Teste de laborator

Pachete de analize medicale

Planșa anatomică

Teste de la A la Z A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z
Teste Laborator
Product categories
Pachete analize Plansa anatomica
< inapoi la lista

Chlamydia trachomatis ARNr + N. gonorrhoeae ARNr – urină

SKU: BM184 Durata 10 zile
* estimare valabilă doar pentru centrele din București
Urină (din primul jet)

Pret 105.00 lei

Informații generale

Infecțiile cu Chlamydia trachomatis (CT) și Neisseria gonorrheae (GC) sunt două din cele mai frecvente boli cu transmitere sexuală din lume. Luând în considerare doar Statele Unite ale Americii, Centers for Disease Control and Prevention (CDC) a raportat în 2010 1,307,893 cazuri noi de infecție cu Chlamydia trachomatis și 309,341 cazuri noi de infecție cu Neisseria gonorrhoeae1.

Chlamydia este o bacterie Gram negativă de dimensiuni foarte mici, obligatoriu intracelulară datorită faptului că nu își poate sintetiza ATP-ul, fiind cultivabilă doar în celulele vii eucariote (ouă embrionate sau culturi celulare).

Clasificări recente împart Chlamydiile în 4 familii, dintre care cea mai importantă în patologia umană este familia Chlamydiaceae, care conține două genuri:

• genul Chlamydia – cel mai important reprezentant fiind C. trachomatis;
• genul Chlamydophila – C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum, C. abortus, etc.

Chlamydia trachomatis este întâlnită aproape în exclusivitate la om. Sunt descrise 15 serovaruri implicate în diverse infecții, serovarurile D și K fiind cauzele majore de infecție chlamidiala la femei și bărbați2;3.

Pentru infecția cu Chlamydia trachomatis, grupa de vârstă cea mai afectată este 15-25 ani, prevalența infecției fiind între 2 și 25%.

Perioada de incubație a bolii variază în general între 1 și 3 săptămâni, ajungând în unele cazuri la 6 săptămâni. O mare parte a infecțiilor evoluează asimptomatic: 75% din infecții la femei și 50% din infecții la bărbați. In cazurile simptomatice la bărbat pot apărea uretrita și proctita în fază acută; în lipsa tratamentului se poate instala cronicizarea cu epididimită, prostatită și artrita reactivă. Manifestările clinice la femeie constau în uretrită, cervicită și bartolinită care se pot complica cu: endometrită, salpingită, pelviperitonită, perihepatită precum și artrita reactivă.

Caracterul asimptomatic al multor infecții cu Chlamydia trachomatis este responsabil de subdiagnosticarea acestora, cu importante consecințe mai ales la femei datorită corelației dovedite între infecția netratată și complicații cum ar fi sarcina ectopică și infertilitatea.

Fiind o boală cu transmitere sexuală evaluarea partenerilor este obligatorie pentru a preveni reinfecțiile.

Ca și în cazul altor boli cu transmitere sexuală infecția cu Chlamydia trachomatis poate facilita transmiterea infecției HIV. În plus, nou-născuții se pot infecta la trecerea prin canalul cervical și pot dezvolta conjunctivită, faringită și pneumonie4;5;6.

Diagnosticul de laborator al infecțiilor cu Chlamydia trachomatis include izolarea agentului patogen în culturi celulare, depistarea antigenului prin imunofluorescență directă (DFA) sau metode imuno-enzimatice și determinarea materialului genetic bacterian prin tehnici moleculare. Deoarece culturile celulare sunt laborioase și necesită timp nu se folosesc de rutină fiind apanajul unor laboratoare speciale. Mai mult, conform datelor din literatura de specialitate, dezvoltarea tehnologiilor de amplificare a acizilor nucleici (NAAT) a îmbunătățit semnificativ sensibilitatea clinică a detecției CT, astfel că izolarea acestui patogen în culturi celulare nu mai este considerată metoda „gold standard”.

La ora actuală în SUA cele mai multe programe de screening și teste de laborator sunt bazate pe această tehnologie4;6.

Neisseria gonorrhoeae, un diplococ Gram negativ, este agentul etiologic al gonoreei, una din cele mai frecvente boli cu transmitere sexuală.

La bărbați infecția este în cele mai multe cazuri simptomatică, fiind asociată cu uretrita anterioară însoțită de secreție purulentă. Perioada de incubație este de 1-10 zile. La femei principala localizare a infecției este endocervixul. Se descrie o prevalență crescută a coinfecțiilor cu Chlamydia trachomatis și Trichomonas vaginalis precum și asocierea cu vaginoza bacteriană. Multe dintre femei rămân asimptomatice și din acest motiv nu se prezintă la medic. Atunci când apar manifestările clinice acestea sunt reprezentate de secreții vaginale modificate, disurie, dispareunie, sângerări intermenstruale. Alte posibile localizări ale infecției gonococice sunt rectul, faringele, conjunctiva; rareori se pot produce infecții diseminate. Copiii născuți din mame infectate pot prezenta conjunctivită.

În absența tratamentului antibiotic adecvat se pot dezvolta complicații acute sau tardive, cum ar fi: epididimita sau prostatita la bărbați; boala inflamatorie pelvină, perihepatita, infertilitate, sarcini ectopice la femei4;5;6.

N. gonorrhoeae este un germene labil care nu supraviețuiește în probele ce sunt recoltate în afara laboratorului. Din acest motiv, diagnosticul microbiologic bazat pe cultură are valoare scăzută în aceste cazuri. Ca și în cazul infecțiilor cu CT, dezvoltarea tehnologiilor NAAT a îmbunătățit depistarea infecțiilor cu gonococ, aceste tehnici prezentând în mod evident o serie de avantaje în comparație cu metodele clasice de cultivare:

• deoarece este detectat ADN-ul bacterian nu este necesar ca microorganismul să fie viabil;
• prezintă o sensibilitate mai mare;
• la bărbați testul poate fi efectuat din urină, ceea ce crește complianța pacienților la investigație7.

Ca o concluzie la cele menționate mai sus, Chlamydia trachomatis (CT) și Neisseria gonorrhoeae (GC) sunt agenții patogeni cel mai frecvent implicați în bolilele cu transmitere sexuală de cauză bacteriana. Foarte important, coinfecția CT-GC este raportată în aproximativ 30% din cazuri (mai frecvent la femei) de unde și necesitatea testării combinate a celor doi patogeni.

Diagnosticul precoce al infecțiilor constituie o provocare deoarece o mare parte din persoanele afectate nu prezintă simptome. În absența diagnosticului și tratamentului pot conduce la infecții diseminate la bărbați și la boala inflamatorie pelvină la femei cu consecințe tardive semnificative: infertilitate, sarcină ectopică, durere pelvină cronică5;8. În cazul ambelor infecții este posibilă transmiterea perinatală cu dezvoltarea conjunctivitei la nou-născut. De asemenea, CT și GC se asociază cu risc crescut de transmitere a infecției HIV. Una din cele mai bune metode de a preveni complicațiile infecțiilor CT și GC este screening-ul adolescenților și adulților tineri precum și a femeilor gravide. Dacă o persoană este diagnosticată cu una sau ambele infecții toți partenerii sexuali trebuie testați și tratați corespunzător5.

Ghidul CDC (Centers for Disease Control and Prevention) recomandă ca screening-ul să se efectueze cu teste de amplificare a acizilor nucleici cu sensibilitate și specificitate înaltă, confirmând faptul că metodele moleculare constituie în prezent standardul de diagnostic al infecțiilor CT și GC4.

Metodele bazate pe tehnologia NAAT, disponibile în acest moment, includ reacțiile PCR (polymerase chain reaction), LCR (ligase chain reaction), SDA (strand displacement amplification) și TMA (transcription-mediated amplification)8. Folosirea pe scară din ce în ce mai largă a tehnologiei NAAT pentru detecția CT și NG a pus în evidență faptul că, așa cum a fost menționat mai sus, multe dintre infecțiile genitale sunt asimptomatice9.

În laboratorul nostru se utilizează metoda automatizată TMA care, spre deosebire de celelalte metode menționate ce se bazează pe amplificarea ADN-ului bacterian, amplifică ARN-ul ribozomal (ARNr). Testul APTIMA COMBO 2 permite detecția calitativă simultană a CT și GC și propune de asemenea o nouă abordare moleculară prin combinarea tehnologiilor “target capture”, TMA (Transcription Mediated Amplification) și DKA (Dual Kinetic Assay). Avantajul major al acestei metode, versus alte metode NAAT, constă în faptul că țintește moleculele de ARNr, acestea fiind prezente în celule într-un număr mai mare comparativ cu moleculele de ADN, ceea ce conduce la o creștere a sensibilității, reducând astfel riscul de rezultate fals negative.

Principiul metodei

Testul include 3 etape:

  • Captura țintei
  • Amplificarea
  • Detecția

Probele sunt colectate și transferate în tuburile de transport corespunzătoare. Soluțiile din aceste tuburi eliberează moleculele ARNr și le protejează de degradare în cursul stocării.

Captarea ARNr – molecula țintă – este efectuată cu ajutorul unor oligonucleotide de captură care se leagă de alte nucleotide prezente pe suprafața unor microparticule magnetice. Oligomerii de captură utilizează secvențe complementare regiunilor specifice ale moleculei țintă care se atașează de acestea în timpul etapei de hibridizare. Complexele astfel formate sunt separate magnetic și spălate de mai multe ori pentru îndepărtarea substanțelor care pot interfera sau pot inhiba reacția de amplificare ulterioară, reducându-se astfel riscul de rezultate fals negative.

Reacția de amplificare este bazată pe abilitatea primerilor (oligonucleotide) complementari de a se lega specific și de a facilita amplificarea enzimatică. Testul APTIMA permite replicarea unei secvențe specifice din regiunea 23S a ARNr pentru CT și 16S pentru GC. Pentru fiecare moleculă țintă este utilizat un set unic de primeri. Reacția TMA utilizează două enzime – ARN-polimeraza și revers-transcriptaza – amplificarea realizându-se în condiții izotermice, spre deosebire de tehnicile PCR. În prima etapă a procesului de TMA un primer promotor hibridizează cu ținta ARN ribozomal. Reverstranscriptaza recunoaște această secvență a primerului promotor și creează o copie ADN a ARN-ului țintă (cDNA, ADN complementar). Secvența de ARN din hibridul ADN: ARN va fi apoi eliminată prin activitatea de RNaza H a reverstranscriptazei. Un al doilea primer se leagă la molecula de cDNA, iar reverstranscriptaza va sintetiza o nouă catenă de ADN, rezultând o moleculă de ADN dublu catenar. ARN polimeraza recunoaște secvența promotor din catena ADN și inițiază transcripția (procesul de formare a ARN din ADN). Tot acest proces se repetă, formându-se milioane de ampliconi ARN în doar 60 de minute.

A treia etapă constă în detecția ampliconilor. După amplificare, va fi introdusă în reacție o sondă ADN marcată cu esteri de acridinium. Dacă ampliconul țintă este prezent, atunci va avea loc hibridizarea sondei și se va forma un complex stabil sondă – amplicon. Ulterior, se adaugă un reactiv de selecție care va elimina moleculele de acridinium nelegate. Următorul pas este hidroliza moleculelor de esteri de acridinium legate de complexele amplicon – sondă și producerea unui semnal luminos. In timpul etapei de detecție, lumina emisă de acești hibrizi este măsurată de un luminometru ca semnale de fotoni și raportată în RLU (relative light units).

Pentru fiecare din cele două ținte ARNr va fi utilizată câte o sondă ADN marcată cu esteri de acridium diferiți. Prin tehnologia DKA, diferențele între profilele cinetice ale sondelor CT și GC permit discriminarea semnalului detectat prin chemiluminescență. Rezultatele testului sunt stabilite cu ajutorul unui cut-off bazat pe valoarea totală RLU și tipul curbei cinetice detectate6.

Performanțele și avantajele testului APTIMA Combo 2

Caracteristicile de performanță ale testului APTIMA Combo 2 au fost stabilite în urma unui studiu muticentric desfășurat în America de Nord ce a inclus 2932 probe de urină și probe genitale recoltate pe tampon, de la persoane (1569 femei și 1363 bărbați) simptomatice și asimptomatice.

În cazul probelor recoltate pe tampon endocervical s-au raportat:

Pentru CT: 94.2% sensibilitate, 97.6% specificitate
Pentru GC: 99.2% sensibilitate, 99.6% specificitate

 iar în cazul utilizării probelor de urină la bărbați:

Pentru CT: 97.9% sensibilitate, 98.5% specificitate
Pentru GC: 98.5% sensibilitate, 99.6% specificitate6

Metoda TMA are cea mai înaltă sensibilitate dintre toate metodele bazate pe tehnologia NAAT, putând detecta cantități foarte mici de acizi nucleici în probă. Sensibilitatea testului APTIMA Combo 2 efectuat pe un număr mare de probe (1304 probe de urină și probe genitale recoltate pe tampon) s-a dovedit a fi net superioară sensibilității detecției prin culturi celulare sau a metodei DFA9. De asemenea, este singura tehnică în care s-a demonstrat că sensibilitatea testului efectuat din urină este echivalentă cu cea a testului efectuat din proba recoltată pe tampon10.

Metoda de identificare a CT/GC, patentată de compania GenProbe (SUA), permite într-o primă etapă capturarea moleculelor de ARN ribozomal cu ajutorul bilelor magnetice, ulterior realizându-se amplificarea acestora și detecția semnalului produs, folosindu-se tehnica DKA ce implică o cinetică diferită de emitere și respectiv de captare a luminii. Întreg procesul care are loc după introducerea tubului primar în analizor se realizează într-o manieră complet automată, evitând în acest fel posibilele contaminări sau erori introduse de utilizator. Datorită etapelor de spălare incluse la începutul procesului analitic, posibilitatea de a avea rezulte fals negative ca urmare a unor inhibitori sau factori de interferență (gonadotropina corionică umană, cristale, nitriți, hemoglobină) este practic exclusă. De asemenea, această metodă elimină reactivitatea încrucișată cu alte microorganisme ce ar putea fi prezente în tractul urogenital ca și posibilă pierdere a ADN-ului bacterian în timpul procesului de extracție, care poate afecta reacția de amplificare și conduce la rezultate fals-negative9.

Performanța testului APTIMA Combo 2 a fost verificată și pentru detecția tulpinilor mutante de Chlamydia trachomatis, rezultatele confirmând faptul că testul este capabil să identifice varianta suedeză CT care prezintă o deleție la nivelul plasmidei criptice și pe care unele teste comerciale nu o detectează11.

Toate aceste date confirmă acuratețea testului APTIMA Combo 2 și îl promovează ca pe un test de elită în diagnosticul molecular.

În laboratorul nostru, sunt utilizate ca tip de probe tamponul endocervical la femei și urina primul jet la bărbați. Așa cum s-a menționat mai sus, testarea probelor de urină prezintă o sensibilitate și specificitate foarte bune reprezentând o alternativă non-invazivă la analiza probelor uretrale6.

Recomandări pentru determinarea Chlamydia trachomatis – diagnosticul infecțiilor acute urogenitale, screening-ul infecției la persoanele cu risc crescut; screening-ul gravidelor în primul trimestru de sarcină (pentru gravidele ≤ 25 ani cât și pentru cele cu risc crescut de infecții CT și NG testarea va fi repetată și în trimestrul III; în cazul gravidelor la care s-a obținut un rezultat pozitiv în trimestrul I testarea va fi repetată după 3-6 luni)4;7.

Specimen recoltat – se vor recolta probe provenite din tractul urogenital: tampon endocervical pentru femei și urina primul jet pentru bărbați; pentru femei se vor utiliza tampoanele incluse în sistemele de recoltare furnizate de laborator (vezi figura 1).

Recoltarea probei endocervicale

Înainte de recoltarea propriu-zisa se va îndepărta mucusul în exces de la nivelul orificiul colului cu ajutorul tamponului cu tija albă inclus în kit (APTIMA CLEANING SWAB); se va introduce apoi celălalt tampon cu tija albastră (APTIMA COLLECTION SWAB) în canalul cervical, se va roti bland de 5 ori într-o singură direcție (10-30 secunde) după care se va retrage ușor, se va evita contactul cu mucoasa vaginală și se va introduce în tubul de transport; se va rupe tamponul în dreptul semnului, astfel că numai capătul tamponului va rămane în tubul de transport ce va fi închis etanș cu capacul. Tubul va fi etichetat corespunzător și trimis la laborator. Nu se va atinge capacul din folie de aluminiu al tubului.

Fiecare probă va fi ambalată separat în pungile speciale portocalii.

fig1chl

Fig. 1 Sistem de recoltare a probelor endocervicale

Recoltarea probei de urină

Înainte de recoltarea propriu-zisă pacientul nu trebuie să urineze timp de cel puțin 1 oră; apoi se recoltează într-un recipient de unică folosință prevăzut cu un capac etanș (de exemplu, paharul pentru urina din 24 ore furnizat de laborator) aproximativ 20-30 mL din primul jet de urină.

În decurs de 24 ore de la recoltare se vor transfera aproximativ 2 ml din probă de urină recoltată de pacient în tubul de transport din imaginea de mai jos. Pană atunci proba va fi menținută la 2-30ºC.

Transferul probei în tubul transport va fi efectuat la sediul laboratorului utilizand pipeta de plastic din kit. În cazul în care probele nu pot ajunge în laborator în decurs de 24 ore, colaboratorii Synevo vor solicita tuburi de transport în vederea transferării probelor în locațiile respective.

Pentru a se asigura un volum corect de urină nivelul lichidului trebuie să se situeze între cele două linii negre marcate cu săgeți pe eticheta tubului. Tubul va fi închis etanș și etichetat corespunzător. Pentru o bună omogenizare a urinei cu mediul stabilizator din tub se vor efectua 5 mișcări de inversiune a tubului, fără a se atinge capacul din folie de aluminiu al tubului.

Fiecare probă va fi ambalată separat în pungile speciale portocalii6.

fig2chl

Fig. 2 Sistem de transfer al probelor de urină

Stabilitate probă – 2 luni la temperaturi de 2-30ºC pentru probele endocervicale și pentru probele de urină stabilizate (transferate în tub)6.
Metodă – TMA (transcription mediated amplification); sunt folosite următoarele tipuri de controale: control pozitiv CT/control negativ GC și control pozitiv GC/control negativ CT6.

Limite de detecție

CT

Se raportează o sensibilitate analitică de 1 IFU/test (7.25 IFU/tampon și 5 IFU/mL urină). Cu toate acestea, în studii s-a constatat o pozitivitate de 100% și la diluții CT < 1 IFU/test.
IFU = unități de formare a incluziilor

NG

Se raportează o sensibilitate analitică de 50 celule/test (362 celule/tampon și 250 celule/mL urină)
Cu toate acestea, în studii s-a constatat o pozitivitate de 100% și la diluții GC < 50 celule/test6.

Valori de referință și raportarea rezultatelor

Chlamydia trachomatis (CT) ARNr nedetectabil
Neisseria gonorrhoeae (NG) ARNr nedetectabil
Rezultatele se raportează ca nedetectabil/pozitiv/echivoc. În cazul unui rezultat echivoc se retestează proba; dacă se obține tot un rezultat echivoc se recomandă repetarea recoltării probei.
Este posibil să se obțină și un rezultat invalid care indică o eroare în procesul analitic fiind necesară retestarea probei sau în unele cazuri, repetarea recoltării6.

Interpretarea rezultatelor, limite și interferențe

Un rezultat nedetectabil indică faptul că în proba testată nu este prezent ARNr pentru CT și/sau G; cu toate acestea nu este exclusă prezența unei infecții deoarece rata de detecție depinde de modul de recoltare a probei, cantitatea de ARN ribosomal din probă, absența inhibitorilor sau stadiul infecției.

Un rezultat pozitiv indică faptul că în proba testată este prezent ARNr pentru CT și/sau GC și constituie un indiciu puternic de infecție.

Valoarea predictivă pozitivă a testului este influențată însă de prevalența infecției într-o anumită populație sau grup. Astfel, în grupurile cu prevalență crescută a bolilor cu transmitere sexuală valoarea predictivă pozitivă este crescută. În schimb, în grupurile cu prevalență scăzută a acestor categorii de infecții, rezultatele pozitive trebuie atent interpretate în contextul clinic general al pacientului, luând în considerare și posibilitatea retestării prin alte metode (de exemplu, cultura pentru Neisseria gonorrheae).

Prezența mucusului în probele endocervicale nu interferă cu detecția CT și GC în testul APTIMA Combo 2, dar se recomandă înlăturarea excesului de mucus pentru a avea în probă o cantitate suficientă de celule endocervicale infectate cu CT. De asemenea prezența sângelui nu afectează performanța testului, decât dacă se găsește într-un procent mai mare de 10% (vol/vol) în probele endocervicale și mai mare de 30% (vol/vol) în probele de urină.

Pentru tampoanele endocervicale nu s-a pus în evidență interferența cu lubrifianți sau spermicide. De asemenea, pentru probele de urină nu s-au constatat interferențe cu prezența vitaminelor și mineralelor.

Performanța stabilită pentru probele de urină se bazează pe testarea primului jet de urină. Pentru alte tipuri de probe de urină performanța nu a fost evaluată.
Testul detecteaza și variantele de C. trachomatis lipsite de plasmide. Pentru GC nu s-au constatat reacții încrucișate cu speciile nepatogene de Neisseria prezente în orofaringe.

În general, testul nu se recomandă pentru aprecierea eficienței tratamentului antibiotic deoarece acizii nucleici din acești patogeni pot persista cel puțin 3 săptămâni după încheierea terapiei. După această perioadă de timp retestarea este utilă în cazul gravidelor, atunci când se suspectează o lipsă de complianță la tratament sau o reinfecție și în cazurile în care simptomatologia persistă6;12.

Bibliografie

1. Centers for Disease Control and Prevention. 2011. Sexually Transmitted Disease Surveillance 2010. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services.
2. Betty A. Forbes, Daniel S. Sahm, Alice S. Weissfeld – Obligate Intracellular and Nonculturabile Bacterial Agents. Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 12th ed., 2007, 510-524.
3. Richard A. McPetersen, Matthew R. Pincus. Chlamydial, Rickettsial, and Mycoplasmal infections. In Henry’ Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods- Sauders Elsevier 21-Ed 2007- pg 1002, 1003.
4. Centers for Disease Control and Prevention, “Sexually Transmitted Diseases Treatment Guidelines 2010,” MMWR Recomm Rep, 2010, vol. 59(RR12):1-116.
5. Bernard M. Karnath. Manifestations of Gonorrhea and Chlamydial Infections. In Hospital Physician May/June 2009. www.turner-white.com.
6. Laborator Synevo. Referințe specifice tehnologiei de lucru utilizate 2014. Ref Type: Catalog.
7. Johnson RE, Newhall WJ, Papp JR, et al, “Screening Tests to Detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae,” MMWR Recomm Rep, 2002, 51(RR15):1-38.
8. Specialty Laboratories. Chlamydia trachomatis & Neisseria gonorrhoeae for symptomatic and asymptomatic patients. www.specialtylabs.com. Ref Type: Internet Communication.
9. B. Boyadzhyan, T. Yashina, J. H. Yatabe, M. Patnaik, and C. S. Hill. Comparison of the APTIMA CT and GC Assays with the APTIMA Combo 2 Assay, the Abbott LCx Assay, and Direct Fluorescent-Antibody and Culture Assays for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. In Journal of Clinical Microbiology, July 2004, Vol. 42, No. 7, 3089–93.
10. Crotchfelt, K. A., B. Pare, C. Gaydos, and T. C. Quinn. Detection of Chlamydia trachomatis by the Gen-Probe AMPLIFIED Chlamydia Trachomatis assay (AMP CT) in urine specimens from men and women and endocervical specimens from women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36:391-394.
11. Møller JK, Pedersen LN, and Persson K. Comparison of Gen-Probe Transcription-Mediated Amplification, Abbott PCR, and Roche PCR Assays for Detection of Wild-Type and Mutant Plasmid Strains of Chlamydia trachomatis in Sweden. J Clin Microbiol. 2008 December; 46(12): 3892–3895.
12. Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories. Reference Laboratory Services for Health Care Organizations. Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by Nucleic Acid Amplification (GEN-PROBE). www.mayomedicallaboratories.com. 2014. Ref Type: Internet Communication.
< inapoi la lista

Pret 105.00 lei