Analiza medicală Determinare factor Rh fetal din sânge matern se poate recolta în zilele de luni până miercuri, în timpul programului de recoltare al locației alese.
Informații generale: Determinare factor Rh fetal din sânge matern
Testarea va fi efectuată numai după consimțământul informat al pacientelor.
Pentru efectuarea acestei analize este necesar un document doveditor (rezultat analiză) pe numele pacientei – care atestă că este Rh negativă.
Context clinic
Sistemul grupelor sanguine Rh a fost extensiv studiat și își păstrează o relevanța din punct de vedere clinic, în special în domeniul medicinii transfuzionale, în managementul incompatibilităților materno-fetale (etiologia bolii hemolitice a fătului și a nou-născutului) și a anemiei hemolitice autoimune.
Este cel mai extins dintre cele 29 de sisteme de grupe sanguine și al doilea cel mai semnificativ clinic, după sistemul de grup sanguin ABO. De asemenea, avand peste 50 de tipuri de antigene descrise in prezent, sistemul Rh este considerat cel mai imunogen și polimorf, comparativ cu celelalte sisteme de grup sanguin, din cauza variațiilor genetice complexe determinate de aparitia unor deleții, conversii genetice, variante punctiforme și variante missense, care contribuie astfel la aceasta inalta diversitate antigenică a acestui sistem.
Din totalitatea antigenelor identificate în cadrul sistemului Rh, doar un numar de 5 dintre acestea – D, C, c, E și e – au o relevanță clinică. Aceste antigene sunt codificate de două gene omoloage- RHD și RHCE– localizate în strânsă apropiere, pe brațul scurt al cromozomului 1 (1p34–1p36). La nivel genetic, gena RHD codifică proteina RhD, iar gena RHCE codifică o polipeptidă care exprimă în diferite combinații antigenele C/c și E/e. Între cele două gene este localizata gena SMP1, al cărei rol funcțional nu este pe deplin elucidat. Împreună, genele RHD și RHCE vor genera un numar de opt haplotipuri principale, care codifică diferitele combinații ale antigenelor Rh mentionate (Dce, dce, DCe, dCe, DcE, dcE, DCE și dCE).
Proteinele Rh sunt proteine transmembranare hidrofobe, cu regiuni extracelulare ce prezintă epitopii antigenici. Structura proteică a RhD și RhCE este extrem de similară, primii 41 de aminoacizi fiind comuni, fapt ce sugerează o origine comună prin duplicare genică. Pentru fixarea și funcționarea corectă în membrana eritrocitară, proteinele Rh necesită asocierea cu o glicoproteină de suport, denumită RhAG (Rh-associated glycoprotein), care, deși asemănătoare din punct de vedere structural, este codificată de o gena distincta, RHAG, situata pe brațul scurt al cromozomul 6 (6p12–21). Proteinele RhD, RhCE și RhAG formează familia Rh. De asemenea, complexul Rh este alcatuit dintr-o serie proteine accesorii, printre care, proteina asociată integrinei (CD47), glicoforina B, proteina banda 3 și glicoproteina LW (Landsteiner-Wiener), codificate pe cromozomii 3, 4 17 și respectiv, 19. Toate aceste componente contribuie la formarea complexului Rh, care, ce nu are o funcție complet elucidată dar se presupune ca are rol în menținerea integrității membranei eritrocitare și posibil în transportul inilor de amoniu.
Variabilitatea genetică a sistemului Rh determină o serie de fenotipuri cu importanță clinică, generate prin variante punctiforme, deleții și rearanjamente ale genelor RHD și RHCE. Printre aceste fenotipuri, cele mai semnificative sunt: RhD-negativ, D slab, D parțial, variantele RHCE și fenotipul Rhnul.
Fenotipul RhD-negativ este definit prin absența expresiei proteinei RhD pe suprafața eritrocitelor și este generat prin mecanisme genetice diferite, influențate si de factorii etnici. În populațiile europene, cel mai frecvent mecanism fiind deleția completă a genei RHD sau prezența unui codon stop prematur, în timp ce în populațiile africane, expresia sa este suprimată de prezența suplimentara a unei pseudogene.
Absența antigenului D determina consecințe clinice importante, deoarece expunerea la eritrocite RhD-pozitive, fie prin transfuzie, fie in cadrul sarcinii, poate avea drept consecință dezvoltarea de anticorpi anti-D și apariția reacțiilor de aloimunizare.
Fenotipul D slab reprezintă o modificare cantitativă a antigenului D, fiind caracterizat printr-o expresie redusă a acestuia și se întâlnește la aproximativ 1% dintre indivizii RhD-pozitivi. la nivel serologic. În aceste cazuri, testele serologice de rutină pot evidenția aglutinare slabă sau absentă acesteia, confirmarea necesitând utilizarea de globulină anti-umană. Această expresie redusă este determinată de variante care afectează transcripția genei RHD, manifestata prin cantitatea scăzută de proteine RhD pe suprafața eritrocitară. Cele mai frecvente genotipuri D slab sunt 1, 2 și 3, iar în context transfuzional, acestea sunt considerate RhD-pozitive. Totuși, în cazul femeilor aflate la vârstă fertilă, se recomandă genotiparea moleculară pentru a stabili necesitatea profilaxiei cu imunoglobuline anti-D în timpul sarcinii.
Fenotipul D parțial reprezintă o modificare calitativă a antigenului D, cauzată de conversii genice, variante punctiforme sau expresia unor epitopi rari. Deși acești pacienți sunt adesea identificați serologic ca fiind RhD-pozitivi, ei pot dezvolta anticorpi anti-D în urma expunerii la eritrocite RhD-pozitive, fiind necesare precauții speciale în context transfuzional sau obstetrical.
Variantele RHCE apar prin substituții nucleotidice unice sau multiple în cadrul genei RHCE. Diferența dintre alelele E și e constă într-o singură substituție de aminoacizi (Pro226Ala), în timp ce alelele C și c se disting prin patru substituții (Cys16Trp; Ile60Leu; Ser68Asn; Ser103Pro), doar polimorfismul Ser103Pro prezintă o corelație strictă cu antigenicitatea C/c. Expresia acestor variante este relevantă la pacienții care necesită transfuzii cronice, cum sunt pacientii cu anemie falciforma, deoarece aceștia au un risc crescut de aloimunizare, complicând astfel alegerea unor unități de sange compatibil.
Fenotipul Rhnul, extrem de rar, este caracterizat prin absența completă a antigenelor Rh de pe suprafața eritrocitelor. Acesta este divizat în două tipuri principale: tipul amorf (RHNA) și tipul regulator (RHNR).Tipul amorf este rezultatul unor variante inactivante în genele RHCE, în contextul absenței RHD, ceea ce va duce la suprimarea expresiei directe a genelor implicate în sinteza antigenelor Rh. Tipul regulator, mai frecvent întâlnit, este generat de variante ale genei RHAG, care afectează sinteza glicoproteinei RhAG, esențială pentru exprimarea antigenelor RhD și RhCE pe suprafața membranei eritrocitare. Clinic, pacienții cu fenotip Rhnul prezintă o durată redusa de viață a eritrocitelor, modificări morfologice caracteristice (incluzând sferocitoză, stomatocitoză) pe frotiul de sânge periferic și anemie hemolitică, de intensitate ușoară sau moderată. Gestionarea transfuzională este dificilă, deoarece unii dintre acești pacienți pot produce anticorpi anti-RH29, ceea ce duce la nevoia de administrare exclusiv de unități de sange Rhnul compatibile, în astfel de cazuri.
Sistemul de grupe Rh are o importanță majoră în medicina transfuzională și obstetrică, având un rol central în etiopatogeneza bolii hemolitice a fătului și a nou-născutului și a reacțiilor hemolitice post-transfuzionale.
Boala hemolitică a fătului și a nou-născutului, cunoscută și sub denumirea de eritroblastoză fetală, este o afecțiune cu potențial fatal, care survine în contextul incompatibilității RhD între mamă și făt, cel mai frecvent atunci când o femeie cu fenotip RhD-negativ este însărcinată cu un făt RhD-pozitiv. La interactiunea sistemului imun matern cu eritrocitele fetale RhD-pozitive poate sa apara un proces de alosensibilizare, cu dezvoltarea ulterioară de anticorpi anti-D indreptati impotriva eritrocitelor fetale.
Expunerea maternă la eritrocitele fetale și, implicit, riscul de alosensibilizare, poate apărea in urmatoarele situatii:
- în contextul travaliului și al nașterii, avortului spontan sau provocat, sarcinilor ectopice, traumelor abdominale, hemoragiilor vaginale în timpul sarcinii;
- ca urmare a unor intervenții invazive precum amniocenteza, biopsia de vilozități coriale ori in cadrul manevrei de versiune cefalică externă a fatului. În mod particular, riscul de sensibilizare crește în al treilea trimestru de sarcină, când creste permeabilitatea placentară pentru eritrocitele fetale.
Evenimentul imunologic inițial presupune sinteza de anticorpi IgM împotriva antigenului D, care nu pot traversa bariera placentară și astfel nu vor afecta prima sarcină. Incompatibilitatea materno-fetală RhD devine clinic relevantă, de regulă, în cadrul sarcinilor ulterioare, atunci când o femeie RhD-negativă a fost anterior sensibilizata, dezvoltand in urmatoarea sarcina, anticorpi de tip IgG indreptati împotriva antigenului D, capabili să pătrundă în circulația fetală, determinând astfel boala hemolitică a fătului și nou-născutului.
Manifestările clinice ale acestei hemolize includ anemie fetală, icter, hidrops fetal, kernicterus și, în cazuri severe, deces intrauterin. Nou-născuții supraviețuitori pot prezenta sechele cu întârzieri de dezvoltare, hipoacuzie (până la surditate) și hipotonie.
În absența antigenului D la ambii părinți, riscul de alosensibilizare este practic inexistent. În schimb, în cazul femeilor RhD-negative însărcinată cu un făt RhD-pozitiv, măsurile profilactice s-au dovedit esențiale.
Introducerea imunoprofilaxiei cu imunoglobulină anti-D în practica medicală a reprezentat un progres major în prevenirea acestei patologii. Implementarea profilaxiei postnatale la sfârșitul anilor 1960, urmată de extinderea către profilaxie antepartum în anii 1990, a condus la o reducere cu peste 90% a incidenței bolii hemolitice perinatale declansate de alosensibilizarea anti-D.
În prezent, administrarea profilactică de imunoglobuline anti-D rămâne un standard în îngrijirea prenatală pentru gravidele RhD-negative, contribuind în mod esențial la scăderea morbidității și mortalității neonatale asociate acestei afecțiuni.
Pregătire pacient
Nu este necesară
Specimen recoltat – sânge venos
Recipient de recoltare – 3 x vacutainer ce conține EDTA (total 9mL)
Cauze de respingere a probei – folosirea heparinei ca anticoagulant; probe coagulate sau hemolizate; volum insuficient; contaminarea probei.
Stabilitate probă – 3 zile la 2-8ºC
Metoda – Real-Time PCR. Analiza ADN-ului fetal liber circulant din plasma mamei. Evaluarea a trei regiuni critice ale genei RHD, respectiv exonii 5, 7 si 10 pentru determinarea genotipului RHD pozitiv sau negativ.
Testarea va fi efectuata numai dupa consimtamantul informat al pacientilor.
Interpretarea rezultatelor
Rezultatul pozitiv: secventa RHD este identificata si fatul este RhD pozitiv. Un rezultat pozitiv (genotip RHD pozitiv) este considerat final si profilaxia anti-D trebuie realizata in saptamana 28 de sarcina (prima doza) si apoi dupa nasterea fatului (a doua doza);
Rezultat negativ: secventa RHD nu a fost identificata. Fatul este RhD negativ sau cantitatea de ADN fetal circulant este prea mica. Un rezultat negativ inainte de saptamana 19 de sarcina este considerat provizoriu si trebuie confirmat la cel putin 2 alte saptamani, dupa saptamana 17 de sarcina. Profilaxia anti-D nu este necesara daca fatul este RhD negativ;
Rezultat neconcludent: secventa RHD este partial identificata. Cei 3 exoni ai genei RHD se amplifica asimetric datorita cantitatii reduse de ADN fetal circulant sau a existentei unei variante rare a genei RHD, codanta sau necodanta pentru antigenul RhD. Se recomanda repetarea testarii dupa cel putin 2 saptamani, dar dupa saptamana 17 de sarcina. In cazul unui rezultat final neconcludent, se considera fat RhD pozitiv si se va administra profilaxia anti-D. Determinarea fenotipului RhD se va efectua postnatal.
Indiferent de rezultatul testului non-invaziv de determinare a RhD fetal, se recomanda confirmarea RhD imediat dupa naștere, din sangele extras din cordonul ombilical, la fatul nascut de o mama RhD negativa, pentru a elimina eventualitatea unui rezultat fals-negativ, determinat de o varianta rara. In aceste cazuri, cu fat RhD pozitiv, mamei RhD negative i se va administra in primele 72 de ore de la naștere o doza standard de imunoglobulina anti-D (300 μg).
Limitări și interferențe
Testul este posibil doar pentru sarcinile cu făt unic, genotipul RHD nefiind determinabil pentru sarcini gemelare;
Este foarte probabil ca proba recoltată înainte de vârsta gestațională de 11 săptămâni să conțină o cantitate insuficientă de ADN fetal circulant;
In cazul obtinerii unui rezultat incert (aprox. 1%) va fi recomandata profilaxia anti-D;
Variante genetice rare ale genei RHD pot determina un rezultat fals-pozitiv in 0.2-0.3% din cazuri;
Rezultatele fals-negative pot fi determinate de un nivel scăzut de ADN fetal liber circulant, de degradarea ADN-ului fetal liber circulant sau de hemoliza probei de sânge recoltate.
Referințe
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK594252/
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2269/
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6007
- https://medicover-genetics.com/product/rhesus-factor/
- https://medicover-genetics.com/our-genetic-tests/reproductive-health/rhesus-factor-test/
- https://ashpublications.org/blood/article/95/2/375/138582/The-Rh-blood-group-system-a-review
- Sadeghi-Bojd Y, Amirizadeh N, Oodi A. RHD Genotyping of Rh-Negative and Weak D Phenotype among Blood Donors in Southeast Iran. Int J Hematol Oncol Stem Cell Res. 2021 Oct 1;15(4):213-220. doi: 10.18502 (https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8888359/)
