facebook

Profil extins boli hepatice autoimune – Blot (AMA-M2, M2-3E, Sp100, PML, gp210, LKM-1, LC-1, SLA/LP, SS-A, Ro-52, Scl-70, CENP-A, CENP-B, PGDH)

175 Lei

Informaţii generale

Bolile autoimune ale ficatului includ:
• Hepatita autoimună (AIH)
• Ciroza biliară primitivă (PBC)
• Colangita sclerozantă primitivă (PSC).
În plus, pot apărea sindroame overlap, ca de exemplu prezenţa simultană a două boli hepatice autoimune sau asocierea unei boli hepatice autoimune cu o altă afecţiune autoimună, cum ar fi scleroza sistemică1.

Hepatita autoimună (AIH) este o boală inflamatorie cronică de etiologie neprecizată caracterizată prin prezenţa de autoanticorpi circulanţi, hipergamaglobulinemie, tablou histopatologic cu necroza celulelor parenchimatoase şi infiltrat inflamator limfoplasmocitar, precum şi printr-un răspuns dramatic la terapia imunosupresoare.
Mecanismul patogenic postulează că, pe fondul unei predispoziţii genetice, intervenţia anumitor factori declanşatori determină un răspuns imun anormal mediat de limfocitele T ce va conduce la leziuni ale ficatului. Date publicate au arătat că 40% din pacienţii cu boală severă netratată suferă deces în 6 luni de la diagnostic, iar supravieţuitorii dezvoltă frecvent ciroză, varice esofagiene şi hemoragii. Astfel, cu cât terapia imunosupresoare este începută mai precoce şi continuată în mod susţinut, cu atât pacientul diagnosticat cu hepatită autoimună are o speranţă de viaţă mai mare.
AIH constituie o afecţiune rară cu o incidenţă medie de 1-2 cazuri la 100 000 locuitori. Deşi boala este întâlnită predominant la femeile tinere aceasta poate afecta copii şi adulţi de orice vârstă, din toate grupurile etnice.
Debutul AIH este insidios cu fatigabilitate, greaţă, dureri articulare şi icter intermitent.
Diagnosticul se bazează pe simptomele şi semnele clinice, testele de laborator şi evidenţierea reacţiei inflamatorii histologice. Este importantă excluderea altor cauze de hepatita cronică (virală, metabolică, genetică sau toxică) şi delimitarea de celelalte boli autoimune hepatice. Principalele criterii pentru diagnosticul AIH sunt următoarele:

• Evidenţa histologică a hepatitei
• Detecţia de autoanticorpi (ANA, ASMA, LKM, SLA/LP)
• Hipergamaglobulinemia
• Teste serologice negative pentru HCV şi HBV
• Asocierea cu antigenele HLA B8, DR3 sau DR4.

Diagnosticul este foarte probabil atunci când sunt indeplinite 4 din 5 criterii şi complet când sunt întrunite toate cele 5 criterii. Răspunsul favorabil la terapia imunosupresoare confirmă diagnosticul1;2;3;4.
În 1994 a fost propusă o clasificare a AIH în 3 tipuri majore: tip I (asociat cu ANA şi/sau ASMA), tipul II (asociat cu anti-LKM1 şi/sau anti-LC) şi tipul III (asociat cu anti-SLA /LP). Tipul III de boală este controversat în sensul că nu este clar dacă acesta constituie o entitate în sine sau este o variantă a tipului I2;4;5.
Autoanticorpii apar la majoritatea pacienţilor cu AHI, dar rolul lor în patogeneză este încă discutabil. De asemenea, nu există o corelaţie clară între activitatea sau prognosticul bolii şi titrul de autoanticorpi.
Principalii autoanticorpi asociaţi cu AIH sunt:
• Anticorpii antinucleari (ANA)
• Anticorpii anti – fibră musculară netedă (ASMA)
• Anticorpii anti-LKM1
• Anticorpii anti-LC1 (liver cytosol type 1)
• Anticorpii anti-SLA (soluble liver antigen)/LP (liver-pancreas)1;4;6.

Anti-LKM1 recunosc ca antigen ţintă citocromul p450 2D6 (CYP2D6) de 50 kDa, antigen microsomal din reticulul endoplasmic. Anticorpii sunt îndreptaţi către un epitop situat între aminoacizii 263-270 ai CYP2D6. Expresia acestui antigen la suprafaţa hepatocitelor ar putea sugera rolul patogenic al acestor anticorpi. Ei se întâlnesc cu o frecvenţă mai mare în populaţia pediatrică unde titrul lor poate fi utilizat pentru a monitoriza activitatea bolii şi răspunsul la tratament.
Anti-LKM1 mai pot fi întâlniţi cu frecvenţă redusă (1-2% din cazuri) la pacienţii având hepatită cronică cu virus C precum şi în hepatita la halotan.
ASMA sunt îndreptaţi împotriva unor structuri din componenţa citoscheletului ca actina, troponina, tropomiozina, vimentina (predominant împotriva F-actinei). ASMA au fost detectaţi prin imunofluorescenţă indirectă pe stomac, rinichi şi ficat de rozătoare, deoarece acestea conţin cantităţi crescute de actină în structura musculară. Autoanticorpii anti-actină se asociază cu debutul precoce al bolii (au relevanţă crescută în patologia pediatrică), cu prezenţa haplotipului HLA A1-B8-DR3, cu recăderi frecvente ale tratamentului şi cu indicaţie de transplant1;6;7.
Anti-SLA au fost descrişi în 1987 ca fiind îndreptaţi împotriva unei proteine din citosol care se găseşte în concentraţii crescute în ţesutul hepatic şi renal. Anti-LP au fost descrişi înaintea anti-SLA (1981), de către un grup diferit de cercetători, ca având reactivitate faţă de o proteină solubilă dintr-un lizat omogen de ficat şi pancreas. Ulterior s-a demonstrat că anti-SLA si anti-LP sunt identici (anti SLA/LP) şi că antigenul ţintă este reprezentat de o proteină citosolică de 50 kDa ce este implicată în biosinteza seleno-proteinelor (UGA-suppressor serine-tRNA-associated protein). Aceşti anticorpi sunt înalt specifici pentru AIH având o prevalenţă de 10-30%1;2;4. În plus, a fost identificată o corelaţie semnificativă între serurile ce prezintă anti-SLA/LP şi anti-Ro-52, în sensul că pacienţii anti-SLA/LP şi anti-Ro-52 pozitivi au o activitate crescută a bolii hepatice şi o evoluţie mai severă7.
Anti-LC1 apar in AIH tip II, fiind detectaţi la 50% din serurile LKM positive. Unii autori îl asociază cu ANA şi ASMA şi de asemenea cu hepatita cronică cu virus C. Ei recunosc ca antigen ţintă formiminotransferaza-ciclodeaminaza şi se corelează cu activitatea bolii 2;4;7.

Alţi anticorpi care mai pot apărea în AIH sunt :
• p-ANCA atipici
• anti-LKM3 (ţinta antigenică este reprezentată de uridin-difosfat glucuronoziltransferaza şi sunt întâlniţi la pacienţi cu hepatită cronică D şi AIH tip II)
• anti-LKM2 (îndreptaţi împotriva CYP2C9 şi asociaţi cu hepatita la ticrynafen)
• anti-receptor pentru asialoglicoproteine (ASGP-R, sunt întâlniţi atât la pacienţi cu AIH cât şi cu hepatită virală; se corelează cu activitatea histologică)1.
• anti-D-3 fosfoglicerat dehidrogenaza (anti-PGDH) au fost detectaţi în studiul condus de Xiang D et al la 80% din pacienţii cu hepatită autoimună netratată şi la 61% dintre cei care au primit corticoterapie8.
Diversitatea serologică a anticorpilor a condus la ipoteza că AIH reprezintă un grup heterogen de boli. Această ipoteză este susţinută de asocierea în 10-18 % din cazuri a unui sindrom multiorganic (APECED) caracterizat prin candidiază mucocutanată cronică, distrofie ectodermală şi distrucţie tisulară autoimună a diferitelor glande endocrine (hipoparatiroidism, insuficienţă suprarenaliană, hipogonadism)1;7.

Ciroza biliară primitivă (PBC) apare în 90% din cazuri la femei de vârstă mijlocie. Incidenţa bolii în diferite regiuni ale lumii este de 4-31 cazuri /1 million locuitori/an. Clinic, pacienţii prezintă fatigabilitate, prurit, artralgii, dureri abdominale, icter obstructiv intermitent. Patognomonici pentru această afecţiune sunt anticorpii antimitocondriali (AMA) care apar la 95% din pacienţi. Ei sunt îndreptaţi predominant asupra subunităţii E2 a complexului piruvat dehidrogenazei (PDC-E2, antigen M2). Acest antigen este exprimat la nivel hepatic, în jurul ductelor biliare, iar autoanticorpii vor duce la distrucţia canaliculelor biliare cu colestază secundară. Diagnosticul PBC este luat în considerare dacă:
1. testele de colestază sunt pozitive (ALP, GGT)
2. AMA sunt pozitivi
3. examenul histopatologic este sugestiv (colangită cronică non-supurativă cu distrucţie progresivă a ductelor biliare şi fibroză).

Boala poate afecta atât ficatul cât şi glandele cu funcţie exocrină (glande salivare, lacrimale, pancreas). Titrurile AMA crescute susţin diagnosticul de PBC şi pot avea valoare predictivă pentru dezvoltarea ulterioară de PBC la pacienţi cu simptome de colestază. AMA mai pot fi detectaţi şi în sindroame overlap PBC-AIH, scleroza sistemică (6%) şi sindromul Sjögren1;5;6.
Anti-M2-3E (anti-BPO, anti-MIT3) sunt îndreptaţi împotriva unei proteine rezultate din fuziunea celor 3 subunităţi E2 a BCOADH (branched-chain 2-oxoacid dehydrogenase), a piruvat dehidrogenazei (PDH) precum şi a oxoglutarat dehidrogenazei (OGDH). Deoarece 4-13% din serurile pacienţilor cu PBC recunosc doar antigenul BCOADH-E2 utilizarea testului anti-M2-3E poate creşte sensibilitatea de detecţie a PBC în comparaţie cu testele clasice anti-M2 (PDC-E2)7.

Alţi autoanticorpi specifici PBC sunt:
• Anti-gp210 recunosc un antigen de 210 kDa al membranei nucleare şi apar la 10-47% din pacienţii cu PBC, fiind asociaţi cu o evoluţie severă a bolii.
Anti-Sp100 apar la 20% din pacienţii cu PBC şi sunt îndreptaţi împotriva unor structuri numite corpi nucleari (“nuclear dots”) care în imunofluorescenţa indirectă prezintă un aspect punctat şi care au fost puşi în evidenţă pentru prima dată în nucleii celulelor maligne. Aceşti corpi nucleari ce conţin fibre non-cromatiniene reprezintă un complex alcătuit din următoarele componente: antigenul sp100, antigenul PML (promyelocytic leukemia factor), LYSP 100, NDP55 şi NDP 53.
• Anti-NUP62 (Nucleoporina p62) apar în 32% din cazurile de PBC5;7.
Mai puţin specifici pentru PBC sunt anticorpii anti receptor lamin B şi anti-ciclină A. De asemenea, mai pot fi întâlniţi:
– anticorpi anti-proteinele centromerului (CENP A, CENP B) care prezintă aparent o asociere cu hipertensiunea portală; sunt detectaţi frecvent şi în sindroamele overlap PBC/scleroză sistemică9;
anticorpi anti-Ro-52 ce sunt detectaţi în aproximativ 28% din cazurile de PBC fiind asociaţi cu modificări histologice mai avansate, niveluri IgM şi ale bilirubinei serice mai crescute în comparaţie cu pacienţii fără anti-Ro-527.

Tratamentul PBC impune reducerea colestazei şi îmbunătăţirea funcţiei hepatice; constă în administrarea de acid ursodeoxicolic şi colestiramină. În cazuri severe este indicat transplantul hepatic1;3;6.
O situaţie aparte este reprezentată de sindroamele overlap PBC-AIH în care anticorpii AMA se asociază cu cei din AIH (10-20% din cazuri). Aceste sindroame pot coexista de la început (PBC-AIH) sau PBC poate progresa către AIH. Identificarea sindroamelor overlap este foarte importantă datorită eficacităţii dovedite a tratamentului corticosteroid. Pentru diagnosticul sindroamelor overlap AIH-PBC au fost elaborate criteriile Paris5:

 Criterii pentru PBC Criterii pentru AIH
1. Activitatea fosfatazei alcaline in ser ≥2x limita superioara a normalului sau activitatea GGT in ser ≥5x Activitatea ALT in ser ≥5x limita superioara a normalului
2. AMA pozitivi Nivelul IgG in ser ≥2x limita superioara a normalului sau ASMA pozitivi
3. Biopsie hepatică ce indică leziuni floride de ducte biliare Biopsie hepatică ce indică “piecemeal necrosis” moderată/severă periportală sau periseptală
  Pentru diagnosticul de sindrom overlap PBC – AIH sunt necesare cel putin 2 din cele 3 criterii acceptate pentru fiecare conditie

Colangita sclerozantă primitivă (PSC) apare cu o incidenţă de 4 cazuri la 100 000 locuitori/an. Tabloul clinic este dominat de simptomele şi semnele de colestază. Diagnosticul se bazează pe modificările testelor de laborator, examenul histologic şi colangiopancreatografia endoscopică retrogradă (ERCP). Sunt afectaţi în principal bărbaţii, iar în 50% din cazuri se asociază şi colita ulceroasă. Autoanticorpii identificaţi în această afecţiune sunt p-ANCA cu aspect atipic în imunofluorescenţa indirectă, îndreptaţi impotriva antigenelor: catepsină G, lactoferină, catalază, alfa-enolază. Aceştia pot apărea ocazional şi în AIH şi PBC1;6.

Recomandări pentru efectuarea profilului extins boli hepatice autoimune – Blot – diagnosticul cirozei biliare primitive, creşteri ale transaminazelor de etiologie neclară, pacienţi cu suspiciune clinică de hepatită autoimună; sindroame overlap1;7.

Pregătire pacient à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)7.
Specimen recoltat sânge venos7.
Recipient de recoltare vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator7.
Prelucrare necesară după recoltare se separă serul prin centrifugare7.
Volum probă – minim 1 mL ser7.
Cauze de respingere a probei:
• specimen hemolizat;
• specimen icteric, lipemic;
• specimen contaminat bacterian7.
Stabilitate probă serul separat este stabil 14 zile la 2-8ºC şi timp îndelungat la -20ºC. Nu decongelaţi/recongelaţi6.
Metodă imunoblot. Testul utilizează 14 antigene native şi recombinate purificate, care sunt fixate în cip-uri paralele pe membrana unui strip. Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării pe strip, de:
AMA M2: antigen nativ purificat
– M2-3E (BPO): antigen recombinant
Sp100: antigen recombinant
PML: antigen recombinant
gp210: antigen recombinant
LKM1: antigen recombinant
LC-1: antigen recombinant
SLA/LP: antigen recombinant
 SS-A: antigen nativ purificat
– Ro 52: antigen recombinant
– Scl-70: antigen nativ purificat
– CENP-A: antigen recombinant
– CENP-B: antigen recombinant
– PGDH: antigen recombinant.

Într-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele purificate este incubat împreună cu serul diluat al pacientului. Dacă în ser sunt prezenţi anticorpi specifici aceştia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe strip. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu fosfataza alcalină. Conjugatul se va ataşa la porţiunea IgG a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluţia de colorare (substratul enzimei) – un sistem de detecţie enzimatică colorimetrică . Dacă este prezent conjugatul legat reacţia enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legării anticorpilor specifici de antigenele individuale de la nivelul strip-ului. Pe fiecare strip există o bandă de control intern. Apariţia unei reacţii de culoare intense la acest nivel certifică faptul că toate etapele testului imunoblot au fost executate corect7.

Valori de referinţă şi interpretarea rezultatelor

Interpretarea definitivă a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor) care în funcţie de intensitatea semnalului, acordă un punctaj pentru fiecare bandă a strip-ului, astfel:

EVALUARE SEMNALINTENSITATE SEMNAL                     REZULTAT
Fără bandă                 0-5               0       NEGATIV
Bandă slabă                 6-10             (+)     ECHIVOC
Bandă medie-intensă   11-25 sau 26-50           +,++     POZITIV
Bandă foarte intensă             >50           +++     INTENS POZITIV
În final este calculată suma punctelor acordate şi se va genera rezultatul testului.
Un rezultat pozitiv confirmă prezenţa anticorpilor specifici .
Un rezultat echivoc indică faptul că prezenţa auto- anticorpilor este incertă; în funcţie de contextul clinic al pacientului testul va fi repetat la un interval de 1-2 luni.
Un rezultat negativ indică absenţa auto-anticorpilor specifici.
 
Valori de referinţă:
Anti-AMA M2: negativ
Anti-M2-3E: negativ
Anti-sp100: negativ
Anti-PML: negativ
Anti-gpP210: negativ
Anti-LKM 1: negativ
Anti-LC1: negativ
Anti-SLA/LP: negativ
Anti-SS-A: negativ
Anti-Ro 52: negativ
Anti-Scl-70: negativ
Anti-CENP A: negativ
Anti-CENP B: negativ
Anti-PGDH: negativ7.

Bibliografie

  1. A. J. Czaja. Autoantibodies as prognostic markers in autoimmune liver disease. In Digestive Diseases and Sciences, vol. 55, no. 8, pp. 2144–2161, 2010.
  2. Ashima Makol et al. Autoimmune Hepatitis: A Review of Current Diagnosis and Treatment. In Hepatitis Research and Treatment, volume 2011 (2011).
  3. Christian P. Strassburg. Autoantibodies and Autoantigens in Autoimmune Hepatitis. In Semin Liver Dis. 2002 Nov;22(4):339-52.
  4. Kalliopi Zachou, et al. Autoantibodies and autoantigens in autoimmune hepatitis: important tools in clinical practice. In Journal of Autoimmune Diseases, 2004, 2: 1740-1757.
  5. Edith Kuiper. Primary billiary cirrhosis: Diagnostic and Therapeutic Aspects. Erasmus University Medical Centre Rotterdam.
  6. D.P. Bogdanos. Autoimmune liver serology: current diagnostic and clinical challenges. In World Journal of Gastroenterology, 2008, 14(21):3374-87.
  7. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2015. Ref Type: Catalog.
  8. Xiang D, Xia Q, Chen D, Feng X, Zhao Y, Liu Y, Liao H, Liu Y, Li N, Yan H. Detection of D-3-phosphoglycerate dehydrogenase autoantibodies in patients with autoimmune hepatitis: Clinical significance evaluation. Hepatol Res. 2011 Sep;41(9):867-76.
  9. Dellavance A, Cançado EL, Abrantes-Lemos CP, Harriz M, Marvulle V, Andrade LE.Humoral autoimmune response heterogeneity in the spectrum of primary biliary cirrhosis. Hepatol Int. 2012 Dec 5;7(2):775-784.
Abonează-te la Newsletter