Evaluare calitativă a genei de fuziune BCR-ABL (tehnica FISH)

Cromozomul Philadelphia reprezinta o anomalie cromozomiala a celulelor mieloide, dobandita in cursul vietii, responsabila de declansarea proliferarii necontrolate a acestora si manifestata sub forma mai multor tipuri de leucemie. Prezenta cromozomului Ph in liniile celulare mieloide, megacariocitare si eritroide, a sugerat originea anomaliei la nivel de celula stem pluripotenta medulara.

A fost descris de catre Nowell si Hungerford1 in 1960 in orasul care ii poarta numele. Metodologia din anii ’60 permitea vizualizarea unui cromozom 22 cu bratul lung scurtat la pacientii cu leucemie mieloida cronica (LMC). Cativa ani mai tarziu, cu tehnici de bandare Giemsa imbunatatite, Rowley a observat anomalia genetica reala si anume o translocatie intre cromozomii 9 si 223.

Din punct de vedere citogenetic, cromozomul Ph se formeaza in urma aparitiei a doua puncte de ruptura la nivelul cromozomilor 9 si 22, respectiv banda 9q34, unde este localizata gena ABL1, si banda 22q11 ce contine gena BCR. Translocatia celor doua segmente, t (9;22) (q34; q11) rezulta la nivel molecular prin alipierea spatiala a secventelor din BCR de cele ale ABL1, constituindu-se astfel gena de fuziune BCR-ABL, codanta pentru o oncoproteina driver a procesului neoplazic^1,4.

Punctele de ruptura pot avea mai multe localizari la nivelul acestor gene, iar produsul final de fuziune poate avea, in consecinta, dimensiuni si deci, efecte variate, in functie de domeniile genice translocate. Clasic, au fost descrise 3 oncoproteine rezultate in urma fuziunii BCR- ABL1, respectiv P190, P210 si P230, fiecare fiind asociata cu o anumita forma de leucemie. Asocierea este urmatoarea: LMC – P190, LAL – P210, LAM-P190/P210 si LMC neutrofilica – P230.

In mod fiziologic, gena ABL1 codifica enzima tirozin-kinaza ABL, cu rol in controlul cailor de semnalizare responsabile de proliferare celulara, mentinere a viabilitatii, precum si in migrare celulara. Aceasta proteina este exprimata in procesul de hematopoieza, iar activitatea sa scade fiziologic, odata cu maturarea mieloida. Gena BCR are un rol fiziologic in activarea raspunsului oxidativ al neutrofilelor.

Oncogena rezultata in urma translocatiei genereaza o enzima de tip tirozin-kinaza cu activitate permanenta, ceea ce va stimula proliferarea si o viabilitate crescuta a liniei celulare afectate, ce va scapa de sub controlul mecanismelor de reglare, fiziologice. De asemenea, aceasta oncoproteina va inhiba diferentierea celulara si apoptoza. Prezenta ei afecteaza urmatoarele cai de semnalizare celulara:

• JAK/STAT – prin stimulare
• PI3K-AKT-mTOR – prin stimulare
• MAPK-ERK (RAS/RAF/MEK/ERK) – prin stimulare
• Apoptoza indusa de TNFSF10(TRAIL) – prin supresie
• Diferentierea celulara mediata de factorii de transcriptie C/EBP – prin supresie

Studiile au evidentiat o reactie in lant la nivel celular, fiind generata secundar o instabilitate genomica care poate avea consecinta prognostica si terapeutica cum ar fi rezistenta la tratament sau severitatea crescuta5.

In prezent, cromozomul Ph este criteriul de diagnostic al LMC, dar sunt descrise si alte forme leucemice cu prezenta acestui tip de anomalie cromozomiala1,4 cum ar fi:

• Leucemia acuta limfoblastica (LAL) – mai frecvent cu limfocite B, rareori T: 11-29% dintre pacientii adulti, 1-3% in LAL pediatrice
• Leucemia acuta mieloida (LAM) – sub 1.5% din cazuri
• Leucemie acuta cu fenotip mix (MPAL) – cea mai frecventa anomalie genetica este prezenta cr Ph in aceste cazuri, fiind recunoscuta astfel ca entitate separata Ph pozitiva (MPAL Ph+), dar cu o frecventa sub 1% din cazurile de LA.

Metoda de testare: Citogenetica moleculara prin tehnica FISH (hibridizare fluorescenta in situ). Sangele recoltat este supus procesului de hibridizare cu sonde marcate fluorescent si specifice pentru genele BCR, ABL1 precum si o gena de control.

Astfel, poate fi vizualizat rapid, la nivel microscopic, daca exista, sau nu, acest produs de fuziune BCR-ABL1. Aceasta metoda este superioara analizei cromozomiale constitutionale datorita timpului redus de executie cu rezultate mai rapide, precum si datorita posibilitatii de analiza extinsa a unui numar standard de cel putin 200 de nuclei.

Desi rezultatul estimeaza procentual numarul de celule leucemice, metoda prin tehnica PCR este ”gold standard’’ pentru cuantificare si monitorizarea tratamentului, datorita sensibilitatii analizei si numarului mare de produsi analizati (sunt evaluate un numar de zeci de mii de transcripte).

Se recomanda aceasta metoda pentru diagnosticul rapid al debutului LMC sau LAL. Nu este recomandata pentru monitorizarea bolii reziduale⁶.

Recomandari testare – Evaluare calitativă a genei de fuziune BCR-ABL (tehnica FISH)

• diagnosticarea pacientilor cu suspiciune de LMC, LAL sau alte forme leucemice (sindroame mielodisplazice) cu potential Ph+ (FISH sau qRT-PCR)
• instituirea terapiei tintite Ph+ in cazurile nou diagnosticate
• evaluarea eficientei unei terapii instituite, prin stabilirea statusului Ph+/Ph- al unei leucemii deja diagnosticate clinic in vederea continuarii sau modificarii tratamentului cu inhibitori de tirozinkinaza (FISH sau qRT-PCR)

Raportarea si interpretarea rezultatelor
Rezultatele sunt raportate negativ sau pozitiv, rezultatele pozitive fiind insotite si de o valoare

procentuala a celulelor hematogene in care este prezent cromozomul Philadelphia.

Limitarile metodei

Pot exista situatii rare in care, desi cromozomul Ph este prezent, acesta nu poate fi identificat prin analiza rapida FISH, acest fenomen fiind consecinta unor translocatiilor atipice, in care se recomanda analiza prin tehnica PCR.

Bibliografie
1. Genetics, Philadelphia Chromosome, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK560689

2. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2010. Ref Type: Catalog.

3. Rowley JD. Genetics. A story of swapped ends. Science. 2013 Jun 21;340(6139):1412-3.

4. Kang ZJ et al., The Philadelphia chromosome in leukemogenesis. Chin J Cancer.2016 27;35:48.

5. Ilaria R. Bcr/Abl, leukemogenesis, and genomic instability: a complex partnership. Leuk Res. 2002 Nov;26(11):971-3

6. Bao F et al., Comparison of FISH and quantitative RT-PCR for the diagnosis and follow-up of BCR-ABL-positive leukemias. Mol Diagn Ther. 2007;11(4):239-45.

7. May, P.C., Reid, A.G., Robinson, M.E. et al. FISH-negative BCR::ABL1-positive e19a2 chronic myeloid leukaemia: the most cryptic of insertions. BMC Med Genomics 16, 172 (2023). https://doi.org/10.1186/s12920-023-01607-7

8. https://medlineplus.gov/lab-tests/bcr-abl1-genetic-test/