Testare imunohistochimică (IHC) – BRAF V600E

Coloratia imunohistochimica BRAF V600E

Informatii generale – Testare imunohistochimică (IHC) – BRAF V600E

Gena BRAF (omolog B1 al oncogenei virale a sarcomului murin v-raf) este localizata pe cromozonul 7q34 si codifica proteina numita serin-treoninkinaza (proteina b-Raf), cu actiune in aval de calea de semnalizare a enzimei protein-kinazae mutagen-activată (MAPK). Mutațiile activatoare (oncogenice) din gena BRAF, produse in totalitate în domeniul kinazei, activează constitutiv calea de semnalizare MAPK, ducând la creșterea proliferării celulare și a rezistenței la apoptoză.

Cea mai frecventă dintre mutațiile BRAF activatoare (mutația punctiforma T1799A- prin transversia timinei cu adenina) are ca rezultat o substituție a aminoacizilor valina (V) cu acidul glutamic (E) în poziția 600 a secvenței de aminoacizi structurali și este detectată în 12% din totalitate cancerelor colorectale. BRAF și cancerul colo-rectal  Colorația de tip IHC, folosind Ac monoclonali anti-BRAF V600E (VE1) (VENTANA), prin evidențierea absenței sintezei unor proteine din grupul proteinelor MMR (mismach repair) – tip MLH1 si MSH2– în cadrul fenomenului de instabilitate microsatelitară, ajută la diagnosticul diferențial între cancerul colorectal sporadic și tumorile apărute în sindrom Lynch (cu componentă ereditară).

Algoritm de screening pentru deficiența de reparare a nepotrivirii și evaluarea sindromului Lynch

Ghid practic al biomarkerilor pentru evaluarea cancerului colorectal ¹⁸

Context clinic  

Sindromul Lynch, descris în anii 1960 este caracterizat printr-un risc crescut dezvoltare a cancerului colorectal asociat cu pierderea funcției proteinelor MMR. Lipsa de sinteza a proteinelor tip MMR (MLH1, PMS2, MSH2 sau MSH6) este consecinta unui fenomen genetic de instabilitate microsatelitara (MSI) care va induce un risc mai mare, pe parcursul vieții, nu doar de aparitie a cancerului colorectal, ci și a cancerului gastric, cerebral, de pancreas, de piele, endometru sau ovar.

Pacienții diagnosticati cu sindrom Lynch au un risc cuprins intre 50-80% de a dezvolta pe parcursul vieții cancer colorectal. Sindromul Lynch este unic, comparativ cu alte sindroame ereditare de cancer, deoarece prin testarea directă a țesutului tumoral se pot identifica pacienții cu suspiciune de sindrom Lynch, confirmat prin testare genetică ulterioară în linia germinală. Familiile în care a fost confirmat sindrom Lynch, beneficiază de protocoale avansate de screening pentru cancer. Ghidurile internaționale, inclusiv National Comprehensive Cancer Network (NCCN), recomandă ca toate cazurile cu cancer colorectal să fie evaluate si pentru confirmarea existentei sindromului Lynch, cu scopul identificarii pacienților ai caror membri din familie vor putea beneficia de testare genetica ulterioara și consiliere suplimentara.

Utilizarea panelului MMR IHC va ajuta la determinarea statusului MMR al cancerelor colorectale prin clasificarea lor ca intacte sau cu pierderea expresiei proteinelor MMR. Detectarea tuturor celor patru proteine MMR din tumoră indică un status MMR normal sau intact. Pierderea expresiei MLH1 sau MSH2 este aproape invariabil însoțită de pierderea partenerului său heterodimer, PMS2 sau, respectiv, MSH6. Cu toate acestea, pierderea expresiei PMS2 sau MSH6 nu duce la pierderea MLH1 sau MSH2. Pierderea expresiei PMS2, MSH2 și/sau MSH6 este în concordanță cu suspiciunea de sindrom Lynch, de aceea pacienții vor trebui îndrumați către testare suplimentară și consiliere, în acord cu practica clinică curentă.

Pierderea proteinei MLH1 poate indică apariția sporadică a tumorii sau un potențial sindrom Lynch. În 15% sau mai mult din cancerele colorectale sporadice, pierderea proteinei MLH1 este cauzată de hipermetilarea promotorului MLH1. Mutația BRAF V600E este observată în aproximativ două treimi din tumorile cu pierderea expresiei MLH1 prin hipermetilarea promotorului MLH1.

În schimb, mutația BRAF V600E este foarte rar observată în tumorile sindromului Lynch. Prin urmare, dacă colorația cu anticorp primar monoclonal de șoarece anti-MLH1 (M1) indică pierderea expresiei proteinei MLH1, utilizarea anticorpilor anti-BRAF V600E (VE1) poate confirma tumora ca sindrom Lynch sporadic sau probabil.

În cancerele colorectale, pierderea expresiei proteinei MLH1 asociat cu un status BRAF V600E pozitiv, confirma că tumora este rezultatul unor mutații sporadice, eliminând practic sindromul Lynch ca fiind cauza principală a malignității. Când pierderea expresiei proteinei MLH1 este asociata cu un status BRAF V600E negativ, aceasta indică o probabilitate ridicată de sindrom Lynch. În plus față de rolul său în diagnosticul si stratificarea cancerului colorectal, mutația de tip BRAF V600E este detectată în aproximativ 8% din totalitatea tumorilor solide, inclusiv in 43% din melanoame, 39% din carcinoamele tiroidiene papilare, 12% din carcinoamele ovariene seroase, 2% din adenocarcinom pulmonar și în alte tipuri de cancer. Mai mult, mutația BRAF V600E a fost descrisă recent ca un biomarker molecular in leucemia cu celule păroase.

Metoda de lucru:

Testele imunohistochimice se efectueză în cadrul unui sistem complet automat, utilizând sistemul BenchMark ULTRA (Ventana), cu respectarea protocoalelor recomandate de producător. Anticorpul VENTANA anti-BRAF V600E (VE1) se leagă în mod specific de proteina mutantă BRAF V600E din secțiunile de țesut fixate în formol, încorporate în parafină (FFPE). Anticorpul poate fi localizat folosind un anticorp secundar haptenat urmat de un conjugat multimer anti-hapten-HRP (OptiView DAB IHC Detection Kit). Reacția IHC se evidențiază la nivel citoplasmatic, expresia etalata fiin slaba, moderata sau puternica.

Specimen recoltat- tipuri:

•  fragmente tisulare, recoltate în cursul interventiilor chirurgicale, microchirurgicale sau biopsice, fixate ulterior în formol 10%, histoprocesate și incluse în parafină (blocuri de parafină)
• țesut inclus în blocuri de parafină. Recipient de recoltare:
• recipiente cu formol tamponat 10% (adaptate pentru dimensiunile fragmentelor tisulare recoltate, in raport minim 1:1)

Stabilitate probă

•  24-72 ore pentru fragmentele tisulare fixate în formol 10%
• timp îndelungat, în mediu ambiental, protejate de umezeală și radiațiile solare, pentru blocurile de parafină.

Tehnica de colorare imunohistochi BRAF V600E este o metoda de încredere pentru evaluarea stării mutaționale în carcinomul colorectal, indiferent de locul sau istoricul de tratament anterior, iar coloratia obtinuta arată un grad ridicat de omogenitate intratumorală.

Interpretarea rezultatelor:  Rezultatul IHC al coloratiei IHC cu anticorpi VENTANA anti-BRAF V600E (VE1) este interpretat de un patolog instruit, pe baza evaluarea intensității colorării specifice pentru VENTANA anti-BRAF V600E (VE1), așa cum este ilustrat mai jos. Un rezultat pozitiv este atribuit cazurilor cu colorație pozitivă și un rezultat negativ este atribuit cazurilor cu coloratie absentă. Coloratie negativa- rezultat negativ:

  H&E 4x      BRAF V600E 4x  

Coloratie pozitiva- rezultat pozitiv:

H&E 4x BRAF V600E 4x  

H&E 4x BRAF V600E 4x  

 Recomandari de utilizare:  Melanom – identifica formele tumorale sensibile la terapia cu inhibitori BRAF din clasele terapeutice: VEMURAFENIB SI DABRAFENIB

• Cancerul colorectal – diferentiaza sindromul Lynch (BRAF negativ) de tumorile apărute sporadic
• Melanom – diferentiaza tumorile Spitz de melanoamele spitzoide
• Neuropatologie – ajuta la diferentierea craniofaringioamelor papilare (95% BRAF V600E pozitive) de craniofaringioamele adamantinomatoase (BRAF V600E nonpozitive) si la diferentierea dintre glioblastoame si xantoastrocitoame pleomorfe
• Cancer tiroidian: colorația pozitivă este asociată cu risc crescut de cancer tiroidian papilar

Importanța în selectare tratament- tumori cu mutații BRAF

•  Datorită unei mai bune înțelegeri a rolului genei BRAF în creșterea tumorilor, s-au dezvoltat medicamente cu actiune țintită, numite inhibitori BRAF, care interferă cu mecanismul prin care proteina B-Raf controlează înmuțirea și creșterea celulară. Acest proces ajută la temporizarea creșterii tumorii, deși nu, în mod permanent.
• Există mai multe clase de inhibitori BRAF care au fost aprobați pentru utilizare in tratamentul anumitor tumori, cum ar fi dabrafenib, encorafenib și vemurafenib.

Terapiile combinate

•  Proteina B-Raf este parte din structura unui mecanism mai extins, numit calea RAS-RAF-MEK- Aceasta contribuie la reglarea dezvoltarii, diviziunii și supravietuirii celulare. Atunci când anumite componente ale acestei căi devin hiperactive în interiorul unei tumori, acest fenomen stimuleaza progresia unei tumorii maligne și potential, metastazarea.
• Pentru anumite tumori, inhibitorii BRAF în monoterapie pot furniza rezultate pozitive. În alte cazuri, se recomanda utilizarea unui inhibitor BRAF asociat cu o alta clasă de medicamente, sau mai multe tipuri de terapie care interfera cu calea RAS-RAF-MEK-ERK. Inhibitorii BRAF sunt adesea utilizați împreună cu inhibitorii MEK, cum ar fi trametinib, binimetinib, selumetinib sau cobimetinib, care acționează asupra unor componente diferite ale acestei căi.