facebook

Virusul hepatitei E – Anticorpi IgG, IgM (Westernblot)

560 Lei
Trimite pe e-mail acest articol
Printeaza acest articol

Informaţii generale

Virusul hepatitei E (HEV), recent inclus în genul Hepevirus al familiei Hepeviridae, cauzează o infecţie acută, de obicei, autolimitantă. Este un virus sferic, lipsit de înveliş, cu diametru de 27-34 nm, alcătuit dintr-un genom ARN monocatenar cu polaritate pozitivă. Sunt descrise 4 genotipuri majore şi un singur serotip. Genomul prezintă 3 cadre de citire (open reading frames = ORF): ORF1 codifică metiltransferaza, proteaza, helicaza şi replicaza; ORF 2 codifică proteina capsidei; ORF3 codifică o proteină a cărei funcţie nu a fost definită4.

HEV se transmite pe cale fecal-orală; consumul de apă potabilă contaminată cu fecale este responsabil de apariţia majorităţii epidemiilor. Transmiterea directă de la o persoană la alta este neobişnuită. Transmiterea pe cale sexuală sau prin transfuzii nu a fost dovedită1;4.

Hepatita cu virus hepatitic E este endemică în Asia de sud-est şi centrală, cu mai multe focare în Orientul Mijlociu, Africa de nord şi de vest şi Mexic, datorita condiţiilor de igienă deficitară. In ţările dezvoltate infecţiile HEV apar în special la persoanele care au călătorit în zonele unde boala este endemică.

Recent au fost descrise în ţările industrializate cazuri de infecţii HEV sporadice, în absenţa călătoriilor în străinătate, adesea cu evoluţie subclinică sau asimptomatică. Majoritatea acestor cazuri denumite “autohtone” sunt asociate cu genotipul 3 HEV care prezintă o omologie marcată a secvenţelor cu genotipul 3 izolat de la porcine. Se ia astfel în considerarea posibilitatea unor infecţii zoonotice transmise de la porcine sau alte animale. Cazurile severe apar la adulţii tineri sau de vârstă mijlocie (3%), dar mortalitatea este scăzută, cu excepţia femeilor gravide infectate în ultimul trimestru de sarcină (mortalitate aproximativ 20%).

Tabloul clinic este asemănător celui din hepatita A. După o perioadă de incubaţie ce durează între 15 şi 60 de zile, pacienţii infectaţi cu HEV dezvoltă semne şi simptome de hepatită (febră, hepatomegalie, creşterea moderată a transaminazelor), cu apariţia anticorpilor anti-HEV de tip IgM în ser, urmate de nivele detectabile de anticorpi anti-HEV IgG în termen de câteva zile. Anticorpii anti-HEV IgM pot rămâne pozitivi până la 6 luni de la debutul simptomelor, în timp ce anticorpii de tip IgG persistă, de obicei, ani de la infecţie. Viremia şi excreţia virusului în fecale apar în faza preicterică şi continuă şi în faza clinică. Urmărirea pe termen îndelungat a pacienţilor cu hepatită E acută a infirmat posibilitatea cronicizării infecţiei şi existenţa stării de carrier1;2;3.

Recomandări pentru determinarea HEV:

– detectarea infecţiei recente cu virus hepatitic E;
– monitorizarea pacienţilor postinfecţie3. 

Pregătire pacient – preferabil à jeun (pe nemâncate)1.

Specimen recoltat – sânge venos1.

Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator1.

Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare în ziua recoltării1.

Volum probă – minim 2 mL ser1.

Cauze de respingere a probei –  specimen intens hemolizat; specimen contaminat bacterian1.

Stabilitate probă – serul este stabil 6 zile în condiţii ambientale; 7 zile la 2-8°C; timp îndelungat la -20°C; evitaţi decongelarea/recongelarea repetată1.

Metodă Imunoblot

Testul utilizează antigene recombinate purificate, relevante serologic, care sunt separate pe baza greutăţii moleculare prin electroforeza în gel de poliacrilamidă în prezenţa de sodium dodecil sulfat (SDS-PAGE) şi transferate ulterior electroforetic pe o membrană de nitroceluloză (Western blotting). Situsurile de legare libere de pe membrană sunt saturate cu o soluţie de proteine, după care matricea este spălată şi tăiată în fâşii (strip-uri). Sunt detectaţi separat anticorpii de tip IgG şi IgM. Selectarea proteinelor omoloage de la două genotipuri diferite (genotipul 1 şi 3) asigură o sensibilitate înaltă chiar şi pentru cazurile de infecţie provenite din zonele non-endemice (“autohtone”). Testul detectează cele 4 genotipuri HEV şi poate fi folosit atât pentru screening-ul cât şi pentru confirmarea infecţiei.

Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării pe strip, de:

O2N: porţiunea N-terminală a proteinei ORF2;
O2C: porţiunea C-terminală a proteinei ORF2;
O2M: porţiunea mijlocie a proteinei ORF2;
O3: proteina ORF3.

Intr-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele HEV este incubat împreună cu serul diluat al pacientului. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat, în funcţie de clasa de anticorpi testată, cu un conjugat anti-IgG sau anti-IgM uman marcat cu peroxidază. Conjugatul se va ataşa la complexul antigen-anticorp format. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluţia de colorare – un sistem de detecţie enzimatică colorimetrică care conţine peroxid de hidrogen. Dacă este prezent conjugatul legat, reacţia enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpii specifici. Astfel, benzile vizualizate sunt rezultatul legării anticorpilor specifici de antigenele individuale recombinate de la nivelul strip-ului1.

Valori de referinţă şi interpretarea rezultatelor

Fiecare strip conţine în partea superioară o bandă de control care reprezintă controlul reacţiei necesar pentru a confirma efectuarea corectă a testului.

Intensitatea benzilor probelor este comparată cu cea a benzii O2C a controlului slab pozitiv inclus obligatoriu la fiecare rulare. Sunt posibile următoarele exprimări semicantitative:

Intensitate bandă

Exprimare rezultat

Absenţa

Intensitate mai mică decât cea a benzii O2C a controlului slab pozitiv

+/-

Intensitate comparabilă cu cea a benzii O2C a controlului slab pozitiv

+

Intensitate mai mare decât cea a benzii O2C a controlului slab pozitiv

++

Interpretarea definitivă a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor) care în funcţie de intensitate (de la – la  ++) acordă un punctaj pentru fiecare bandă a strip-ului de la 0 la 3.

 In final este calculată suma punctelor acordate şi se va genera rezultatul testului1:

Suma punctelor

Rezultat test Imunoblot IgG

<3

Negativ

3

Echivoc

>3

Pozitiv

 

Suma punctelor

Rezultat test Imunoblot IgM

<5

Negativ

5

Echivoc

>5

Pozitiv

 
Obţinerea unui rezultat pozitiv pentru anticorpii anti-HEV de tip IgM confirmă diagnosticul de infecţie recentă (în ultimele 6 luni).
Obţinerea unui rezultat pozitiv pentru anticorpii anti-HEV de tip IgG indică o infecţie în antecedente sau o infecţie acută în faza de covalescenţă.
In cursul infecţiei acute se înregistrează o reactivitate a anticorpilor anti-HEV IgG cu toate componentele proteice ORF2 şi ORF3. Intensităţile benzilor O2N şi O3 scad în timp, însă intensitatea benzii O2C creşte progresiv, astfel ca în cazul infecţiilor vechi anti-HEV IgG sunt îndreptaţi în principal asupra porţiunii C-terminale a proteinei ORF23.

Limite şi interferenţe

Obţinerea unui rezultat negativ pentru anticorpii anti-HEV de tip IgM nu exclude întotdeauna o infecţie recentă (în ultimele 6 luni) deoarece  aceştia sunt prezenţi în medie 6-7 săptămâni de la debutul infecţiei (dar nu mai mult de 6 luni) la aproximativ 80% din pacienţii infectaţi. La restul bolnavilor diagnosticul este stabilit în urma detecţiei ARN viral în ser sau materii fecale.
In unele cazuri anticorpii anti-HEV de tip IgG apar la 2-4 săptămâni de la debutul clinic şi de aceea testarea trebuie repetată pentru confirmarea prezenţei anticorpilor specifici2;3.

 

Bibliografie

1. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2010. Ref Type: Catalog
2. Lothar Thomas. Hepatitis E. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany, 1 Ed., 1998,1282-1284.
3. Mayo Clinic/Mayo Medical Laboratories. Test Catalog. Hepatitis E Antibody, IgM, IgG , Serum. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.
4. Panda SK, Thakral SA, Rehman S. Hepatitis E virus. In Rev Med Virol  2007, 17(3):151-180. 
Abonează-te la Newsletter