facebook

Panel de farmacogenetica – cancer colorectal (EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, TP53)

1990 Lei

Informații generale

Incidența cancerului în întreaga lume a crescut rapid din cauza îmbătrânirii populației, a poluării mediului sau a stilului de viață nesănătos. Conform GLOBOCAN, numărul cazurilor noi de cancer și al deceselor cauzate de cancer la nivel mondial a atins circa 12,7 milioane, respectiv 7,6 milioane în 2008, număr ce a crescut la aproximativ 14,1 milioane și, respectiv, 8,2 milioane în 20121.

În ciuda îmbunătățirilor remarcabile în ceea ce privește diagnosticul precoce al cancerului precum și tratamentul chirurgical al tumorii primare, boala metastatică este responsabilă pentru mai mult de 90% din decesele cauzate de cancer2.

Modificările genomice dețin un rol important în predispoziția pentru cancer, inițierea și progresia diverselor tipuri de tumori. Acestea pot fi transmise pe linie germinală sau pot să apară spontan, ca mutații somatice, în țesutul tumoral. Deoarece mutațiile germinale se regăsesc și în țesuturile normale, într-un raport alelic bine definit, detecția lor este simplă comparativ cu cea a mutațiilor somatice a căror prezență este limitată la țesuturile maligne sau premaligne, sau doar la anumite celule din cadrul țesutului afectat3.

Mutațiile ce sunt implicate cauzal în oncogeneză sunt denumite mutații “driver”; acestea conferă un avantaj de creștere clonei maligne și sunt selectate pozitiv în micromediul tumoral4. De obicei, mutațiile somatice induc carcinogeneza fie prin inactivarea unei proteine ce are rol de supresor tumoral, fie prin activarea constitutivă a unei proteine ce determină proliferarea celulară aberantă (oncoproteină). Inactivarea proteinei supresor tumoral poate fi cauzată de numeroase mutații localizate în diverse poziții la nivelul genei corespunzătoare, spre deosebire de activarea constitutivă ce este produsă în principal de un număr limitat de mutații localizate în poziții specifice. De exemplu, aproximativ 80% din mutațiile inactivatoare ce conduc la proliferări maligne afectează reziduurile 126-306 ale proteinei p53, în timp ce 80% din mutațiile activatoare se produc în poziția 600 a oncoproteinei Braf3.

Pe măsură ce crește disponibilitatea tratamentelor oncologice ce se adresează unor ținte moleculare specifice, devine din ce mai importantă identificarea și detectarea unor variante în gene de interes, cum ar fi BRAF, KRAS sau EGFR, astfel că terapia antineoplazică poate fi administrată în funcție de genotipul individual, mai degrabă decât empiric, bazată doar pe localizarea tumorii și tipul histologic. O astfel de abordare facilitează tratamentul individualizat al pacientului oncologic, având drept consecință un risc mai redus de reacții adverse, creșterea ratei de supraviețuire și îmbunătățirea calității vieții5.

În prezent, tehnicile bazate pe secvențierea de nouă generație (engl. next generation sequencing, NGS) permit analiza simultană a sute de gene de interes, folosind paneluri de secvențiere personalizate. Tehnicile ce au la bază NGS fiind cantitative, având o sensibilitate înaltă precum și o capacitate de a multiplexa probe numeroase, reprezintă un instrument ideal pentru screening-ul mutațiilor somatice în țesuturile tumorale. Astfel, pot fi detectate mutații somatice cu frecvență alelică redusă în probe de țesut tumoral inclus în parafină2. Deoarece sunt generate volume mari de date sunt necesare soft-uri specializate care să faciliteze analiza și interpretarea rezultatelor obținute3.

Conform NCCN (National Comprehensive Cancer Network) realizarea profilului molecular al tumorilor solide facilitează o mai bună clasificare a acestora, având valoare prognostică și de ghidare a terapiei6.

Panelul de farmacogenetică – cancer colorectal se referă la testarea de mutații somatice în gene ce dețin un rol important în tumorigeneza și terapia personalizată țintită a a cancerului colorectal: EGFR, KRAS, NRAS, BRAF, TP53.

  • BRAF – mutații somatice ale genei BRAF (V-Raf Murine Sarcoma Viral Oncogene Homolog B) au fost detectate în aproximativ 7% dintre tumorile maligne umane. Dintre mutaţiile BRAF activatoare asociate cu tumori cea mai frecventă (responsabilă de peste 80% din cazuri) este V600E care are la bază o tranziţie T-A la nivelul nucleotidei 1799 din exonul 15, ce induce o substituţie a valinei cu acidul glutamic în codonul 600 din segmentul activator. Consecinţa acestei mutaţii punctiforme missens este că situsul de activare al protein-kinazei devine expus (în mod normal fiind ascuns într-o pungă hidrofobă), ceea ce conduce la o activare constitutivă a proteinei Braf7.

În cancerul colorectal mutația BRAF V600E a fost detectată în ~10% din cazuri), având implicaţii terapeutice. Deoarece Braf kinaza este situată în aval de EGFR şi KRAS în cascada MAPK, tumorile ce conţin mutaţia V600E, cu activare persistentă a acestei căi de semnalizare, sunt rezistente la orice tip de terapie anti-EGFR. Prin urmare, înainte de administrarea tratamentului cu inhibitori de tirozinkinază EGFR este necesară testarea prezenţei mutaţiei V600E a genei BRAF pentru identificarea corectă a pacienţilor care pot beneficia de această terapie8.

  • EGFR – mutații EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor = receptorul pentru factorul epidermal de

creştere) au fost raportate în 45.5% din tumorile colorectale MSH2/MLH1-mutante și în 6.5% din

tumorile non- MSH2/MLH1-mutante. Aproximativ 15% dintre mutațiile EGFR detectate (inclusiv

mutațiile N700D, G719D, T725M, T790M, E884K) pot fi țintite terapeutic prin inhibitori de

tirozinkinază9.

  • KRAS – mutaţii ale genei KRAS (Kirsten Rat Sarcoma Viral Oncogene Homolog) au fost identificate în 40% din carcinoamele colorectale non-ereditare fiind asociate cu tumori în stadiu mai avansat, cu un potenţial metastatic crescut şi cu un prognostic rezervat. În majoritatea cazurilor, anomaliile sunt detectate în codonii 12 (~82% din toate mutaţiile KRAS) şi 13 (~17%) ai exonului 2. Mutațiile conferă rezistență la terapia anti-EGFR astfel că statusul mutational KRAS reprezintă un parametru important în selectarea pacienților care pot beneficia de acest tratament10.
  • NRAS – mutații în gena NRAS (Neuroblastoma RAS Viral Oncogene Homolog) au fost raportate la cca 3 % din pacienții cu cancer colorectal metastatic și definesc un subtip molecular având caracteristici clinici distincte și o rată de supraviețuire mai scăzută comparativ cu tumorile KRAS mutante și cele de tip sălbatic11. De asemenea, mutațiile NRAS împreună cu cele KRAS și BRAF conferă rezistență la terapia anti-EGFR12.
  • TP53 – mutații ale genei TP53 (gena supresor tumoral, supranumită și “gardianul genomului” cu rol critic în controlul creșterii și proliferării celulare) apar în cca 50% dintre toate cancerele solide. Valoarea prognostică a mutațiilor TP53 reprezintă un subiect de controversă în rândul cercetătorilor și ar trebui analizată în contextul caracteristicilor tumorilor în care se produc precum și al interacțiunii cu alte aberații genomice. De asemenea, s-a sugerat că statusul TP53 ar putea influența răspunsul la tratamentele oncologice prin inducerea de mutații somatice noi13.

Tehnologia NGS oferă o sensibilitate înaltă în evidențierea heterogenicității tumorale. Sunt analizate regiuni genice cunoscute a fi implicate în dezvoltarea tumorală, fiind detectate variante somatice cu frecvență alelică între 1-5%, în funcție de calitatea ADN-ului din probă.

Analiza paralelă a mai multor modificări genice permite costuri mai mici și reducerea simultană a timpului de eliberare a rezultatelor2.

Timp de execuție – 7 zile lucrătoare14.

Metodă – NGS (secvențiere de nouă generație)14.

Tipul probei analizate – țesut inclus la parafină14.

Rezultatese raportează prezența sau absența mutațiilor somatice cu semnificație biologică.

Genele sunt analizate prin NGS (platforma Illumina MiSeq) pentru toate regiunile codante, utilizand kit-ul Illumina TruSight Tumor 15 pentru “amplificarea țintită”. Secventele rezultate sunt analizate cu ajutorul soft-ului Illumina VariantStudio, iar variantele identificate sunt comparate cu secventele de referintă pentru genele incluse in panel (Human Gene Mutation Database Professional hg19).

Mutatiile sunt raportate conform ghidurilor HGVS (http://www.hgvs.org/.) în conformitate cu Genbank Accession Numbers.

Variantele patogene și cele cu semnificație necunoscută sunt verificate prin secvențiere clasică Sanger2;14.

 

Referințe

  1. Wagle N, Berger MF, Davis MJ, et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2012; 2:82-93.
  2. TruSight Tumor 15 Kit Support (illumina.com/sequencing/sequencing_kits/trusight-tumor-15-kit/ downloads.html), 2016.
  3. Sutton KM, Crinnion LA, Wallace D, Harrison S, Roberts P, Watson CM, Markham AF, Bonthron DT, Quirke P, Carr IM. Detection of Somatic Mutations in Tumors Using Unaligned Clonal Sequencing Data. Lab Invest. 2014 Oct;94(10):1173-83.
  4. Stratton MR, Campbell PJ, Futreal PA. The cancer genome. Nature. 2009 Apr 9;458(7239):719-24.
  5. McClellan M, Benner J, Schilsky R et al. An accelerated pathway for targeted cancer therapies. Nat Rev Drug Discov 2011. 2011 Feb;10(2):79-80.
  6. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. Reference Type: Internet Communication. www.nccn.org/professionals/physician_gls/f_guidelines.asp#site), 2015.
  7. BRAF V600E Mutation Detection. Henry Ford Health System. Pathology and Laboratory Medicine. www.henryford.com. Reference Type:  Internet Communication.
  8. Van Cutsem E, Cervantes A, Nordlinger B, Arnold D ESMO Guidelines Working Group. Metastatic colorectal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2014;25 Suppl 3: iii1-9.
  9. Deihimi S, Lev A, Slifker M, Shagisultanova E, Xu Q, Jung K, Vijayvergia N, Ross EA, Xiu J, Swensen J, Gatalica Z, Andrake M, Dunbrack RL, El-Deiry WS.  BRCA2, EGFR, and NTRK mutations in mismatch repair-deficient colorectal cancers with MSH2 or MLH1 mutations.
  10. Jung A, van Krieken JHJM, Kirchner T, Carneiro F, Seruca R, Bosman FT, Quirke P, Flejou JF, Plato Hnasen T, Hertogh G, Jares P, Langner C, Hoefler G, Ligtenberg M, Tiniakos D, Tejpar S, Bevilaqua G,  Ensari A. KRAS mutation testing for predicting response to anti-EGFR therapy for colorectal carcinoma: proposal for an European  quality assurance program. Virchows Arch. 2008, 453: 417-431.
  11. Cercek A, Braghiroli MI, Chou JF, Hechtman JF, Kemeny N, Saltz L, Capanu M, Yaeger R. Clinical Features and Outcomes of Patients with Colorectal Cancers Harboring NRAS Mutations. Clin Cancer Res. 2017 Apr 26. BRCA2, EGFR, and NTRK mutations in mismatch repair-deficient colorectal cancers with MSH2 or MLH1 mutations. Oncotarget. 2017 Jun 20;8(25):39945-39962.
  12. Therkildsen C, Bergmann TK, Henrichsen-Schnack T, Ladelund S, Nilbert M. The predictive value of KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA and PTEN for anti-EGFR treatment in metastatic colorectal cancer: A systematic review and meta-analysis. Acta Oncol. 2014 Jul;53(7):852-64.
  13. Zhang W, Edwards A, Flemington EK, Zhang K. Significant Prognostic Features and Patterns of Somatic TP53 Mutations in Human Cancers. Cancer Inform. 2017 Feb 20;16:11769351176912.
  14. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2017. Ref Type: Catalog.
Abonează-te la Newsletter