Granulocitele eozinofile sunt implicate activ in diverse procese inflamatorii; procente crescute pot fi intalnite in boli alergice, parazitare, dar si reumatice. Datorita mobilitatii lor extreme, eozinofilele penetreaza rapid in tesutul inflamat si elibereaza local diferiti mediatori ce se gasesc in granulele proprii¹.

Astfel, granulele specifice ale eozinofilelor contin proteine preformate care includ atat proteine cationice specifice cat si diverse citokine si chemokine.

Proteinele cationice din granulele eozinofilelor au fost mult studiate datorita abundentei lor si capacitatii lor de a exercita efecte multiple asupra celulelor gazdei si tintelor microbiene².

Proteina cationica a eozinofilelor (ECP) are o masa moleculara cuprinsa intre 16 si 21 kDa, fiind exprimata in eozinofilele umane intr-o cantitate de 15pg/celula³. In interiorul granulelor ECP este localizata la nivelul matricei din jurul portiunii core².

Studii mai vechi au aratat ca ECP este o ribonucleaza (RNA-aza) care exercita efecte bactericide, induce degranularea mastocitelor si are o actiune citotoxica asupra parazitilor helmintici. Se crede ca mecanismul de actiune al ECP implica formarea de pori sau canale in membrana tinta, care aparent nu este dependenta de activitatea ribonucleazica reversibila.

ECP este cunoscuta mai ales prin abilitatea sa de a genera fenomenul Gordon atunci cand este injectata in ventriculii cranieni ai iepurilor: distrugerea celulelor Purkinje si modificari de tip spongiform la nivelul cerebelului, puntii si maduvei spinarii³.

Niveluri crescute de ECP au fost detectate in serul, sputa si secretiile nazale ale pacientilor care sufera o reactie alergica de faza tardiva (la 6-24 ore de la expunere), cand influxul de eozinofile predomina in zona reactiva⁴.

Nivelul ECP in ser reflecta mai bine decat IgE procesul inflamator alergic, adica nivelul de activare a eozinofilelor; se coreleaza foarte bine cu activitatea bolii, deci cu severitatea atopiei.

Acest parametru de laborator este util pentru obiectivarea si supravegherea terapiei in astmul bronsic si dermatita atopica.

Pacientii astmatici cu inflamatie eozinofilica (alergica) prezinta niveluri crescute de ECP in ser si in alte fluide: lavajul bronhoalveolar  si sputa indusa. Valoarea ECP serica constituie un marker obiectiv pentru evaluarea inflamatiei alergice in astm.

Tratamentul in astmul bronsic are drept scop suprimarea inflamatiei cronice si persistente a cailor aeriene, iar determinarea ECP poate fi utila in monitorizarea eficientei acestuia¹.

Recomandari pentru ECP

-copii cu simptomatologie obstructiva pentru diagnosticul diferential intre astmul bronsic si bronsita obstructiva recidivanta;

-diagnosticul diferential intre afectiuni alergice si non-alergice;

-controlul evolutiei in astmul bronsic si dermatita atopica;

-evaluarea eficientei tratamentului antiinflamator si a compliantei pacientilor¹. 

Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) sau postprandial¹.

Specimen recoltat - sange venos¹.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator¹.

Cantitate recoltata - minim 1 mL ser¹.

Cauze de respingere a probei – specimen intens hemolizat, icteric, lipemic sau contaminat bacterian; probe care nu au sosit la laborator congelate¹.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare cat mai repede dupa formarea completa a coagulului, iar proba va fi imediat congelata la -20°C; probele recoltate in afara punctelor laboratorului vor fi transportate in recipientul destinat probelor congelate¹.

Stabilitate proba - serul este stabil 1 luna la -20°C; nu decongelati/recongelati¹.

Metoda – imunoenzimatica cu detectie fluorimetrica (FEIA)¹.

Valori de referinta - <11 μg/L¹.

Interpretarea rezultatelor

Un nivel crescut de ECP indica inflamatie ce constituie un factor de risc pentru pacientii astmatici.

Evolutia clinica favorabila este asociata cu scaderea nivelului de ECP; dimpotriva, exacerbarea bolii atopice este precedata de cresterea concentratiei ECP in ser¹.

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

2. Peter Weller. Eosinophils and eosinophilia. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 363-364.

3. Redwan Moqbel, Paige Lacy, Darryl J Adamko, Solomon O Odemuywa. Biology Of Eosinophils. In Middleton’s Allergy, Seventh Edition., Mosby Elsevier, 2009, 302.

4. Robert G Hamilton. Assessment of human allergic diseases. In Clinical Immunology. Principles and Practice, Mosby, Elsevier, Third Edition, 2008, 1480.

Triptaza, o proteaza neutra, constituie principala componenta proteica din granulele secretorii ale mastocitelor. Astfel, mastocitele raspandite in tesutul conjunctiv de la nivelul tegumentului, tractului respirator si digestiv stocheaza 10-35 pg de triptaza/celula.

Din punct de vedere structural, triptaza este o serin esteraza cu greutatea moleculara 134 kDa, alcatuita din 4 subunitati, fiecare detinand un situs enzimatic activ propriu. Acest tetramer este legat de proteoglicani: heparina sau condroitin sulfati; complexele sunt eliberate in cursul degranularii mastocitare. Dupa disocierea de heparina triptaza se degradeaza spontan in subunitatile monomerice inactive enzimatic^4;6.

Spre deosebire de mastocitele cutanate si pulmonare, bazofilele umane contin de 300-700 ori mai putina triptaza. Din acest motiv se crede ca activarea mastocitelor printr-o reactie de hipersensibilitate IgE-mediata reprezinta principala sursa de triptaza detectata in ser.

Triptaza este eliberata din mastocitele activate in paralel cu histamina stocata si alti mediatori vasoactivi nou generati⁶.

Sunt descrise doua forme de triptaza – α si β – codificate de gene diferite. α – triptaza din sange este esentialmente secretata de catre toate mastocitele si este astfel considerata o reflectare a numarului total de mastocite. Nivelele serice de β-triptaza matura se coreleaza cu magnitudinea activarii mastocitare. Astfel, valori crescute de α – triptaza se inregistreaza in special in mastocitoza sistemica, in timp ce cresteri ale β-triptazei predomina in anafilaxie^3;6.

Anafilaxia este o reactie acuta, potential letala care afecteaza organe multiple. Anafilaxia alergica include reactii  IgE-mediate (de exemplu, induse de alimente, medicamente sau veninuri de insecte) si altele care nu sunt IgE mediate, cum ar reactiile citotoxice la transfuzii. Evenimentele anafilactice non-alergice se pot datora eliberarii directe a mediatorilor din mastocite si bazofile (reactii induse de opiacee, factori fizici), activarii sistemului de contact (reactii produse in cursul dializei), tulburarilor in metabolismul acidului arahidonic (reactii induse de aspirina sau alte antiinflamatorii nonsteroidiene) sau recrutarii de multimediatori (complement, sistemul cogularii si fibrinolizei, sistemul de contact)⁵. Tabloul clinic este dominat de manifestarile respiratorii (dispnee, tahipnee, bronhospasm, edem laringian) si cardiovasculare (tahicardie, hipotensiune, tulburari de ritm, angina, stop cardiac) la care se adauga cele digestive (greata, varsaturi, dureri abdominale, diaree) si cutanate (eritem, prurit generalizat, urticarie, angioedem)¹.

Majoritatea reactiilor anafilactice implica degranularea mastocitelor si bazofilelor cu eliberarea de mediatori. Triptaza eliberata prezinta o activitate de kalicreina, poate activa cascada complementului si cliva fibrinogenul⁵.

Nivelurile serice de triptaza ating un varf in decurs de 30-60 minute de la debutul reactiei anafilactice declansata de intepaturi de insecte, medicamente sau alimente. Valorile se mentin crescute 4-6 ore, astfel ca momentul optim de recoltare a probei este in intervalul 30 minute – 3 ore de la evenimentul suspectat ca fiind anafilaxie. Prin comparatie, histamina este indepartata din circulatie in 30-60 minute^1;2;6.

Mastocitoza este o afectiune caracterizata clinic prin prurit, congestie, greata, varsaturi, diaree, dureri abdominale si instabilitate vasculara. Din punct de vedere patogenic, este asociata cu hiperplazie mastocitara la nivelul tegumentului, tractului gastrointestinal, maduvei osoase, splinei, ficatului si ganglionilor limfatici Conform clasificarii OMS actuale, sunt descrise: mastocitoza cutanata, mastocitoza sistemica silentioasa, mastocitoza sistemica asociata cu boli hematologice clonale, mastocitoza sistemica agresiva, leucemia cu mastocite, sarcomul cu mastocite si mastocitomul extracutanat^1;2.

Majoritatea pacientilor cu mastocitoza prezinta o mutatie activatoare la nivelul domeniului de pe gena KIT care codifica receptorul tirozinkinazic pentru factorul celulei stem (SCF). Cea mai obisnuita mutatie are drept consecinta substitutia acidului aspartic cu valina la nivelul codonului 816 (D816V).

Semnele si simptomele clinice ale mastocitozei sistemice se datoreaza eliberarii de mediatori mastocitari, infiltrarii organelor cu mastocite si, la unii pacienti, afectiunii hematologice asociate².

Triptaza serica constituie markerul surogat pentru mastocitoza sistemica cel mai mult utilizat. O valoare a triptazei totale > 20ng/mL este sugestiva pentru mastocitoza sistemica si reprezinta unul dintre criteriile minore de diagnostic a bolii^1;2;6.

Testul utilizat in laboratorul nostru masoara triptaza totala (α +β).

Recomandari pentru determinarea triptazei -  confirmarea unei anafilaxii; confirmarea unui test pozitiv de provocare cu alergeni la pacientii cu urticarie; suspiciune clinica de mastocitoza sistemica⁴.

Pregatire pacient - nu este necesara³.

Specimen recoltat - sange venos³.

Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator³.

Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare³. 

Volum proba - minim 2 mL ser³.

Stabilitate proba - serul separat este stabil 2  zile la temperatura camerei; 5 zile la 2-4°C si timp indelungat la -20°C³.

Metoda – imunoenzimatica cu detectie fluorimetrica (FEIA). Testul contine 2 anticorpi monoclonali (B12 si G4) care recunosc atat α triptaza cat si β triptaza³.

Valori de referinta – <11.4 μg/L³.

Limita de detectie – 1 μg/L³.

Interpretarea rezultatelor

Valorile >11.4 μg/L sunt considerate crescute atat la copii (>4 ani) cat si la adult.

Valorile in dinamica (in conditii bazale si dupa un episod acut) sunt mai semnificative clinic decat determinarile izolate³.

Nivelurile bazale >20 μg/L sunt sugestive pentru mastocitoza sistemica. In mastocitoza sistemica valorile triptazei se coreleaza cu volumul infiltratelor mastocitare. Valori <20 μg/L pot fi detectate la pacienti cu mastocitoza cutanata si la cei cu boala sistemica limitata. In general, cu cat valorile triptazei sunt mai mari cu atat este mai probabila afectarea multiorganica².

Limite si interferente

Obtinerea unei valori normale a triptazei nu exclude un eveniment anafilactic, mai ales daca proba a fost recoltata dupa 12 ore de la episod⁴.

La pacientii cu mastocitoza cutanata valorile triptazei pot sa nu fie crescute².

Bibliografie

1. ARUP Laboratories. Test Directory: Tryptase. www.aruplab.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

2. Dean D Metcalfe. Mastocytosis. In Middleton’s Allergy, Seventh Edition., Mosby Elsevier, 2009., 1051-1061.

3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

4. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. Tryptse, Serum. www.mayomedicallaboratories.com Ref Type: Internet Communication.

5. Philip L Lieberman. Anaphylaxis. In Middleton’s Allergy, Seventh Edition., Mosby Elsevier, 2009., 1027-1042.

6. Robert G Hamilton. Laboratory Tests for Allergic and Immunodeficiency Diseases: Principles and Interpretations. In Middleton’s Allergy, Seventh Edition., Mosby Elsevier, 2009., 1260.

Histamina, o amina biogena vasoactiva, constituie probabil cel mai cunoscut mediator stocat in granulele mastocitelor si bazofilelor cu rol central in raspunsul alergic. La om mastocitele contin aproximativ 2-5 pg histamina/celula, in timp ce bazofilele prezinta o cantitate mai redusa (1 pg/celula).

Mediatorii mastocitari, inclusiv histamina, predomina in rapunsul alergic precoce; bazofilele reprezinta sursa majora de histamina in raspunsul alergic de faza tardiva².

Histamina este sintetizata in aparatul Golgi prin decarboxilarea aminoacidului histidina in prezenta enzimei histidin-decarboxilaza. Histamina are o sarcina electrica pozitiva si se asociaza cu  gruparile carboxil ale proteoglicanilor din granulele mastocitelor. Dupa exocitoza, histamina disociaza de proteoglicani la un pH neutru. O data eliberata in spatiul extracelular, histamina este metabolizata rapid (timp de injumatatire ~ 15-20 minute) prin metilare si oxidare. Metilarea, catalizata de enzima histamin-metil-transferaza, constituie principala cale de metabolizare la nivelul cailor respiratorii. Produsul initial, N-metilhistamina, poate fi excretat prin rinichi sau poate fi deaminat sub actiunea monoaminoxidazei rezultand acidul 1,4 metil-imidazolacetic (MIIA). Histamina mai poate fi oxidata si de catre diamin-oxidaza (histaminaza) cu generarea acidului imidazolacetic (IAA).

Datorita metabolismului rapid este dificil sa se determine histamina in plasma; in schimb masurarea histaminei si a metabolitilor sai in urina din 24 ore constituie o alternativa eficienta pentru testare ca urmare a faptului ca valorile acestora se mentin mult mai mult timp crescute¹.

MIIA este principalul metabolit al histaminei (50% din histamina este degradata in acest compus); din acest motiv reprezinta un marker cantitativ pentru eliberarea endogena de histamina⁷. Astfel, MIIA poate fi util in confirmarea diagnosticului de anafilaxie⁶. De asemenea s-a constatat ca nivelurile urinare de acid metil-imidazol acetic se coreleaza strans cu severitatea mastocitozei sistemice si pot constitui un intrument util atat pentru confirmarea diagnosticului cat si pentru aprecierea evolutiei si a prognosticului³.

Unele forme rare de tumori carcinoide gastrice se manifesta clinic printr-un tablou atipic mediat prin histamina eliberata de catre celulele tumorale; la acesti pacienti  determinarea de acid metilimidazol acetic poate fi utila, impreuna cu cea de gastrina si acid 5-hidroxi indolacetic⁵.

Recomandari pentru determinarea acidului 1,4 – metilimidazolacetic – evaluarea pacientilor cu suspiciune de anafilaxie sau de mastocitoza sistemica^3;6.

Pregatire pacient - se va evita, cu 2 zile inaintea recoltarii, consumul de alimente cu un continut ridicat in histamina¹.

Recipient de recoltare - vas de 2-3 litri si pahar de plastic de unica folosinta pentru urina, pe care se noteaza cantitatea totala de urina din 24 ore⁴.

Cantitate recoltata - 10 mL⁴.

Cauze de respingere a probei - specimen care nu a fost pastrat la 2-8°C; utilizarea de substante conservante (produc interferente)⁴.

Prelucrare necesara dupa recoltare – in esantionul recoltat se vor adauga cateva picaturi de acid acetic glacial⁴.

Stabilitate proba - 5 zile la 2-8°C; 1 luna la -20°C⁴.

Metoda – cromatografie de lichide cuplata cu spectrometrie de masa (LC/MS)¹.

Valori de referinta - <3.8 mg/24 h⁴.

Limite si interferente

Obtinerea unei valori normale MIIA nu exclude un eveniment anafilactic⁶.                       

Bibliografie

1. Florence Ida Hsu, Joshua A Boyce. Biology of Mast Cells and their Mediators. In Middleton’s Allergy, Seventh Edition., Mosby Elsevier, 2009, 320.

2. J. Andrew Grant, Saffana N. Hassan, Patricia A. Leonard. Mast Cell and Basophil-derived Mediators. In Atlas Of Allergic Diseases, 2nd Edition, Current Medicine LLC, 19.

3. Karin Hartmann, Stefanie B Bruns and Beate M Henz. Mastocytosis: Review of Clinical and Experimental Aspects. In Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings (2001) 6, 143–147.

4. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

5. Luigi Santacroce. Malignant Carcinoid Syndrome: Differential Diagnoses & Workup. emedicine.escape.com. Reference Type: Internet Communication.

6. Philip L Lieberman. Anaphylaxis. In Middleton’s Allergy, Seventh Edition., Mosby Elsevier, 2009, 1041.

7. Robert Hamilton, Anne Kagey-Sobotka. In Vitro Diagnostic Tests of IgE-Mediated Diseases. In Diagnostic Testing of Allergic Diseases, Marcel Dekker Inc, 2000, 99-100.

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.
2. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Eosinophil Count, Nasal. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.
3. Manole Cojocaru. Laboratorul Clinic. In Stetoscop, nr.38, 2005.