facebook instagram

Profil miozita extins – Blot (Mi-2α, Mi-2β, TIF-1γ, MDA5, NXP2, SAE1, Ku, PM-Scl100, PM-Scl70, Jo-1, SRP, PL-7, PL-12, EJ, OJ)

268 Lei

Informaţii generale şi recomandări pentru determinarea profilului miozită

Miopatiile inflamatorii idiopatice reprezintă un  grup de afecţiuni caracterizate prin slăbiciunea musculaturii proximale a membrelor, atrofie musculară, semne biochimice  şi electromiografice de leziune musculară, anomalii histologice, modificări cutanate caracteristice. Apar cu o incidenţă de 0,1-1/100 000 locuitori/an şi sunt mai  frecvente la femei. Din acest grup fac parte: polimiozita, dermatomiozita, miozita cu corpi de incluziune, miozita asociată cu neoplazie (sindrom paraneoplazic) şi miozita asociată cu alte boli ale ţesutului conjunctiv1;2.

Din punct de vedere histologic miozita poate fi diferenţiată în miozită interstiţială fără distrucţia fibrei musculare, miozită focală cu infiltrat inflamator şi leziuni ale fibrei musculare şi miozită difuză. Polimiozita (PM)  se caracterizează clinic prin febră, slăbiciune musculară, artralgii, posibil sindrom Raynaud. În dermatomiozită (DM)  pacienţii prezintă eritem violaceu periorbital asociat sau nu cu edem, eritem care se poate extinde ulterior pe braţe, mâini şi membre inferioare. Testele de laborator evidenţiază creşterea enzimelor musculare (CK, AST, LDH) şi pozitivitatea marker-ilor de inflamaţie (CRP, VSH).

Ca şi în cazul sclerozei sistemice, autoanticorpii specifici joacă un rol major în diagnosticul şi clasificarea diferitelor variante ale acestor afecţiuni (incluzând şi sindroamele overlap), cu atât mai mult cu cât prevalenţa anticorpilor antinucleari este marcat scăzută (40-60%) comparativ cu lupusul eritematos sistemic. Aceşti autoanticorpi recunosc ţinte antigenice multiple: tipuri de ARN de transfer (ARNt), aminoacil-t-ARN-sintetaze, componente ale particulei de recunoaştere a semnalului (“signal recognition particle”, SRP), factori translaţionali, componente ale complexului de remodelare a nucleozomului, însă cei mai importanţi sunt cei direcţionaţi împotriva aminoacil-t-ARN-sintetazelor (familie de enzime care se găseşte în toate celulele nucleate şi care are rolul de a ataşa un anumit aminoacid de ARNt-ul propriu). Prezenţa autoanticorpilor se asociază cu anumite subseturi de boală, având valoare predictivă pentru diferite manifestări clinice şi pentru prognosticul bolii1;2;3;4.

Anticorpii anti-Jo-1 sunt îndreptaţi împotriva enzimei histidil-t-ARN sintetaza. In vitro aceşti autoanticorpi se leagă de epitopii conformaţionali ai enzimei şi îi inhibă activitatea catalitică. Antigenul este sub formă dimerică şi este localizat  în citoplasmă; masa moleculară a subunităţilor este 50 kDa. Prevalenţa anticorpilor anti-Jo-1 în polimiozită şi dermatomiozită este de 20-40%; autoanticorpii pot fi detectaţi precoce, uneori precedând debutul simptomelor. La copii anticorpii anti-Jo-1 sunt extrem de rari. Pacienţii cu anticorpi anti-Jo-1 prezintă o triadă tipică de simptome: polimiozită (>90%), polisinovită (artralgii, artrită deformantă nonerozivă, tenosinovită în 50% din cazuri), alveolită fibrozantă sau fibroză pulmonară (60%). Se mai pot adăuga: fenomen Raynaud (40%), febră (20%), “mâna mecanicului” (30%). Acest tablou este cunoscut sub numele de sindrom anti-sintetază. Mai mult de 90% din pacienţii caucazieni cu anti-Jo-1 prezintă alela HLA DR31;2;3;5

Deşi anticorpii direcţionaţi asupra altor aminoacil-t-ARN-sintetaze: anti-PL-7 (anti-treonil-t-ARN-sinteza), anti-PL-12 (anti-alanil-t-ARN-sintetaza), anti-EJ (anti-glicil-t-ARN-sintetaza) şi anti-OJ (anti-leucil-t-ARN-sintetaza) sunt mult mai puţin frecvenţi decât anti-Jo-1, aceştia sunt asociaţi cu aceleaşi manifestări clinice compatibile cu sindromul anti-sintetază6. De obicei un pacient prezintă un singur tip de anticorpi anti-sintetază, dar au fost descrise şi cazuri în care au fost depistaţi toţi cei 5 autoanticorpi. Sindromul anti-sintetază răspunde moderat la terapia cortizonică. Deoarece toate sintetazele se găsesc în citoplasmă (sediul sintezei proteice), autoanticorpii determină un aspect fin  citoplasmatic  în imunofluorescenţa indirectă ce foloseşte ca substrat celulele Hep-23.

Anti-PL-7 apar cu o prevalenţă de 3-6% la pacienţi cu miozită, mai ales în sindroame overlap (LES, scleroza sistemică, fibroza pulmonară interstiţială).

Anti-PL-12 sunt detectaţi cu o prevalenţă de 3% la pacienţi cu miozită.

Anti-EJ  şi anti-OJ apar în polimiozită dar şi în sindroame overlap6.

Anticorpii anti-Mi-2 se leagă de un complexul proteic nuclear alcătuit din mai multe componente. Sunt descrise 2 proteine ale antigenului ţintă Mi-2: Mi-2α (240 kDa) şi Mi-2β (218 kDa). Deşi aceste proteine sunt distincte, ele prezintă o serie de motive de helicază şi de secvenţe identice, ceea ce sugerează că ar avea o funcţie similară ADN helicazelor din nucleu. Mi-2β formează un complex proteic cu histon-deacetilazele (NuRD = nucleosome remodeling deacetylase complex) şi participă la reglarea expresiei genice prin acetilarea histonelor, determinând remodelarea structurii nucleozomilor. Anticorpii anti-Mi-2 apar la 10-30% dintre pacienţii cu miopatii inflamatorii idiopatice, în special dermatomiozită, fiind asociaţi cu modificări cutanate specifice (cum ar fi papulele Gottron şi rash-ul heliotrop) şi lipsa afectării pulmonare. Cei mai mulţi dintre pacienţii cu anticorpi anti-Mi-2 sunt purtători ai alelei HLA DR7. Forma de boală este benignă, cu răspuns bun la terapia cortizonică. Totuşi, există şi cazuri de dermatomiozită cu anticorpii anti-Mi2 (predominant Mi-2β) asociate unei neoplazii (de colon sau mamare)2;6;7;8.

Anticorpii anti-Mi-2α (CHD3, chromodomain-helicase-DNA-binding protein 3) prezintă aceeaşi semnificaţie diagnostică ca şi anticorpii anti-Mi-2, înregistrând o prevalenţă de aproximativ 20% în dermatomiozită.

Anticorpii anti-Mi-2β (CHD4, chromodomain-helicase-DNA-binding protein 4, helicaza CHD4 ATP-dependentă) sunt detectaţi mai frevent în dermatomiozita asociată unei neoplazii (de colon sau mamare)6.

Anticorpii anti-Ku sunt îndreptaţi împotriva unui antigen proteic nucleolar de tip heterodimer, compus din două subunităţi cu masa moleculară de 70 şi respectiv 80 kDa, component al unui complex enzimatic al proteinkinazei dependente de ADN. Acest complex deţine un rol important în procese celulare legate de translaţie, repararea ADN-ului şi rearanjarea genelor implicate în sinteza imunoglobulinelor, precum şi a receptorilor celulelor T.  Anticorpii anti-Ku sunt întâlniţi într-un spectru larg de boli ale ţesutului conjunctiv, în special sindroame overlap sclerodermie-miozită, dar şi LES (3-10%). Aspectul în imunofluorescenţa indirectă este de tip granular (pătat); de asemenea a fost descrisă o asociere cu alela HLA DQw1. Prevalenţa anticorpilor anti-Ku în afecţiunile autoimune este variabilă, originea etnică fiind un element important. Spre exemplu, în America de Nord şi Europa au fost descrise cazuri de LES asociaţi cu anticorpi anti-Ku, dar nu şi în Japonia. Sindromul Sjögren primar, ca şi hipertensiunea pulmonară primitivă constituie alte condiţii clinice frecvent asociate cu anti-Ku2;6.

Anticorpii anti PM-Scl sunt îndreptaţi împotriva complexului nucleolar compus din 11-16 polipeptide, a căror funcţie nu a fost încă determinată1. Anticorpii sunt detectaţi în peste 90% din cazurile de sindrom overlap  sclerodermie-polimiozită (sclerodermatomiozită), dar numai la ~8% din toate cazurile de miozită şi ~3% din toate cazurile de sclerodermie9. Prognosticul este relativ favorabil la acest grup de pacienţi. Se asociază cu HLA DR3 şi anticorpi anti-nucleari cu aspect nucleolar omogen în imunofluorescenţă1;4. În laborator se detectează separat cei doi autoanticorpi principali: anti PM-Scl100 şi anti PM-Scl756.

Anti-SRP (“signal recognition particle”) reacţionează cu un component de 54 kDa al complexului SRP care are rolul de a media transportul de proteine nou sintetizate spre reticulul endoplasmatic. Au fost descrişi la pacienţi cu polimiozită şi dermatomiozită (până la 4% din cazuri), în special la femei de rasă neagră. Anti-SRP sunt markeri pentru miopatia necrozantă  caracterizată prin slăbiciune acută severă proximală şi simetrică a musculaturii scheletice asociată cu durere musculară; este afectată şi musculatura cardiacă. Boala se asociază cu rată de mortalitate crescută şi răspuns slab la terapia cortizonică1;2.

Anti-TIF1g (transcriptional intermediary factor 1-gamma) sunt detectaţi la aproximativ 15% din pacienţii cu dermatomiozită (atât în forma adultă cât şi cea juvenilă) având valoare diagnostică înaltă. Aceşti autoantcorpi sunt îndreptaţi împotriva unor factori nucleari de transcripţie ce fac parte din familia TIF-1, în special TIF1-γ şi sunt asociaţi cu leziuni cutanate severe. În plus, nivelurile ridicate de anti-TIF1-γ indică un risc crescut de dermatomiozită paraneoplazică la adult, în timp ce un rezultat negativ exclude o malignitate concomitentă, datorită valorii predictive negative crescute a testului6;8.

Anti-NXP2 sunt îndreptaţi împotriva unei proteine de 140 kDa, denumită proteina 2 a matricei nucleare (nuclear matrix protein 2) care deţine rol în reglarea apoptozei indusă de proteina p53 după stimuli oncogenici. Aceşti autoanticorpi au fost raportaţi în aproximativ 25% din cazurile de dermatomiozită, atât la adult cât şi la copil, fiind mai rari detectaţi în polimiozită. Au fost asociaţi cu prezenţa calcinozei, a leziunilor cutanate severe şi a contracturilor musculare. La adult, boala poate acompania o neoplazie (mamară, uterină sau pancreatică). Împreună cu anti-TIF1-γ sunt înregistraţi în peste 50% din cazurile de boală în care sunt absenţi autoanticorpii „clasici” şi sunt asociaţi independent cu un proces malign6;8.

Anti-MDA5 (melanoma-differentiation-associated protein 5) sunt îndreptaţi împotriva unui autoantigen indus de interferon – proteina 5 asociată cu diferenţierea melanomului – care reglează răspunsul imun antiviral înnăscut împotriva ARN-ului viral citoplasmatic. Au fost descrişi iniţial în populaţia asiatică. Sunt detectaţi în 13-26% din cazurile de dermatomiozită, demonstrând o specificitate înaltă pentru dermatomiozita paraneoplazică (95% din pacienţi sunt anti-MDA5 pozitivi) cât şi pentru dermatomiozita combinată cu boală interstiţială pulmonară6;8.

Anti-SAE1 sunt îndreptaţi împotriva unei proteine nucleare mici, similară structural cu ubiquitina, ce este implicată posttranslaţional în agregarea enzimatică/conjugarea proteinelor, proces denumit „sumoylarea proteinelor”. Sunt detectaţi în 8% din cazurile de dermatomiozită la adult, fiind asociaţi cu leziuni cutanate severe, disfagie şi manifestări sistemice; prognosticul este însă favorabil8.

Pregătire pacient à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)6.

Specimen recoltat sânge venos6.

Recipient de recoltare vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator6.

Prelucrare necesară după recoltare se separă serul prin centrifugare6.

Volum probă – minim 1 mL ser6.

Cauze de respingere a probei

  • specimen hemolizat;
  • specimen icteric, lipemic;
  • specimen contaminat bacterian6.

Stabilitate probă serul separat este stabil 14 zile la 2-8ºC şi timp îndelungat la -20ºC. Nu decongelaţi/recongelaţi6.

Metodă imunoblot. Testul utilizează 15 antigene native şi recombinate purificate, care sunt fixate  in cip-uri paralele pe membrana unui strip. Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării pe strip, de:

Mi-2α: antigen recombinant

Mi-2β: antigen recombinant

TIF-1γ: antigen recombinant

MDA5: antigen recombinant

NXP2: antigen recombinant

SAE1: antigen recombinant

Ku : antigen recombinant

PM-Scl100: antigen recombinant

PM-Scl70: antigen recombinant

Jo-1: antigen nativ purificat

SRP: antigen recombinant

PL-7: antigen recombinant

PL-12: antigen recombinant

EJ: antigen recombinant

OJ: antigen recombinant

Într-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele purificate este incubat împreună cu serul diluat al pacientului. Dacă în ser sunt prezenţi anticorpi specifici aceştia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe strip. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu fosfataza alcalină. Conjugatul se va ataşa la porţiunea IgG a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluţia de colorare (substratul enzimei) – un sistem de detecţie enzimatică colorimetrică . Dacă este prezent conjugatul legat reacţia enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legării  anticorpilor specifici de antigenele individuale de la nivelul strip-ului.

Pe fiecare strip  există o bandă de control intern. Apariţia unei reacţii de culoare intense la acest nivel certifică faptul că toate etapele testului imunoblot au fost executate corect6.

Interpretarea definitivă a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor) care în funcţie de intensitatea semnalului, acordă un punctaj pentru fiecare bandă a strip-ului, astfel:

 

EVALUARE SEMNALINTENSITATE  SEMNALREZULTAT
  Fără  bandă                  0-5               0       NEGATIV
 Bandă slabă                 6-10             (+)      ECHIVOC
Bandă medie-intensă   11-25 sau 26-50           +,++      POZITIV
Bandă foarte intensă              >50           +++     INTENS POZITIV

În final este calculată suma  punctelor acordate şi se va genera rezultatul testului.

Un rezultat pozitiv confirmă prezenţa anticorpilor specifici.

Un rezultat echivoc indică faptul că prezenţa auto- anticorpilor este incertă; în funcţie de contextul clinic al pacientului testul va fi repetat la un interval de 1-2 luni.

Un rezultat negativ indică absenţa auto-anticorpilor specifici6.

Valori de referinţă

Mi-2α: negativ

Mi-2β: negativ

TIF-1γ: negativ

MDA5: negativ

NXP2: negativ

SAE1: negativ

Anti-Ku: negativ

Anti-PM-Scl100: negativ

Anti-PM-Scl75:negativ

Anti-Jo-1: negativ

Anti-SRP: negativ

Anti-PL-7: negativ

Anti-PL-12: negativ

Anti-EJ: negativ

Anti-OJ: negativ

Anti-Ro-52: negativ6.

 

Bibliografie

  1. Rudolf Mierau, Ekkehard Genth. Autoantibodies in Systemic Rheumatic Diseases. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. Lothar Thomas. TH-Books Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany,1 ed. 1998, 831-832.
  2. Ruxandra Ionescu. Boli inflamatoare musculare. În Esenţialul în Reumatologie, Editura Amaltea, 2007, 399-408.
  3. Athanasios G. Tzioufas. Antisynthetase Syndrome. In Orphanet Encyclopedia, Nov. 2001. Ref Type: Internet Communication.
  4. Carlos Albertos von Mühlen, Robert M. Nakamura. Clinical and Laboratory Evaluation of Systemic Rheumatic Diseases. In Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 8, 919, 923.
  5. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: Jo 1 Antibodies, IgG, Serum. www.mayomedicallaboratories.com Ref Type: Internet Communication.
  6. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2016. Ref Type: Catalog.
  7. Nakashima R, Mimori T. Significance of Myositis-Specific and Myositis-Associated Autoantibodies: Myositis-specific Autoantibodies. www.medscape.org. 2010.
  8. Ghirardello A, Borella E, Beggio M, Franceschini F, Fredi M, Doria A. Myositis autoantibodies and clinical phenotypes. Auto Immun Highlights. 2014 Dec; 5(3): 69–75.
  9. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Test Catalog: PM-Scl Antibody. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.

 

 

 

 

 

 

 

Termeni şi condiţii. | Politica de confidentialitate. | Politică privind fișierele cookies.