau CD8⁺). Majoritatea cazurilor de LL cu precursor de celula T corespund stadiului timic tardiv, ca si timomul, de care trebuie diferentiate. Majoritatea LL mentin expresia antigenelor pan-T, in timp ce in limfoamele cu celula mare T lipsesc unul sau mai multe din aceste antigene^5;14. Expresia mai frecventa a TCR αβ decat γδ a fost raportata in T-LL fata de T-ALL. Unele LL pot prezenta expresia aberanta de antigene mieloide, iar T-LL pot exprima ocazional CD56. Toate recaderile T-LL trebuie restudiate imunologic deoarece un numar mic de cazuri pot prezenta o comutare fenotipica la leucemie acuta mieloida¹⁴.

ALL la adult sunt in 70% din cazuri cu precursor de celula B, 25% cu precursor de celula T si 5% cu celula B matura (celula Burkitt). Exista o incidenta usor mai mare a expresiei antigenelor mieloide in ALL la adulti decat la copii, comun fiind detectate CD13, CD15 si CD33. Cazurile rare cu coexpresia mai multor antigene mieloide si limfoide pot fi considerate leucemii acute bifenotipice.

Unele aspecte imunofenotipice prezinta valoare prognostica in ALL. Pacientii cu ALL cu celula B matura, caracterizata prin prin expresia lanturilor usoare de Ig de suprafata, κ sau λ, alaturi de alti markeri comuni ALL de linie B, incluzand CD10, CD19, CD20 si CD22, raspund prost la terapia standard, in aceste cazuri fiind stabilite programe de tratament cu doze intensificate ca terapie standard, ceea ce a dus la o imbunatatire semnificativa a supravietuirii la acesti pacienti. De asemenea ALL cu celula T era considerata anterior o forma cu prognostic nefavorabil, dar cu programele de tratament moderne, imunofenotipul T a devenit cu prognostic favorabil. Prin analiza datelor imunofenotipice colectate prospectiv, grupul de studiu german CALGB a idetificat un subset, caracterizat prin expresia a mai putin de 3 markeri de celula T, cu prognostic nefavorabil. Blastii leucemici ai acestor pacienti exprima rar markeri de celula T matura, ca CD1, CD2, CD3, CD4 si CD8, corespunzand unui imunofenotip de ALL cu celula T precoce, de asemenea raportat ca nefavorabil.

Expresia CD34, mai frecventa la adult in ALL de linie B, a fost de asemenea raportata ca avand efect advers, dar aceasta se suprapune atat cu un numar crescut de leucocite, cat si cu prezenta cromozomului Ph, caracterizate de asemenea printr-un efect nefavorabil⁹.

La copii, ALL cu celula pre-B precoce cuprinde aproximativ doua treimi din cazuri, se asociaza cu un prognostic favorabil, majoritatea fiind CALLA pozitive, expresia acestuia neparand a avea semnificatie prognostica independenta¹⁵.

ALL cu celula pre-B reprezinta ~20% din cazuri. Expresia cIg se asociaza cu prezenta anomaliei citogenetice t(1;19)(q23;q13), identificata la 20-30% din pacientii cu ALL cu celula pre-B si asociata cu un prognostic advers la acesti pacienti. Restul pacientilor prezinta rate de supravietuire similare ALL cu celula pre-B precoce¹⁵.

ALL cu celula B matura este rara, cuprinzand 1-2% din cazurile de ALL la copii, la fel ca BL fiind caracterizata prin morfologie L3 FAB, un fenotip cu CD10, CD19, CD20, CD22, CD79a pozitive si TdT negativ, prezenta t(8;14) sau a unei translocatii inrudite si supraexpresia oncogenei c-MYC. Acesti copii prezinta varste mai mari, o incidenta mai mare a afectarii SNC si raspuns prost la tratamentul standard^8;15.

ALL pre-B tranzitional, caracterizat prin expresia citoplasmatica si de suprafata a lanturilor grele fara expresia lanturilor usoare de Ig, apare la ~1% din copiii cu ALL, nu se asociaza cu morfologia L3 si cu translocatiile caracteristice ALL cu celula B matura si prezinta o evolutie favorabila¹⁵.

Unele fenotipuri in ALL se asociaza cu prezenta unor anomalii citogenetice si moleculare cu semnificatie prognostica. Astfel in B-ALL un fenotip CD9⁺, CD10⁺, CD19⁺, CD20^- sau numai partial, CD34^- este un marker sensibil pentru t(1;19)(q23;p13), dar este lipsit de specificitate¹. Pe de alta parte un fenotip CD10^-, CD15⁺, CD24^- se asociaza cu t(4;11)(q21;q23), rearanjamente ale MLL si un prognostic prost^2;5.

ALL cu celula T reprezinta ~15% din cazurile de ALL la copii, asociata anterior cu un prognostic nefavorabil, dar utilizarea regimurilor terapeutice intensive a rezultat intr-o supravietuire apropiata de cea a ALL non-T. Celulele leucemice pot fi dublu pozitive pentru CD4 si CD8. Majoritatea cazurilor de ALL-T sunt HLA-DR negative. Dintre acesti pacienti, cei cu imunofenotipul cel mai putin matur au o evolutie semnificativ mai proasta. Un subset caracterizat prin expresia CD7 si absenta CD4 si CD8 se asociaza cu rezistenta la chimioterapia conventionala, iar absenta expresiei CD2 identifica un grup de pacienti cu evolutie proasta.

Aproximativ 10-20% din copiii cu ALL exprima antigene mieloide, ca CD13 si CD33, care nu se asociaza cu semnificatie prognostica adversa conform ultimelor trial-uri, dar pot furniza un element convenabil pentru monitorizarea bolii minime reziduale^8;15.

Expresia CD34 a fost asociata cu efect favorabil independent in ALL de linie B la copii, dar nu si in cea de linie T¹⁵.

Boala minima reziduala (MRD)

In prezent majoritatea testelor de citometrie in flux pentru MRD tintesc sa detecteze populatii reprezentand 0.01% din evenimente, respectiv o celula din 10⁴, prin analiza a 500 mii pana la 1 milion celule, cu scopul detectarii a cel putin 50-100 evenimente de interes, putand concura astfel ca sensibilitate cu metodele PCR, citometria in flux prezentand avantajul discriminarii intre celulele viabile si cele moarte si masurarea directa a proportiei celulelor pozitive. Provocarea pentru detectia MRD prin IFCF este separarea celulelor leucemice reziduale de celulele nonmaligne, mai ales in stadiile de regenerare a maduvei osoase in care aceasta poate contine mai multe forme de maturatie precoce. In 1997, Jennings si Foon au aratat necesitatea utilizarii unei prime “porti” CD45 versus lumina dispersata lateral (SSC) pentru diferentierea subseturilor de celule si, cel mai important, a celulelor imature/blastice cu SSC si expresia CD45 scazute, atat la diagnostic cat si pentru detectia MRD, printre celulele in maturare din maduva osoasa. In 1999, Campana si Coustan Smith au estimat ca primele 4 combinatii pentru detectia MRD in AL la IFCF sunt: 1) CD19/CD34/CD10; 2) CD13/CD33/CD34; 3) CD13/CD33/CD117; 1) CD13/CD34/CD117, ceea ce presupune ca aceste aspecte imunofenotipice trebuie urmarite la diagnostic. Fenotipul se poate schimba adesea odata cu trecerea timpului si in urma tratamentului, astfel testul pentru MRD nu trebuie sa se bazeze pe potrivirea exacta a fenotipului bolii reziduale si cel al specimenului diagnostic original. Totusi subsetul de celule leucemice care persista mentin aspectul clonal si continua sa prezinte trasaturi omogene. Aceste celule reziduale apar la studiile prin IFCF ca un grup de celule ingust prezentand un fenotip “inghetat” printre celulele in maturare^1;2.

Pentru leucemia acuta exista in general o diferenta de 1 log intre maduva osoasa si sangele periferic, cu nivelul cel mai mare de MRD in maduva osoasa. Astfel, ca si in studiile bazate pe tehnici moleculare, analiza maduvei osoase poate fi restrictionata la cazurile in care MRD este in mod repetat nedetectabila in sangele periferic².

IFCF are un rol stabilit in detectia MRD in ALL, un rol in actualitate in CLL/SLL si un rol potential in alte malignitati hematopoietice si limfoide.

Cateva studii au demonstrat ca MRD detectata prin IFCF este un factor prognostic independent in ALL pediatrica. Astfel, prezenta MRD in maduva osoasa in absenta evidentei morfologice de boala, se asociaza cu risc mai mare de recadere, iar riscul creste cu nivelul de boala detectata. Schemele actuale de clasificare in ALL cu precursor de celula B incorporeaza, in afara criteriilor de risc NCI/Rome, elementele citogenetice, raspunsul precoce si incarcatura MRD la sfarsitul inductiei,  La adult datele sunt mai putine, dar detectia MRD pare sa fie un factor de risc independent pentru recadere. Aceste informatii pot asista la identificarea unor pacienti cu risc crescut care pot beneficia de terapie aditionala. mai multe studii efectuate au aratat o buna corelatie intre datele obtinute prin IFCF si PCR^1;2;15.

In ultimul timp, prin utilizarea schemelor de chimio-imunoterapie combinata, pot fi obtinute remisiuni MRD^- in CLL/SLL, iar studiile initiale au aratat o durata a raspunsului si o supravietuire mai lungi la pacientii fara MRD detectabila. Studiile pentru MRD in CLL pot fi efectuate utilizand sange periferic. Totusi exista celule B normale ale sistemului imun innascut cu un fenotip asemanator celui al CLL-B. Pe de alta parte se cunoaste putin despre soarta acestor celule normale in urma chimioterapiei pentru CLL. O procedura de citometrie in flux multiparametrica standardizata publicata recent de Rawstron et al a fost dezvoltata pentru detectia MRD la un nivel similar PCR-ului conventional (1×10^-4 sau 0.01%). PCR-ul cantitativ cu oligonucleotide alela-specifice este mai sensibil, dar necesita generarea de primer-i specifici pentru pacient si nu este general disponibil, iar la un nivel de 0.01% se coreleaza cu rezultatele IFCF. Astfel IFCF multiparametrica standardizata a fost propusa ca metoda preferata pentru detectia MRD in CLL/SLL. Aceasta recomanda 3 combinatii, respectiv asocierea CD5/CD19 cu CD20/CD38, CD81/CD22 si CD79b/CD43^1;2.

Recomandari imunofenotipare sindroame limfoproliferative 

• evaluarea limfocitozelor de etiologie neprecizata, la pacienti care prezinta adenopatii, transpiratii nocturne, febra, scadere ponderala, oboseala, infectii, anemie, tendinta la sangerare;
• distinctia intre limfocitozele policlonale (reactive, cel mai adesea virale) si limfocitozele monoclonale;
• identificarea afectiunilor limfoproliferative cu celula B sau T;
• subclasificarea fenotipica a bolilor limfoproliferative cronice;
• distinctia intre leucemia limfoblastica acuta (LAL) si leucemia mieloida acuta (LAM);
• subtiparea imunologica a LAL;
• distinctia dintre limfomul malign si leucemia acuta;
• monitorizarea tratamentului;
• depistarea precoce a recidivelor^10,12.

Specimen recoltat - sange venos¹⁰.

Recipient de recoltare - vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant¹⁰.

Volum proba - 5 mL sange¹⁰.

Stabilitate proba - sangele trebuie sa ajunga in maxim 24 ore la laboratorul la care se efectueaza testul si in aceasta perioada se pastreaza la temperatura camerei. Este contraindicata refrigerarea probei¹⁰.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depasit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate¹⁰.

Metoda - citometrie in flux¹⁰.

Valori de referinta si comunicarea rezultatelor

Buletinul final va contine intervalele de referinta pentru subseturile limfocitare adecvate varstei pacientului  impreuna cu o interpretare a rezultatelor obtinute¹⁰.

Limite si interferente

• Restrictia clasei lanturilor usoare de Ig a fost raportata rar in populatii de celule B reactive non-clonale, spre exemplu populatii ce prezinta restrictia lantului usor lambda au fost identificate in boala Castleman multicentrica. Astfel restrictia lantului usor de Ig nu este sinonima cu monoclonalitatea. De asemenea unele populatii care prezinta restrictia lantului usor si sunt monoclonale nu sunt neoplazice, identificate de exemplu in hiperplazia foliculara florida, incluzand-o pe cea observata la pacientii cu HIV. Astfel, rezultatele imunofenotiparii trebuie interpretate in conjunctie cu alte date clinice, morfologice si uneori genotipice².
• La pacientii fara un  diagnostic anterior de neoplazie limfoida identificarea unei populatii mici de celule B anormale fenotipic (mai putin de 5% din toate celulele analizate) nu trebuie sa duca la stabilirea unui diagnostic nou decat in corelatie cu datele clinice, morfologice sau alte modificari^2;11.
• In AL, procentul celulelor imature determinate prin IFCF poate diferi de numarul blastilor pe frotiurile din aspiratul medular, aceasta putand avea diferite explicatii, cum ar fi: dilutia mai mare cu sange periferic decat partea utilizata pentru frotiuri, includerea unor precursori imaturi normali (hamatogonii) la numaratoarea manuala, utilizarea unui numarator diferit pentru determinarea procentului de blasti, la numaratoarea manuala acestia fiind determinati ca procent din toate celulele nucleate, in timp ce la IFCF acestia sunt determinati ca procent din toate celulele analizate sau din celulele noneritroide (etapa de liza utilizata pentru indepartarea celulelor rosii anucleate indeparteaza de asemenea un numar variabil de precursori eritroizi nucleati). De asemenea blastii pot fi dificil de recunoscut la numaratoarea manuala sau pot fi distrusi la efectuarea frotiurilor. In plus celulele mieloide hipogranulare pot avea o lumina dispersata lateral scazuta si pot intra in regiunea blastilor in plot-ul CD45 versus dispersia laterala².

Bibliografie

1. Béné M, Kaeda J. „How and why minimal residual disease studies are necessary in leukemia: a review from WP10 and WP12 of the European Leukemia Net”. In Haematologica 2009; 94(8): 1135-50.

2. Craig F, Foon K. „Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms”. In Blood 2008; 111(8): 3941-67.

3. Dillman R. „Immunophenotyping of Chronic Lymphoid Leukemias”. In J Clin Oncol 2008; 26(8): 1193-94.

4. Dong H, Weisberger J, Liu Z, Tugulea S. „Immunophenotypic Analysis of CD103+ B-Lymphoproliferative Disorders. Hairy Cell Leukemia and Its Mimics”. In Am J Clin Pathol 2009; 131(4): 586-95.

5. Dunphy C. „Applications of Flow Cytometry and Immunohistochemistry to Diagnostic Hematopathology”. In Arch Pathol lab Med 2004; 128(9): 1004-1022.

6. Greer J, Williams M. “Non-Hodgkin Lymphoma in Adults”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 2164-70.

7. Hasserjian R, Harris N. „NK-Cell Lymphomas and Leukemias”. In Am J Clin Pathol 2007; 127: 860-8.

8. Head D. „Diagnosis and Classification of the Acute Leukemias and Myelodisplastic Syndrome”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1811-14.

9. Itakura H, Coutre S. „Acute Lymphoblastic Leukemia in Adults”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 1823-24.

10. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate, 2010. Ref Type: Catalog.

11. Macon W, McCurley T, Kurtin P, Dogan A. „Systemic Mastocytosis”. In Wintrobe`s Clinical Hematology, Greer J, Foerster J, Lukens J, Rodgers G, Pareskevas F, Glader B, 11th ed, Lippincott Williams & Wilkins, 2004, 2071-95.