facebook

Fagotest (activitate fagocitară neutrofile)

210 Lei
Trimite pe e-mail acest articol
Printeaza acest articol

Informaţii generale şi recomandări pentru efectuarea testului

Neutrofilele deţin un rol important în răspunsul imun nespecific, în special în rezistenţa antibacteriană, ca celule efectoare, inductoare şi reglatoare. Printre caracteristicile lor esenţiale se numără:

• marginaţia şi aderarea la celulele endoteliului vascular;
• traversarea peretelui vascular (diapedeza) şi migrarea către focarele de inflamaţie;
• recunoaşterea şi fagocitarea moleculelor opsonizate;
• degradarea şi distrugerea acestor molecule prin generarea de radicali toxici de oxigen.
Aceste caracteristici sunt facilitate de prezenţa de receptori aflaţi la suprafaţă şi în interiorul celulelor, cum ar fi receptorii pentru citokine, neuromediatori, autacoizi şi hormoni.
Chemotactismul neutrofilelor se produce ca răspuns la factorii chemotactici (chemotaxine) generaţi la nivelul focarului lezional. Mai mult, chemotaxinele intensifică metabolismul neutrofilelor, agregarea acestora şi acţiunile bactericide.

Fagocitoza este mediată de opsonine circulante, specifice (imunoglobuline IgG) sau nespecifice (componente ale complementului), neutrofilele având receptori pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor IgG1, IgG2 şi pentru fragmentul complementului iC3b (C3b inactivat). Microorganismele absorbite şi opsonizate sunt distruse atât prin mecanisme oxigen-dependente cât şi oxigen-independente. Radicalii liberi de oxigen degradează bacteriile absorbite în fagozomi şi sunt parţial eliberaţi în mediul inconjurător unde intensifică distrugerea microorganismelor şi determină simultan lezarea ţesuturilor. Procesul este caracteristic inflamaţiei acute, fiind mult mai rar întâlnit în afecţiunile inflamatorii cronice. Distrugerea microorganismelor se mai poate produce şi prin intermediul proteinelor prezente în granulaţiile azurofiele cum ar fi: catepsina G, lizozimul, interferonii etc.

Mediatorii inflamaţiei, citokinele (de exemplu, TNFα) şi selectinele cresc abilitatea granulocitelor de a se localiza la nivelul focarului de inflamaţie. Capacitatea de fagocitoză este crescută prin intensificarea producţiei de radicali de oxigen şi prin eliberarea enzimelor lizozomale. TNFα este un factor important care potenţează activitatea fagocitară şi citotoxică a neutrofilelor. La rândul lor, granulocitele activate secretă citokine; IL-1 care stimulează producţia de IL-8 de către monocite, celule endoteliale şi fibroblaşti, creşte expresia moleculelor de adeziune CD11b/CD18 şi generarea de radicali de oxigen. Interferonul gamma este o citokină puternică care intensifică expresia receptorului Fc, stimulează modificările oxigenului precum şi eliberarea granulelor din neutrofile1.

Datorită caracteristicilor menţionate granulocitele sunt implicate în răspunsul inflamator precoce, iar anomaliile funcţionale ale acestora, survenite în oricare din etape, determină deficienţe semnificative ale imunităţii celulare5.

Fagocitoza anormală poate să apară în cazul unor defecte ale neutrofilului, ale imunoglobulinelor sau ale complementului. Cele mai cunoscute defecte moştenite sunt:

  • disfuncţia actinei din neutrofile (NAD): tulburare de motilitate a neutrofilelor indusă genetic ce determină reducerea marcată a capacităţii de migrare şi de ingerare a particulelor;
  • deficienţa de tuftsina; tuftsina fiind implicată în stimularea fagocitozei, deficitul acesteia se asociază cu perturbarea fagocitozei şi susceptibilitate crescută faţă de infecţii (germenii cel mai frecvent implicaţi: Staphylococus aureus, Streptococcus pneumoniae, Candida spp.); pacienţii prezintă rash-uri asemănătoare dermatitei seboreice, adenopatii fluctuante, infecţii respiratorii4;
  • defectul receptorului pentru fragmentul complementului iC3b (CD11b)rezultă dintr-o biosinteză anormală a unui lanţ beta de 95kDa (CD18) care este comun receptorului iC3b şi moleculelor de adeziune LFA-1, Mac-1 şi CR4; anomalia a fost denumită defectul de adeziune leucocitara tip 1 (LAD-1), se transmite autozomal recesiv şi se caracterizează clinic prin ulcere cutanate cronice/recurente, gingivită, fistule intestinale sau perianale; funcţiile leucocitare (marginaţia, chemotactismul, opsonizarea mediată prin iC3b şi fagocitoză) sunt sever afectate2.
O activitate fagocitară redusă poate fi întâlnită şi în unele afecţiuni dobândite cum ar fi traumatismele, diabetul zaharat şi infecţiile (plăgi infectate după arsuri, SIDA, infecţii survenite la nou-născuţi sau vârstnici).
Activitatea fagocitară a neutrofilelor şi monocitelor poate fi stimulată de preparate imunomodulatoare: citokine (interleukina-2, gamma-interferon), probiotice sau extracte de plante (Echinaceae purpureae herba).
Fagotestul are ca scop investigarea activităţii fagocitare în diverse afecţiuni şi evaluarea efectelor exercitate de medicamente3.

Pregătire pacient – se va evita recoltarea probei în cursul unei infecţii acute3.

Specimen recoltat – sânge venos3. 

Recipient de recoltare – vacutainer cu heparinat de litiu3.

Volum probă – minim 2 mL sânge heparinat3.

Stabilitate probă – sângele trebuie să ajungă în maxim 24 ore la laboratorul la care se efectuează testul şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată refrigerarea probei3.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depăşit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate3.

Metodă citometrie în flux.

Fagotest permite evaluarea cantitativă a fagocitozei prin măsurarea procentului de fagocite care au ingerat bacterii şi a activităţii acestora (număr de bacterii/celulă). Se utilizează bacterii (E. coli) opsonizate marcate cu fluoresceină (FITC-E. coli) care se incubează împreună cu sângele pacientului la 37°C; se utilizează şi o probă cu rol de control negativ care se menţine pe gheaţă; ulterior, fagocitoza este oprită prin plasarea probelor pe gheaţă şi adăugarea soluţiei de stopare; această soluţie permite diferenţierea între ataşarea şi internalizarea bacteriilor prin eliminarea fluorescenţei bacteriilor legate de suprafaţa celulelor şi menţinând nealterată fluorescenţa particulelor internalizate; după două etape de spălare se îndepărtează eritrocitele cu ajutorul soluţiei de liză; soluţia de colorare a ADN-ului, adaugată înaintea analizei prin citometrie în flux, exclude artefactele generate de agregatele bacteriene care au proprietăţi de dispersare a luminii asemănătoare leucocitelor; se utilizează un laser cu argon (488 nm, lumina albastră); pentru fiecare probă se colectează prin “gating”  10000-15000 leucocite; sunt analizate atât procentul de celule (neutrofile şi monocite) care au fagocitat bacterii, cât şi intensitatea medie a fluorescenţei acestora (numărul de bacterii ingerate); în acest scop se va efectua un “gating” pe grupul leucocitar relevant şi se va analiza histograma fluorescenţei verzi a acestuia (FL1); prin utilizarea controlului negativ se va seta un marker pentru fluorescenţa-1 (FL1), astfel încât sub 1% din evenimente să fie pozitive; procentul de celule care fagocitează bacterii va putea fi apoi determinat prin numărarea evenimentelor localizate deasupra marker-ului; intensitatea medie a fluorescenţei se corelează cu numărul de bacterii ingerate de către un singur leucocit3.

Valori de referinţă şi comunicarea rezultatelor

Sunt raportaţi următorii parametri:

  • Procentul de neutrofile care fagocitează bacterii: >84%
  • Activitate fagocitară neutrofile: >550 mfi; mfi = intenistatea medie a fluorescenţei3.
Limite şi interferenţe
Probele cu un număr de leucocite aflat în afara intervalului de referinţă necesită o corecţie a cantităţii de bacterii adăugate3.

 

Bibliografie

1. Anatol Panasiuk, Jolanta Wysoka, Elzbieta Maciorkowska, Bozena Panasiuk, Danuta Prokopowicz, Janusz Zak, Karol Radomski. Phagocytic and oxidative burst activity of neutrophils in the end stage of liver cirrhosis. In World Journal of Gastroenterology 2005; 11(48):7661-7665.
2. Francesco Dati & Erwin Metzmann. Immunodeficiencies: Characteristics and laboratory findings. In Proteins Laboratory Testing and Clinical Use, Media Print Taunusdruck GmbH, Frankfurt am Main; 2005,186.
3. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2011. Ref Type: Catalog.
4. Lawrence A. Schachner, Ronald C. Hansen. Genodermatoses. In Pediatric Dermatology, 3d edition, 2003, Mosby, 314.
5. Roger S. Riley, Jonathan Ben-Ezra. Laboratory Evaluation of the Cellular Immune System. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 826-830.
Abonează-te la Newsletter