Mutatie BRAF (V600E)

Informații generale: Mutatie BRAF (V600E)

Proto-oncogena BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) cu locusul 7q34 este alcătuită din 18 exoni și codifică o serin/treonin protein-kinază de 84.4 kDa, din familia kinazelor Raf implicată în calea de semnalizare intracelulară Ras/Raf/MEK/ERK (MAPK/ERK), ce transmite semnale de la receptori celulari (de exemplu, EGFR - epidermal growth factor receptor = receptorul pentru factorul de creștere epidermică) la nucleu, cu rol în diferențierea, proliferarea, senescența și supraviețuirea celulară. Această cale de transducție a semnalului este activată constitutiv în numeroase tipuri de tumori maligne umane de obicei ca urmare a unor mutații ale oncogenelor KRAS și BRAF1;2;3. 

Mutațiile genei BRAF pot fi de două tipuri: 

• moștenite (ale liniei germinale) - asociate cu sindromul cardiofaciocutanat – condiție genetică rară caracterizată prin defecte cardiace, retard mental și un aspect facial distinctiv; 
• dobândite (somatice) - asociate cu forme diferite de cancer (limfom non-Hodgkin, cancer colorectal, melanom malign, cancer tiroidian papilar, cancer pulmonar altul decât cel cu celule mici –NSCLC, cancer ovarian)4;5. Aproximativ 7% dintre tumorile maligne umane conțin mutații BRAF. 

Până în prezent au fost identificate peste 50 mutații distincte ale genei BRAF multe dintre acestea fiind responsabile de creșterea activității BRAF de 1.5 până la 700 ori, în funcție de tipul mutației. Dintre mutațiile BRAF activatoare asociate cu tumori cea mai frecventă (responsabilă de peste 80% din cazuri) este V600E care are la bază o tranziție T-A la nivelul nucleotidei 1799 din exonul 15, ce induce o substituție a valinei cu acidul glutamic în codonul 600 din segmentul activator.
Consecința acestei mutații punctiforme missens este că situsul de activare al proteinkinazei devine expus (în mod normal fiind ascuns într-o pungă hidrofobă), ceea ce conduce la o activare constitutivă BRAF. Astfel, celulele maligne care prezintă mutațiaV600E proliferează într-un mod independent de factorul de creștere2. Mutația predispune de asemenea la inhibarea apoptozei, creșterea invazivității tumorii și reprezintă un eveniment timpuriu în cursul carcinogenezei.  

Această mutație a fost identificată în următoarele tipuri de tumori:

Cancerul tiroidian papilar 

Mutația V600E constituie cea mai frecventă modificare genetică în cancerul tiroidian papilar (~40-50% din cazuri). În urma unui studiu care a urmărit pe o perioadă de 15 ani evoluția unui grup de pacienți cu această formă de cancer s-a constatat că mutația V600E reprezintă un factor de prognostic nefavorabil independent de celelalte caracteristici clinico-patologice.

Melanomul malign 

Mutația este prezentă în aproximativ 50% din cazurile de melanom malign. Studii recente au arătat că V600E este asociată formei de boală cu risc înalt (debut precoce, afectarea primară a trunchiului, lipsa unei afectări cutanate cronice, supraviețuire redusă) și de aici importanța inhibării teraputice a proteinei Braf mutante. În 2011 FDA a aprobat medicamentul vemurafenib – inhibitor oral selectiv al activității kinazice a Braf ce conține mutația V600E - ca tratment în melanomul malign metastatic. Vemurafenib nu este
aprobat în cazul pacienților cu genă BRAF de tip sălbatic. 

Cancerul pulmonar altul decât cel cu celule mici (NSCLC) 

În NSCLC se raportează o frecvență a mutației de 1-4%. În această formă de cancer mutația BRAF V600E este prezentă mai frecvent la femei, fiind asociată cu o formă histologică agresivă și cu un prognostic rezervat9. 

Cancerul ovarian

Într-un studiu recent publicat s-a constatat că mutația V600E este asociată cu tumori ovariene în stadiu inițial, histologie de tip borderline seros (cu potențial malign redus) și cu prognostic favorabil. Observațiile pot influența abordarea terapeutică a pacientelor cu
această formă de tumori ovariene10. 

Leucemia cu celule păroase (Hairy-cell Leukemia, HCL) 

Mutația somatică V600E a fost recent descrisă ca un marker molecular pentru HCL. Deoarece prezența sa a fost constatată la majoritatea pacienților se consideră că mutația deține un rol esențial în patogenia bolii. De asemenea formele refractare ar putea beneficia de tratamentul cu inhibitori BRAF11.

Cancerul colo-rectal (CRC) 

Calea de semnalizare intracelulară MAPK/ERK este perturbată frecvent în cancerul colorectal, supraexpresia EGFR fiind raportată în aproximativ 50% din cazuri, iar mutații activatoare ale genelor KRAS și BRAF în 30-50% și, respectiv, 10% din cazuri3 (vezi fig.1)
Celulele epiteliale normale din colon, în evoluția lor spre malignitate, pot urma mai multe căi: 

• secvența tradițională adenom-carcinom asociată cu instabilitate cromozomială și caracterizată prin acumularea treptată de mutații ale unor gene specifice - APC, KRAS și TP53 - ce induc modificări displazice progresive ale epiteliului colonic;
• o cale asociată cu instabilitatea microsateliților (MSI), mutații BRAF și metilarea extensivă a ADN-ului; 
• o cale de “fuziune” asociată cu metilarea enzimei O-6 metilguanin-ADNmetiltransferaza (MGMT), mutația KRAS și inactivarea genei care codifică proteina tumorală p53 (TP53). 

Deși mutațiile BRAF au fost observate în principal în CRC sporadic cu MSI, acestea au fost detectate într-un procent mic și în formele de cancer cu stabilitate a microsatelitiților (MSS). În particular, mutațiile BRAF au fost găsite mai frecvent în polipii colonici premaligni și în CRC timpuriu. Deoarece prezența concomitentă a mutațiilor KRAS și BRAF este rar întâlnită în polipii colonici premaligni și în stadiile timpurii de CRC, acestea sunt considerate mutații alternative sau mutații ce se exclud reciproc12. 

Atât mutațiile KRAS cât și cele BRAF nu sunt decât în mod excepțional prezente în CCR asociat cu sindromul Lynch (sindromul cancerului colorectal nonpolipozic ereditar - HNPCC). Această afecțiune este cauzată de mutații ale liniei germinale ce afectează genele care intervin în repararea erorilor apărute la nivelul materialului genetic în timpul procesului de replicare – MMR (MMR – “mismatch repair genes”) reprezentate de MLH1, MSH2, MSH6, PMS2. 

Alterarea funcției acestor gene este strâns asociată cu fenomenul MSI, respectiv inserția sau deleția unor scurte unități repetitive (tip CA) din constituția microsateliților (segmente de ADN alcătuite din secvențe care cuprind 1-5 perechi de nucleotide, repetate în tandem
și localizate în regiunile codificatoare sau necodificatoare ale unor gene). Din acest motiv, testarea țesuturilor tumorale pentru prezența MSI împreună cu demonstrarea pierderii expresiei proteinelor MMR prin imunohistochimie este utilă pentru stabilirea diagnosticului de sindrom Lynch.  

Totuși trebuie avut în vedere faptul că fenotipul tumoral asociat cu MSI nu este limitat la cancerele ereditare, fiind întâlnit și în aproximativ 20% din cazurile de CRC sporadic. Astfel, testarea MSI nu poate distinge între o mutație somatică (sporadică) și o mutație a liniei germinale (moștenită) și nici nu poate identifica gena afectată. De asemnea nici testarea imunohistochimică nu poate face această distincție, deși identifică gena responsabilă. 

Cel mai adesea prezența unor defecte MMR în CRC sporadic se datorează unor anomalii la nivelul genei MLH1, iar cea mai frecventă cauză de inactivare a genei este hipermetilarea promotorului (fenomen epigenetic). Mai mult, în aproximativ 70% din tumorile care prezintă hipermetilarea promotorului MLH1 a fost identificată mutația BRAF V600E. Este important faptul că mutația V600E nu a fost identificată până în prezent în tumori asociate cu mutații MLH1 ale liniei germinale. Astfel, testarea mutației BRAF V600E poate diferenția o mutație a liniei germinale de o inactivare somatică/epigenetică MLH113. 

Testarea mutației V600E în CRC prezintă și implicații terapeutice. Deoarece Braf kinaza este situată în aval de EGFR și KRAS în cascada MAPK, tumorile ce conțin mutația V600E cu activare persistentă a acestei căi de transducție a semnalului sunt rezistente la orice tip de terapie anti-EGFR. Prin urmare, înainte de administrarea tratamentului cu inhibitori de tirozinkinază EGFR este necesară testarea prezenței mutației V600E a genei BRAF pentru identificarea corectă a pacienților care pot beneficia de terapie3. 

Recomandări pentru testarea mutațiilor BRAF la nivelul codonului V600

• în CRC metastatic pentru selectarea pacienților la care este oportună administrarea unui inhibitor EGFR (marker molecular cu valoare predictivă privind răspunsul la tratamentul anti-EGFR); 
• screening-ul sindromului Linch în cazul tumorilor cu MSI ce demonstrează imunohistochimic pierderea expresiei proteinei MLH1; 
• în melanomul malign pentru a anticipa răspunsul clinic la inhibitori BRAF (de exemplu vemurafenib) sau MEK; 
• în carcinomul tiroidian papilar pentru evaluarea prognosticului6;14.

Condiții de recoltare: 

Pregătire pacient 

nu este necesară

Specimen recoltat - țesut inclus în blocuri de parafină

Stabilitate probă - timp îndelungat, în mediu ambiental, protejate de umezeală și radiațiile solare

Metodă - PCR. Sunt evaluate variațiile codonului 600 al genei BRAF (V600E, V600K, V600D, V600M, V600R, V600G). Pentru V600E, analiza evaluează c.1799T>A si c.1799_1800delinsAA, dar nu poate diferenția intre cele două alterări nucleotidice.

Testarea va fi efectuată numai după consimțământul informat al pacienților.

Raportarea și interpretarea rezultatelor

Un rezultat negativ înseamnă că în proba evaluată nu este prezentă niciuna dintre variantele investigate. 

Un rezultat pozitiv va menționa varianta detectată conform nomenclaturii actuale HGVS, urmat de recomandarea medicală. 

Limitarile metodei

• Degradarea ADN poate afecta capacitatea testului de detecție. 
• Cantitatea insuficientă de celule tumorale, respectiv ADN, în proba analizata, poate furniza un rezultat fals-negativ. 
• Variante genice adiacente mutatiilor investigate, dar pentru care metoda nu a fost validata, pot interfera cu rezultatul.

Bibliografie 

1. BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1). In Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology. http://atlasgeneticsoncology.org. Reference Type: Internet Communication.

2. Safaee Ardekani G, Jafarnejad SN, Tan L, Saeedi A, Li G. The Prognostic Value of BRAF Mutation in Colorectal Cancer and Melanoma: A Systematic Review and Meta- Analysis. In PloS 2012;7(10):e47054.

3. Tie J, Desai J. BRAFV600E as a Therapeutic Target in Colorectal Cancer. In European Oncology, 2010:6(1):60-4. 

4. BRAF (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1). www.ncbi.nlm.nih.gov. Reference Type:Internet Communication. 

5. Sarcozy A, Carta C et al. Germline BRAF mutations in Noonan, LEOPARD and cardiofaciocutaneous Syndrome: moleculatr diversity and associted phenotypic spectrum. In Hum. Mutat. 2009 Apr;30(4):695-702.

6. BRAF V600E Mutation Detection. Henry Ford Health System. Pathology and Laboratory Medicine. www.henryford.com. Reference Type: Internet Communication. 

7. Elisei R, Ugolini C et al. BRAFV600E Mutation and Outcome of Patients with Papillary Thyroid Carcinoma: A 15-Year Median Follow-Up Study. In J. Clin. Endocrinol. Metab. 2008 Oct;93(10):3943-9.

8. Vora N, Buehler B et al. Melanoma and BRAF. Medscape Reference. https://emedicine.medscape.com. 2011.

9. Marchetti A, Felicioni L, et al. Clinical features and Outcome of patients with Non-Small- Cell Lung Cancer Harboring BRAF Mutations. In JCO Sept. 2011, vol.29, no.26, 3574- 3579. 

10. Grisham RN, Iyer G, et al. BRAF mutation is associated with early stage disease and improved outcome in patients with low-grade serous ovarian cancer. In Cancer 2013 Feb 1;119(3):548-54. 

11. Dietrich S, Glimm H. BRAF Inhibition in Refractory Hairy-Cell Leukemia. In N Engl J Med 2012; 366:2038-2040. 

12. Monticone M, Biollo E et al. Gene expression deregulation by KRAS G12D and G12V in a BRAF V600E context. In Mol Cancer, 2008;7: 92. 

13. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. BRAF Mutation (V600E) Analysis. www.mayomedicallaboratories.com. Reference Type: Internet Communication, 2016. 

14. Cleveland Clinic Laboratories. BRAF V600E Mutation Analysis. Reference Type: Internet Communication, 2016.

15. Laborator Synevo. Referințele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2016. Ref Type: Catalog.